Name: high-throughput, robust and highly time-flexible method for surface sterilization of arabidopsis seeds
Uploaded: 2021-10-04T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds at JoVE.com

מחקר זה מומן על ידי הפרובינציה האוטונומית של טרנטו באמצעות מימון ליבה של קבוצת Ecogenomics של פונדזיון א' מאק.

1. ריאגנטים והכנה לתקשורת
<ol><li>הכן 70% תמיסה אתנול: להוסיף 737 מ"ל של 95% אתנול טכני ל 263 מ"ל של מים מזוקקים. מערבבים היטב. הערה: הכן 70% פתרון אתנול על ספסל עבודה לא סטרילי. אזהרה: אתנול הוא דליק מאוד ועלול לגרום לגירוי חמור בעיניים. יש להרחיק מלהבות ומקורות חום. במקרה של מגע עם העיניים, יש לשטוף ב?...

<ol>
	<li>Somerville, C., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fortunate+choice:+The+history+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">A fortunate choice: The history of Arabidopsis as a model plant.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (11), 883-889 (2002).</li><li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).</li><li>Initiative, T. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+genome+sequence+of+the+flowering+plant+Arabidopsis+thaliana.">Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.</a> Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).</li><li>Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-DNA+as+an+insertional+mutagen+in+Arabidopsis.">T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 11 (12), 2283-2290 (1999).</li><li>Speulman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-component+enhancer-inhibitor+transposon+mutagenesis+system+for+functional+analysis+of+the+arabidopsis+genome.">A two-component enhancer-inhibitor transposon mutagenesis system for functional analysis of the arabidopsis genome.</a> Plant Cell. 11 (10), 1853-1866 (1999).</li><li>Jander, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethylmethanesulfonate+saturation+mutagenesis+in+Arabidopsis+to+determine+frequency+of+herbicide+resistance.">Ethylmethanesulfonate saturation mutagenesis in Arabidopsis to determine frequency of herbicide resistance.</a> Plant Physiology. 131 (1), 139-146 (2003).</li><li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. -. S., Niu, Q. -. W., Chua, N. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method.">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).</li><li>Togninalli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AraPheno+and+the+AraGWAS+catalog+2020:+A+major+database+update+including+RNA-Seq+and+knock-out+mutation+data+for+Arabidopsis+thaliana.">AraPheno and the AraGWAS catalog 2020: A major database update including RNA-Seq and knock-out mutation data for Arabidopsis thaliana.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 1063-1068 (2020).</li><li>Lan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtMAD:+Arabidopsis+thaliana+multi-omics+association+database.">AtMAD: Arabidopsis thaliana multi-omics association database.</a> Nucleic Acids Research. 49 (1), 1445-1451 (2021).</li><li>Xu, J., Trainotti, L., Li, M., Varotto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+isoprene+synthase+affects+ABA-and+drought-related+gene+expression+and+enhances+tolerance+to+abiotic+stress.">Overexpression of isoprene synthase affects ABA-and drought-related gene expression and enhances tolerance to abiotic stress.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-21 (2020).</li><li>Czarnecki, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+knock-down+of+six+non-family+genes+using+a+single+synthetic+RNAi+fragment+in+Arabidopsis+thaliana.">Simultaneous knock-down of six non-family genes using a single synthetic RNAi fragment in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 12 (1), 1-11 (2016).</li><li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-efficiency+genome+editing+in+arabidopsis+using+YAO+promoter-driven+CRISPR/Cas9+system.">high-efficiency genome editing in arabidopsis using YAO promoter-driven CRISPR/Cas9 system.</a> Molecular Plant. 8 (12), 1820-1823 (2015).</li><li>Liu, Y., Gao, Y., Gao, Y., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+of+floral+development+genes+in+Arabidopsis+with+CRISPR/Cas9+using+the+RNA+endoribonuclease+Csy4+processing+system.">Targeted deletion of floral development genes in Arabidopsis with CRISPR/Cas9 using the RNA endoribonuclease Csy4 processing system.</a> Horticulture Research. 6 (1), (2019).</li><li>Grefen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+and+in+vivo+interactions+of+the+Arabidopsis+thaliana+ethylene+receptor+family+members.">Subcellular localization and in vivo interactions of the Arabidopsis thaliana ethylene receptor family members.</a> Molecular Plant. 1 (2), 308-320 (2008).</li><li>Gazzani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+MIR168+paralogs+in+Brassicaceae.">Evolution of MIR168 paralogs in Brassicaceae.</a> BMC Evolutionary Biology. 9 (1), (2009).</li><li>Lee, S., Korban, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+Arabidopsis+thaliana+phytochelatin+synthase+(AtPCS1)+by+cadmium+during+early+stages+of+plant+development.">Transcriptional regulation of Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase (AtPCS1) by cadmium during early stages of plant development.</a> Planta. 215 (4), 689-693 (2002).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+FRET-FLIM+reveals+cell-type-specific+protein+interactions+in+Arabidopsis+roots.">In vivo FRET-FLIM reveals cell-type-specific protein interactions in Arabidopsis roots.</a> Nature. 548 (7665), 97-102 (2017).</li><li>Freire-Rios, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+DNA+elements+mediating+ARF+transcription+factor+binding+and+auxin-responsive+gene+expression+in+Arabidopsis.">Architecture of DNA elements mediating ARF transcription factor binding and auxin-responsive gene expression in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24557-24566 (2020).</li><li>Rivero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+arabidopsis+plants:+Growth,+preservation+of+seeds,+transformation,+and+genetic+crosses.">Handling arabidopsis plants: Growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses.</a> Methods in Molecular Biology. 1062, 3-25 (2014).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+and+salt+stress+tolerance+of+an+arabidopsis+glutathione+S-transferase+U17+knock-out+mutant+are+attributed+to+the+combined+effect+of+glutathione+and+abscisic+acid.">Drought and salt stress tolerance of an arabidopsis glutathione S-transferase U17 knock-out mutant are attributed to the combined effect of glutathione and abscisic acid.</a> Plant Physiology. 158 (1), 340-351 (2012).</li><li>Li, D. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+a+large+dataset+indicates+that+internal+transcribed+spacer+(ITS)+should+be+incorporated+into+the+core+barcode+for+seed+plants.">Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (49), 19641-19646 (2011).</li><li>Mathur, J., Koncz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+maintenance+of+cell+suspension+cultures.+Arabidopsis+Protocols.">Establishment and maintenance of cell suspension cultures. Arabidopsis Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 82, 27-30 (1998).</li><li>Li, M., Cappellin, L., Xu, J., Biasioli, F., Varotto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+in+planta+characterization+of+VOC+biosynthetic+genes+by+PTR-ToF-MS.">High-throughput screening for in planta characterization of VOC biosynthetic genes by PTR-ToF-MS.</a> Journal of Plant Research. 133 (1), 123-131 (2020).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+recapitulation+of+isoprene+synthase+evolution+from+ocimene+synthases.">In planta recapitulation of isoprene synthase evolution from ocimene synthases.</a> Molecular Biology and Evolution. 34 (10), 2583-2599 (2017).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+isoprene+emission+in+Arecaceae+(palms).">Evolution of isoprene emission in Arecaceae (palms).</a> Evolutionary Applications. 14, 902-914 (2020).</li><li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bio+assays+with+tobacco+tissue+cultures.">A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures.</a> Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).</li><li>Bent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+method.">Arabidopsis thaliana floral dip transformation method.</a> Methods in Molecular Biology. 343, 87-104 (2006).</li><li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana+root+microbiome.">Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome.</a> Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).</li><li>Tkacz, A., Cheema, J., Chandra, G., Grant, A., Poole, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+succession+of+the+rhizosphere+microbiota+depends+upon+plant+type+and+soil+composition.">Stability and succession of the rhizosphere microbiota depends upon plant type and soil composition.</a> ISME Journal. 9 (11), 2349-2359 (2015).</li><li>Singh, N., Gaddam, S. R., Singh, D., Trivedi, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+arsenic+stress+response+by+ethylene+biosynthesis+and+signaling+in+Arabidopsis+thaliana.">Regulation of arsenic stress response by ethylene biosynthesis and signaling in Arabidopsis thaliana.</a> Environmental and Experimental Botany. 185, 104408 (2021).</li><li>Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+method+for+high-throughput+sterilization+of+Arabidopsis+seeds.">Standardized method for high-throughput sterilization of Arabidopsis seeds.</a> Journal of Visualized Experiments: JOVE. (128), e56587 (2017).</li><li>Acemi, A., &#214;zen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+in+vitro+asymbiotic+seed+germination+protocol+for+Serapias+vomeracea.">Optimization of in vitro asymbiotic seed germination protocol for Serapias vomeracea.</a> The EuroBiotech Journal. 3 (3), 143-151 (2019).</li></ol>

עיקור זרעים הוא הצעד הבסיסי ללימודים פונקציונליים בערבידופסיס. למרות שזה מתבצע לעתים קרובות למטרות רבות ושונות, מחקרים מוגבלים על עיקור משטח זרעים תפוקה גבוהה Arabidopsis זמינים.
עד כה, אחת השיטות עם התפוקה הגבוהה ביותר היא באמצעות גז כלור שנוצר על ידי ערבוב אקונומיקה עם HCl מרוכ?...

Arabidopsis הוא מין צמח דיפלואיד השייך למשפחת Brassicaceae. מחזור החיים הקצר יחסית שלה (חודשיים לדור בתנאי גידול ארוכים), גודל צמח קטן, והאבקה עצמית עם ייצור של מאות זרעים לצמח הפכו אותו למין הראשון של מודל הצמח הבסיסי1,2. בנוסף, הגנום שלה היהברצףמלא 3 , כלי גנטיקה הפוכה נרחבת (T-DNA רווי, טרנספוסון, ואוכלוסיות מוטגניות כימית) זמינים4,5,6, ו יעיל אגרובקטריום- טרנספורמציה מתווכת מבוססת היטב כדי להשיג קווים מהונדסים מספיק לעבודה במורד הזרם7 . לכן, במהלך שני העשורים האחרונים, התקדמות גדולה הושגה באמצעות Arabidopsis כמין מודל לנתח היבטים מגוונים של ביולוגיה צמחית ברמה המולקולרית, כולל וריאציה טבעית, גנטית ופנוטיפית8,9.
כדי לאפיין באופן פונקציונלי גנים של עניין Arabidopsis, עיקור פני זרעים כדי לחסל מזהמים פטרייתיים וחיידקיים הוא הצעד התקדים עבור פרוטוקולים רבים במורד הזרם הדורשים תרביות אקסנית. טרנספורמציה גנטית עבור ביטוי יתר10, נוק-אאוט (RNA-I11)או נוק-אאוט (עריכת גנום12,13) של תפקוד הגנים, לוקליזציה תת תאית14, פעילות מקדם15,16, חלבון חלבון17 וחלבון-DNA אינטראקציה18, כדי לצטט רק את היישומים הנפוצים ביותר, כל דורש צעד עיקור פני השטח זרע. לכן, למרות הפשטות היחסית שלה, עיקור משטח הזרע ממלא תפקיד בסיסי ניתוחים פונקציונליים רבים.
עד כה פותחו שתי קטגוריות עיקריות של שיטות עיקור פני השטח של הזרעים המבוססות על עיקור גז או על עיקור שלב נוזלי19. בעוד התפוקה של עיקור משטח זרע גז היא בינונית עד גבוהה, באמצעות גז כלור ריאגנט מסוכן כסוכן עיקור פני השטח עיכב את היישום הרחב שלה. שיטות המבוססות על עיקור שלב נוזלי, להיפך, מסתמכות על כימיקלים מתונים יותר כמו אתנול ופתרונות אקונומיקה לעיקור פני השטח, והם נמצאים בשימוש נרחב יותר למרות שיש להם תפוקה נמוכה יותר מטבעה מאשר חיטוי כלור. באופן כללי, שתי שיטות שונות המשתמשות ריאגנטים נוזליים משמשים בדרך כלל. שיטה אחת בשימוש נרחב מבוססת על כביסה עם אתנול ואקונומיקה בריכוזים שונים למשך זמן שונה20,21. שיטה נוספת מבוססת על יישום אקונומיקה רק21,22. שתי השיטות מיושמות בעיקר עבור עיקור משטח זרע בקנה מידה קטן. עם זאת, בניסויים רבים, יש צורך לסנן קווים מהונדסים Arabidopsis רבים הנגזרים טרנספורמציה אחת15,23 או מסך במקביל קווים מהונדסים רבים שנוצרו מתמורות שונות24,25. למיטב ידיעתנו, לא פורסמה שיטה מבוססת נוזל לעיקור משטח זרעים בעל תפוקה גבוהה, המהווה, אם כי לא מוכר, צוואר בקבוק חשוב לגישות גנומיקה פונקציונליות. לכן, פיתוח שיטות בטוחות, חזקות ובעלות תפוקה גבוהה לעיקור פני השטח של הזרעים הוא צעד הכרחי וקריטי לקראת הצלחת האפיון התפקודי של גנים רבים בבת אחת.
לכך, במחקר הנוכחי, מוצגת שיטה משופרת לעיקור פני השטח של זרעי Arabidopsis. שיטה זו בטוחה, בעלות נמוכה, חזקה מאוד, ותפוקה גבוהה, ומאפשרת טיפול 96 קווים עצמאיים בתוך שעה אחת מתחילת עיקור משטח הזרעים עד סוף זריעת הזרעים בצלחות פטרי. השיטה הדגימה מסתמכת על מכשור מעבדה בסיסי וזמין כמו משאבת ואקום, כלי זכוכית מתכלים וכלי פלסטיק. שיטה משופרת זו מספקת לקהילה המדעית גישה בטוחה, פשוטה ובמחיר סביר לייעול עיקור פני השטח של הזרעים עם תפוקה המתאימה לגישות גנומיקה פונקציונליות מודרניות בערבידופסיס ובמיני צמחים אחרים שאינם מודל.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aquarium valve</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B074CYC5SD</td>
			<td>Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis Col-0 wild-type seeds</td>
			<td>Nottingham Arabidopsis Stock Center</td>
			<td>N1093</td>
			<td>Wild type seeds (sensitive to kanamycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583&#8211;2599). Available on request from the authors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628188</td>
			<td>Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog medium including vitamins</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0222</td>
			<td>Standard medium for plant sterile culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller</td>
			<td>Brand</td>
			<td>26300</td>
			<td>Used to operate the serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tube 1</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9591.1</td>
			<td>Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tube 2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9587.1</td>
			<td>Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve&#160; (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap with connectors</td>
			<td>Roth</td>
			<td>PY86.1</td>
			<td>2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Brand</td>
			<td>27823</td>
			<td>Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shakeret al.</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technical ethanol</td>
			<td>ITW Reagents (Nova Chimica Srl)</td>
			<td>212800</td>
			<td>Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>655205</td>
			<td>Non-ionic detergent acting as surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal tubing connectors</td>
			<td>Roth</td>
			<td>Y523.1</td>
			<td>Can be used to improve/simplify tubing connections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>WP6222050</td>
			<td>Used for making the suction device</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput, robust and highly time-flexible method for surface sterilization of arabidopsis seeds

Arabidopsis הוא ללא ספק מינים מודל הצמח בשימוש הנפוץ ביותר עבור מחקרים פונקציונליים. עיקור פני השטח של זרעי Arabidopsis הוא צעד בסיסי הנדרש לקראת מטרה זו. לכן, חשוב ביותר להקים שיטות עיקור פני השטח של זרעי Arabidopsis בעלי תפוקה גבוהה כדי להתמודד עם עשרות עד מאות דגימות (למשל, קווים מהונדסים, אקולוגיים או מוטציות) בבת אחת. שיטת עיקור משטח זרע המבוססת על חיסול יעיל של נוזל בצינורות עם מכשיר יניקה תוצרת בית שנבנה ממשאבת ואקום נפוצה מוצגת במחקר זה. על ידי צמצום דרמטי של זמן מעשי אינטנסיבי בעבודה בשיטה זו טיפול בכמה מאות דגימות ביום אחד אפשרי עם מעט מאמץ. ניתוחי קורס זמן מסדרה הצביעו עוד יותר על טווח זמן גמיש מאוד של עיקור פני השטח על ידי שמירה על שיעורי נביטה גבוהים. שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות לעיקור פני השטח של סוגים אחרים של זרעים קטנים עם התאמה אישית פשוטה של מכשיר היניקה בהתאם לגודל הזרע, ואת המהירות הרצויה לחסל את הנוזל.

על מנת להעריך את הזמן הנדרש עבור כל הליך עיקור הזרעים, חושבו הפרשי השעות לטיפול בנוזלים ב-96 דגימות בפרוטוקול הנוכחי בהשוואה לשיטות ההצינורה המסורתיות. התוצאה מציינת כי הפרוטוקול הנוכחי חוסך זמן, וחותך את זמן הטיפול הנוזלי לרבעון מזה עם הפרוטוקולים המסורתיים (טבלה 1). הטבלה מדגישה ...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds at JoVE.com

High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds

פרוטוקול תפוקה גבוהה לעיקור פני השטח של זרעי Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) מסופק, אופטימיזציה של שלבי הטיפול בנוזל עם מכשיר יניקה פשוט שנבנה עם משאבת ואקום. מאות דגימות זרעים יכולות להיות מעוקרות על פני השטח ביום אחד.

שיטה חזקה וגמישה מאוד לעיקור פני השטח של זרעי ערבידופסיס

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental ...

פרוטוקול זה לשפר את עיקור פני השטח זרעים, צעד בסיסי בגנומיקה פונקציונלית של מינים המודל Arabidopsisthaliana. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם קלות ותפוקה גבוהה, המאפשר עיבוד של מאות דגימות ליום. עם כמה שינויים פשוטים, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מינים רבים אחרים מודל ולא מודל צמחים.עבור משתמשים בפעם הראשונה, אנא שימו לב לטמפרטורת המדיום ומהירות המרכז מכיוון ששניהם קריטיים להישרדות הזרעים. כדי להתחיל, להכין 70% אתנול על ידי הוספת 95% אתנול טכני למים מזוקקים וערבוב ביסודיות. לאחר מכן, להכין פתרון אקונומיקה 5% על ידי הוספת חמישה מיליליטר של אקונומיקה ביתית ל 95 מיליליטר של מים מזוקקים סטריליים.לאחר מכן, מוסיפים כמה טיפות של חומר ניקוי לא-יוני לתמיסת אקונומיקה, ומערבבים היטב. לאחר מכן, להכין חצי כוח Murashige ו Skoog בינוני על ידי הוספת 2.2 גרם של אבקה בינונית MS כולל ויטמינים ו 10 גרם של סוכרוז ב 800 מיליליטר של מים מזוקקים. התאימו את רמת ה-pH של המדיום ל-5.7 בעזרת אשלגן הידרוקסיד טוחן אחד, ואז העלו את הנפח לליטר אחד באמצעות מים מזוקקים.Aliquot 500 מיליליטר של המדיום לתוך בקבוק ליטר אחד, ולהוסיף ארבעה גרם של אגר כדי להכין מדיום מוצק. לאחר autoclaving, לאפשר למדיום להתקרר עד 50 עד 53 מעלות צלזיוס באמבט מים. ואז לשפוך אותו לתוך צלחות פטרי מתחת מכסה המנוע זרימה למינאר.כדי להכין מדיום סלקטיבי, מוסיפים kanamycin למדיום, ויוצקים אותו לתוך מנות פטרי כפי שהוכח קודם לכן. כדי להגדיר את השאיפה, חבר את זרם משאבת ואקום לקצה אחד של צינור פוליאתילן בגודל מתאים. לאחר מכן חבר את הקצה השני של הצינור לשקע של המכסה הדו-כיווני של בקבוק decantation.עוטפים את צומת הצינורות בחוזקה עם סרט איטום כדי להבטיח חיבור אטום. לאחר מכן, חבר צינור פוליאתילן שני לפרצון מכסה הבורג על בקבוק decantation. ואז לחבר את הצד השני של הצינור לשקע של שסתום אקווריום מצויד צינור פוליאתילן דק.במידת הצורך, לעטוף את הצומת עם סרט האיטום כדי לחסל דליפת אוויר. לאחר תיוג שתי קבוצות של 48 צינורות microcentrifuge 48 1.5 מיליליטר עם מספרים מתקדמים, להוסיף 100 עד 200 זרעי Arabidopsis לכל אחד 96 צינורות microcentrifuge סטרילי, בערך אחד עד שני מילימטרים מעל החלק התחתון של הקצה החרוט של הצינור. לאחר מכן, באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית 10 מיליליטר, להוסיף סביב מיליליטר אחד של 70% אתנול לתוך כל צינור, בזהירות לסגור את המכסים.לנער את הצינורות בתדר תנודה של שמונה הרץ במשך שלוש דקות בשייקר. לאחר מכן להסיר את המתאמים מן שייקר ולהעביר אותם לתוך הסל של microcentrifuge ספסל עבור ספינינג את הזרעים באמצעות פונקציית הדופק. לאחר העברת הצינורות למדף, פתח את כל הצינורות מתחת למכסה המנוע.אין לגעת בחלק של המכסים המתאימים לצינורות כדי למנוע זיהום. לאחר מכן, מתחת למכסה המנוע של זרימת למינאר, התאימו קצה צהוב סטרילי של 200 מיקרוליטר למפרצון שסתום האקווריום של השאיפה תוצרת בית, והדליקו את המשאבה. הכנס את הקצה ממש מעל רמת הזרעים כדי למנוע נגיעה בזרעים בעת מציצת הנוזל.לאחר מכן, באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית 10 מיליליטר, aliquot אחד מיליליטר של 5% פתרון אקונומיקה לתוך כל צינור. סגור את המכסים לפני הנחת הצינורות בחזרה לתוך מתאמי שייקר, ולאחר מכן לנער את הצינורות כפי שהוכח בעבר. לאחר ספינינג את הזרעים באמצעות פונקציית הדופק של צנטריפוגה benchtop, להתאים קצה צהוב סטרילי חדש 200 מיקרוליטר על שסתום האקווריום, ולהדליק את המשאבה.הכנס את הקצה מעל רמת הזרעים כדי למנוע נגיעה בזרעים בעת מציצת תמיסה אקונומיקה. לאחר מכן, באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית 10 מיליליטר, aliquot אחד מיליליטר של מים מעוקרים לתוך כל צינור. לאחר התאמת קצה צהוב סטרילי חדש 200 מיקרוליטר על שסתום האקווריום, להפעיל את המשאבה.הכנס את הקצה ממש מעל רמת הזרעים כדי למנוע נגיעה בזרעים בעת מציצת המים. לבסוף, aliquot 500 microliters של מים מעוקרים לתוך כל צינור, ולסגור את כל המכסים במכסה המנוע זרימה למינאר. הזרעים מוכנים כעת לזרע.במידת הצורך, לשמור על הצינורות בטמפרטורת החדר עד כמה שעות או בארבע מעלות צלזיוס לילה. באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד, להעביר את הזרעים עם 300 עד 400 microliters של מים סטריליים לתוך צלחת פטרי. לאחר העברת 10 צינורות, לשפוך 1.5 עד שני מיליליטר של מומס חצי כוח Murashige ו Skoog בינוני ללא אנטיביוטיקה לתוך כל צלחת.מערבבים במהירות את הצלחת כדי להפיץ את הזרעים, ומדביקים את הצלחות משני הצדדים. עוטפים את הצלחות בנייר פלסטיק או אלומיניום, ומניחים אותן במקרר במשך שלושה ימים בחושך כדי לקבל נביטה אחידה. ניתוחי נביטה שבוצעו בימים שניים, שלושה, ארבעה ושבע הצביעו על הבדלים משמעותיים בין 10 ל -40 דקות של זמן עיקור עם 70%אתנול.עם זאת, כאשר זמן העיקור עלה על 40 דקות, שיעורי הנביטה ירדו. בהתאמה, שיעורי הופעת קוטילדון ירוק גם ירד. בהתבסס על המחקר, שלוש דקות עבור 70%אתנול ושלוש דקות עבור 5%אקונומיקה נבחרו כזמן המינימלי לחיטוי הזרעים.כדי להדגים כי הזרעים ששימשו במקור היו מזוהמים עם מיקרואורגניזמים, זרעים לא סטריליים נזרעו ישירות על הצלחות. בהשוואה לזרעים סטריליים, זרעים לא סטריליים הראו מראה פטרייתי לאחר יומיים, אשר התפשטו על כל הצלחות לאחר נביטה של שבעה ימים. בדיקת זיהום צולבת שבוצעה באמצעות טיפ פיפטה סטרילי יחיד לעיבוד דגימות זרעים שונות הראתה כי לא נצפו קוטילדון ירוק בזרעי הגנוטיפ של קולומביה-0 שנזרעו בצלחות עם קנאמיצין.במקביל, בקולומביה-0 זרעים נזרעו בצלחות ללא קנאמיצין, כל הקוטילדון הופיע ירוק לאחר הנביטה. תוצאות אלה מצביעות על כך שאין נשיאה של זיהום בין דגימות למרות שימוש בקצה פיפטה יחיד כדי להסיר את הפתרון הסטרילי. הליך זה הוא הבסיס לשיטות גנומיקה פונקציונליות רבות אחרות כגון ביטוי יתר של גנים, עריכת גנום, לוקליזציה תת-תאית, פעילות מקדם, ואינטראקציות חלבון-חלבון-DNA.

Research

JoVE Journal

Biology

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

שיטת תפוקה גבוהה עבור cryopreservation זרע דג הזברה במבחנה הפריה

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice יתר: שיטה גידול ארבידופסיס צמחים עגבניות ב 96-פלטות היטב genotyping תפוקה גבוהה

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

שיטת תפוקה גבוהה למדידה של קצב סינון הגלומרולרי בעכברים בהכרה

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

בידוד יעיל ומהיר של עוברים משלבים מוקדמים<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; זרעים

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

קשירת יעילה ביותר של RNA קטן מולקולות לMicroRNA Quantitation על ידי רצף תפוקה גבוהה

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

שחזור של לבבות למבוגרים דג הזברה עבור יישומי תפוקה גבוהה

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...