Name: high-throughput, robust and highly time-flexible method for surface sterilization of arabidopsis seeds
Uploaded: 2021-10-04T14:15:00
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この研究は、フォンダツィオーネ・E・マッハのエコゲノミクス・グループのコア・ファンドを通じてトレント自治州から資金提供を受けた。

1. 試薬および媒体調製
<ol><li>70%エタノール溶液を調製:蒸留水263mLに95%のテクニカルエタノールの737 mLを加えます。よく混ぜます。 注:無菌の作業台に70%エタノール溶液を準備してください。 注意:エタノールは非常に可燃性であり、目に深刻な刺激を引き起こす可能性があります。炎や熱源から遠ざけてください。目に触れた場合は、豊富な水ですすいでください。</li>
	<li>5%漂白液を調...

<ol>
	<li>Somerville, C., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fortunate+choice:+The+history+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">A fortunate choice: The history of Arabidopsis as a model plant.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (11), 883-889 (2002).</li><li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).</li><li>Initiative, T. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+genome+sequence+of+the+flowering+plant+Arabidopsis+thaliana.">Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.</a> Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).</li><li>Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-DNA+as+an+insertional+mutagen+in+Arabidopsis.">T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 11 (12), 2283-2290 (1999).</li><li>Speulman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-component+enhancer-inhibitor+transposon+mutagenesis+system+for+functional+analysis+of+the+arabidopsis+genome.">A two-component enhancer-inhibitor transposon mutagenesis system for functional analysis of the arabidopsis genome.</a> Plant Cell. 11 (10), 1853-1866 (1999).</li><li>Jander, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethylmethanesulfonate+saturation+mutagenesis+in+Arabidopsis+to+determine+frequency+of+herbicide+resistance.">Ethylmethanesulfonate saturation mutagenesis in Arabidopsis to determine frequency of herbicide resistance.</a> Plant Physiology. 131 (1), 139-146 (2003).</li><li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. -. S., Niu, Q. -. W., Chua, N. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method.">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).</li><li>Togninalli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AraPheno+and+the+AraGWAS+catalog+2020:+A+major+database+update+including+RNA-Seq+and+knock-out+mutation+data+for+Arabidopsis+thaliana.">AraPheno and the AraGWAS catalog 2020: A major database update including RNA-Seq and knock-out mutation data for Arabidopsis thaliana.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 1063-1068 (2020).</li><li>Lan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtMAD:+Arabidopsis+thaliana+multi-omics+association+database.">AtMAD: Arabidopsis thaliana multi-omics association database.</a> Nucleic Acids Research. 49 (1), 1445-1451 (2021).</li><li>Xu, J., Trainotti, L., Li, M., Varotto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+isoprene+synthase+affects+ABA-and+drought-related+gene+expression+and+enhances+tolerance+to+abiotic+stress.">Overexpression of isoprene synthase affects ABA-and drought-related gene expression and enhances tolerance to abiotic stress.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-21 (2020).</li><li>Czarnecki, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+knock-down+of+six+non-family+genes+using+a+single+synthetic+RNAi+fragment+in+Arabidopsis+thaliana.">Simultaneous knock-down of six non-family genes using a single synthetic RNAi fragment in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 12 (1), 1-11 (2016).</li><li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-efficiency+genome+editing+in+arabidopsis+using+YAO+promoter-driven+CRISPR/Cas9+system.">high-efficiency genome editing in arabidopsis using YAO promoter-driven CRISPR/Cas9 system.</a> Molecular Plant. 8 (12), 1820-1823 (2015).</li><li>Liu, Y., Gao, Y., Gao, Y., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+of+floral+development+genes+in+Arabidopsis+with+CRISPR/Cas9+using+the+RNA+endoribonuclease+Csy4+processing+system.">Targeted deletion of floral development genes in Arabidopsis with CRISPR/Cas9 using the RNA endoribonuclease Csy4 processing system.</a> Horticulture Research. 6 (1), (2019).</li><li>Grefen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+and+in+vivo+interactions+of+the+Arabidopsis+thaliana+ethylene+receptor+family+members.">Subcellular localization and in vivo interactions of the Arabidopsis thaliana ethylene receptor family members.</a> Molecular Plant. 1 (2), 308-320 (2008).</li><li>Gazzani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+MIR168+paralogs+in+Brassicaceae.">Evolution of MIR168 paralogs in Brassicaceae.</a> BMC Evolutionary Biology. 9 (1), (2009).</li><li>Lee, S., Korban, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+Arabidopsis+thaliana+phytochelatin+synthase+(AtPCS1)+by+cadmium+during+early+stages+of+plant+development.">Transcriptional regulation of Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase (AtPCS1) by cadmium during early stages of plant development.</a> Planta. 215 (4), 689-693 (2002).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+FRET-FLIM+reveals+cell-type-specific+protein+interactions+in+Arabidopsis+roots.">In vivo FRET-FLIM reveals cell-type-specific protein interactions in Arabidopsis roots.</a> Nature. 548 (7665), 97-102 (2017).</li><li>Freire-Rios, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+DNA+elements+mediating+ARF+transcription+factor+binding+and+auxin-responsive+gene+expression+in+Arabidopsis.">Architecture of DNA elements mediating ARF transcription factor binding and auxin-responsive gene expression in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24557-24566 (2020).</li><li>Rivero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+arabidopsis+plants:+Growth,+preservation+of+seeds,+transformation,+and+genetic+crosses.">Handling arabidopsis plants: Growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses.</a> Methods in Molecular Biology. 1062, 3-25 (2014).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+and+salt+stress+tolerance+of+an+arabidopsis+glutathione+S-transferase+U17+knock-out+mutant+are+attributed+to+the+combined+effect+of+glutathione+and+abscisic+acid.">Drought and salt stress tolerance of an arabidopsis glutathione S-transferase U17 knock-out mutant are attributed to the combined effect of glutathione and abscisic acid.</a> Plant Physiology. 158 (1), 340-351 (2012).</li><li>Li, D. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+a+large+dataset+indicates+that+internal+transcribed+spacer+(ITS)+should+be+incorporated+into+the+core+barcode+for+seed+plants.">Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (49), 19641-19646 (2011).</li><li>Mathur, J., Koncz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+maintenance+of+cell+suspension+cultures.+Arabidopsis+Protocols.">Establishment and maintenance of cell suspension cultures. Arabidopsis Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 82, 27-30 (1998).</li><li>Li, M., Cappellin, L., Xu, J., Biasioli, F., Varotto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+in+planta+characterization+of+VOC+biosynthetic+genes+by+PTR-ToF-MS.">High-throughput screening for in planta characterization of VOC biosynthetic genes by PTR-ToF-MS.</a> Journal of Plant Research. 133 (1), 123-131 (2020).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+recapitulation+of+isoprene+synthase+evolution+from+ocimene+synthases.">In planta recapitulation of isoprene synthase evolution from ocimene synthases.</a> Molecular Biology and Evolution. 34 (10), 2583-2599 (2017).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+isoprene+emission+in+Arecaceae+(palms).">Evolution of isoprene emission in Arecaceae (palms).</a> Evolutionary Applications. 14, 902-914 (2020).</li><li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bio+assays+with+tobacco+tissue+cultures.">A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures.</a> Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).</li><li>Bent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+method.">Arabidopsis thaliana floral dip transformation method.</a> Methods in Molecular Biology. 343, 87-104 (2006).</li><li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana+root+microbiome.">Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome.</a> Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).</li><li>Tkacz, A., Cheema, J., Chandra, G., Grant, A., Poole, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+succession+of+the+rhizosphere+microbiota+depends+upon+plant+type+and+soil+composition.">Stability and succession of the rhizosphere microbiota depends upon plant type and soil composition.</a> ISME Journal. 9 (11), 2349-2359 (2015).</li><li>Singh, N., Gaddam, S. R., Singh, D., Trivedi, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+arsenic+stress+response+by+ethylene+biosynthesis+and+signaling+in+Arabidopsis+thaliana.">Regulation of arsenic stress response by ethylene biosynthesis and signaling in Arabidopsis thaliana.</a> Environmental and Experimental Botany. 185, 104408 (2021).</li><li>Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+method+for+high-throughput+sterilization+of+Arabidopsis+seeds.">Standardized method for high-throughput sterilization of Arabidopsis seeds.</a> Journal of Visualized Experiments: JOVE. (128), e56587 (2017).</li><li>Acemi, A., &#214;zen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+in+vitro+asymbiotic+seed+germination+protocol+for+Serapias+vomeracea.">Optimization of in vitro asymbiotic seed germination protocol for Serapias vomeracea.</a> The EuroBiotech Journal. 3 (3), 143-151 (2019).</li></ol>

種子の滅菌は、シロイヌナズナの機能研究の基本的なステップです。多くの異なる目的のために頻繁に行われますが、シロイヌズナでのハイスループット種子表面滅菌に関する限定的な研究が可能です。
これまで、最も高いスループットを有する方法の1つは、漂白剤と濃縮HClを混合して発生した塩素ガスを用いることで行なわれた。この方法は、限られた実務時間を必?...

シロイヌナズナは、ブラッシカ科に属する二分植物種です。その比較的短いライフサイクル(長い日の成長条件下で一世代あたり2ヶ月)、小さな植物のサイズ、および植物ごとに何百もの種子の生産と自己受粉は、それを最初の基本的な植物モデル種1、2にしました。さらに、そのゲノムは完全に配列3であり、広範な逆遺伝学ツール(飽和T-DNA、トランスポゾン、および化学的変異体化された集団)が利用可能である4、5、6、および効果的なアグロバクテリウム媒介変換は、さらに下流作業のための十分なトランスジェニックラインを得るために十分確立されている7 .したがって、過去20年間に、自然、遺伝的、表現型のバリエーション8、9を含む分子レベルで植物生物学の多様な側面を解剖するためのモデル種としてシロイヌナズナシスを使用して大きな進歩が達成されました。
シロイヌナズナの目的の遺伝子を機能的に特徴付けるためには、種子表面滅菌は、無菌培養を必要とする多くの下流プロトコルの前提条件となる真菌および細菌汚染物質を排除する。過剰発現10に対する遺伝的形質転換は、ノックダウン(RNA-I11)またはノックアウト(ゲノム編集12、13)の遺伝子機能、細胞内局在化14、プロモーター活性15、16、タンパク質タンパク質17およびタンパク質-DNA相互作用18の、最も一般的な用途のみを引用し、すべて種子表面滅菌工程を必要とする。したがって、その相対的な単純さにもかかわらず、種子表面滅菌は、多くの機能解析において基本的な役割を果たす。
これまで、2つの主要なカテゴリーの種子表面滅菌方法が、気相滅菌法または液相滅菌法19に基づいて開発されてきた。ガス相シード表面滅菌のスループットは中~高であるが、有害試薬塩素ガスを表面殺菌剤として用いることは、その広い用途を妨げている。逆に液相殺菌に基づく方法は、表面殺菌のためにエタノールや漂白剤溶液のような穏やかな化学物質に依存しており、塩素燻蒸よりも本質的に低い効率を有するにもかかわらず、より広く使用されています。一般に、液体試薬を用いる2つの異なる方法が一般的に使用されている。1つの主に使用される方法は、時間20、21の異なる期間の異なる濃度でエタノールと漂白剤で洗浄に基づいている。別の方法は、漂白剤のみの21、22の適用に基づいています。どちらの方法も主に小規模な種子表面滅菌に適用されます。しかしながら、多くの実験において、1つの変換15、23、または画面から得られる多くのシロイヌナズナのトランスジェニックラインを、異なる変換24,25から生成される多くのトランスジェニックラインを並行してスクリーニングする必要がある。我々の知る限りでは、高スループット種子表面滅菌のための液体ベースの方法は公開されておらず、これはほとんど認識されていないが、機能的ゲノミクスのアプローチのための重要なボトルネックである。したがって、種子表面滅菌のための安全で堅牢で高スループットな方法を開発することは、一度に多くの遺伝子の機能的特性評価の成功に向けて必要かつ重要なステップです。
この目的のために、現在の研究では、シロイヌナズナの種子の表面滅菌のための改善された方法が提示される。この方法は安全で、低コストで、非常に堅牢で、高スループットで、種表面滅菌の初めからペトリ皿の種子播種の終わりまで1時間以内に96本の独立したラインを取り扱うことを可能にします。この方法は、真空ポンプ、消耗品、プラスチック製品などの広く利用可能な基本的な実験室機器に依存しています。この改良された方法は、シロイヌナプシスおよび他の非モデル植物種における近代的な機能的ゲノミクスアプローチに十分なスループットを備えた種子表面滅菌を合理化するための安全でシンプルで手頃な価格のアプローチを科学界に提供する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aquarium valve</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B074CYC5SD</td>
			<td>Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis Col-0 wild-type seeds</td>
			<td>Nottingham Arabidopsis Stock Center</td>
			<td>N1093</td>
			<td>Wild type seeds (sensitive to kanamycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583&#8211;2599). Available on request from the authors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628188</td>
			<td>Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog medium including vitamins</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0222</td>
			<td>Standard medium for plant sterile culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller</td>
			<td>Brand</td>
			<td>26300</td>
			<td>Used to operate the serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tube 1</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9591.1</td>
			<td>Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tube 2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9587.1</td>
			<td>Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve&#160; (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap with connectors</td>
			<td>Roth</td>
			<td>PY86.1</td>
			<td>2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Brand</td>
			<td>27823</td>
			<td>Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shakeret al.</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technical ethanol</td>
			<td>ITW Reagents (Nova Chimica Srl)</td>
			<td>212800</td>
			<td>Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>655205</td>
			<td>Non-ionic detergent acting as surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal tubing connectors</td>
			<td>Roth</td>
			<td>Y523.1</td>
			<td>Can be used to improve/simplify tubing connections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>WP6222050</td>
			<td>Used for making the suction device</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput, robust and highly time-flexible method for surface sterilization of arabidopsis seeds

シロイヌナズナは、機能研究に最も広く使用されている植物モデル種です。シロイヌナズナの種子の表面滅菌は、この目的に向かって必要とされる基本的なステップです。したがって、数十~数百個のサンプル(トランスジェニックライン、エコタイプ、または変異体)を一度に処理するハイスループットシロイヌナズナシス種子表面滅菌法を確立することが最も重要です。一般的な真空ポンプから構築された自家製の吸引装置を用いたチューブ内の液体の効率的な除去に基づく種子表面滅菌法を本研究で紹介する。この方法で、1日に数百個のサンプルを処理することで、労働集約的なハンズオン時間を劇的に短縮することで、少しの労力で可能になります。シリーズタイムコース分析は、高い発芽率を維持することにより、表面滅菌の非常に柔軟な時間範囲をさらに示しました。この方法は、種子サイズに応じて吸引装置の簡単なカスタマイズ、および液体を排除するために望まれる速度で、他の種類の小さな種子の表面滅菌に容易に適応することができる。

種子滅菌手順全体に要する時間を評価するために、現在のプロトコルにおける液体処理96サンプルの時間差を計算し、従来のピペット法と比較した。この結果は、現在のプロトコルが時間を節約し、従来のプロトコルで液体処理時間をその 4 分の 1 に短縮することを示しています (表 1)。この表はさらに、現在のプロトコルの液体除去時間は、従来の方法よりも多くの時間を節約?...

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High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds

シロイヌズナ(シロイヌズナ)種子の表面滅菌のためのハイスループットプロトコルが提供され、真空ポンプで構成された簡単な吸引装置で液体処理ステップを最適化する。何百もの種子サンプルを1日で表面滅菌することができます。

シロイヌナズナ種子の表面滅菌のための高スループット、堅牢で高い時間融性の高い方法

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental ...

このプロトコルは、モデル種シロイヌズナの機能的ゲノミクスにおける種子表面滅菌を改善する。この技術の主な利点は、1 日あたり数百サンプルの処理を可能にする、容易さと高スループットです。いくつかの簡単な変更を加えれば、この方法は他の多くのモデルや非モデルの植物種に適用できます。初めてのユーザーのために、彼らは両方の種子生存に不可欠であるとして、媒体の温度と遠心速度に注意してください。まず、蒸留水に95%の工業用エタノールを加え、十分に混合して70%エタノールを調製します。次に、95ミリリットルの滅菌蒸留水に家庭用漂白剤5ミリリットルを加えて5%漂白液を調製する。その後、漂白剤溶液に数滴の非イオン性洗剤を加え、十分に混ぜます。次に、ビタミンを含むMS培地粉末2.2グラムと800ミリリットルの蒸留水に10グラムのスクロースを加えて、半強度のムラシゲとスクーグ培地を調製します。水酸化カリウムのモル1個を用いて培地のpHを5.7に調整し、蒸留水を使用して体積を1リットルまで上げる。アリコート500ミリリットルの培地を1リットルのボトルに入れ、4グラムの寒天を加えて固体培地を調製する。オートクレーブした後、水浴で50〜53度まで冷却します。その後、層流フードの下にペトリ料理にそれを注ぎます。選択培地を調製するには、培地にカナマイシンを加え、先に示したようにペトリ皿に注ぎます。吸引器を設置するには、真空ポンプの入口を適当なサイズのポリエチレンチューブの一端に接続します。次に、チューブのもう一方の端をデカンテーションボトルの双方向蓋の出口に接続します。チューブの接合部を密閉フィルムでしっかりと包み込み、気密性を確保します。次に、デカンテーションボトルのスクリューキャップの入口に2番目のポリエチレンチューブを接続します。次に、薄いポリエチレンチューブを取り付けた水槽弁の出口にチューブの反対側を接続します。必要に応じて、シールフィルムで接合部を包み込んで、空気漏れを除去します。プログレッシブ番号を持つ48個の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブの2つのバッチにラベルを付けた後、96個の無菌マイクロ遠心チューブのそれぞれに100〜200のシロイヌナズナの種子を加え、チューブの円錐端の底から約1〜2ミリメートル上に追加します。次に、10ミリリットルの無菌血清ピペットを使用し、各チューブに70%エタノールの約1ミリリットルを加え、慎重に蓋を閉じます。シェーカーで8ヘルツの振動周波数で3分間チューブを振ります。次に、シェーカーからアダプターを取り外し、パルス機能を使用して種子を回転させるベンチトップマイクロ遠心分離機のバスケットに移します。チューブをラックに移した後、ラミナーフローフードの下のすべてのチューブを開きます。汚染を避けるためにチューブに取り付ける蓋の部分に触れないでください。次に、ラミナーフローフードの下に、無菌200マイクロリットルイエローチップを自家製アスピレーターの水槽用バルブ入口に装着し、ポンプをオンにします。液体を吸うときに種子に触れないように、種子のレベルのすぐ上にチップを挿入します。次に、10ミリリットルの滅菌血清学的ピペットを用いて、各チューブに5%漂白液の1ミリリットルをアリコートする。ふたを閉じてから、チューブをシェーカー アダプターに戻し、前に示したようにチューブを振ります。ベンチトップ遠心分離機のパルス機能を使用して種子を回転させた後、新しい無菌200マイクロリットルイエローチップを水槽バルブに取り付け、ポンプをオンにします。漂白剤溶液を吸うときに種子に触れないように、種子のレベルの上に先端を挿入します。次に、10ミリリットルの無菌血清ピペットを用いて、各チューブに1ミリリットルの滅菌水をアリコートする。水槽弁に新しい滅菌200マイクロリットル黄色の先端を取り付けた後、ポンプのスイッチを入れる。水を吸うときに種子に触れないように、種子のレベルのすぐ上にチップを挿入します。最後に、各チューブに殺菌水のアリコート500マイクロリットル、および層流フード内のすべての蓋を閉じる。種をまく準備ができました。必要に応じて、チューブを室温で数時間または一晩で摂氏4度に保ちます。1ミリリットルのピペットを使用して、300〜400マイクロリットルの無菌水で種子をペトリ皿に移します。10本のチューブを移管した後、1.5~2ミリリットルの溶融半強度のムラシゲとスクーグ培地を各プレートに、抗生物質を入れずに注ぎます。素早くプレートを旋回して種を分配し、反対側にプレートをテープで貼ります。プレートをプラスチックまたはアルミホイルで包み、暗闇の中で3日間冷蔵庫に入れて均一な発芽を得ます。2日目、3日目、4日目、7日目に行われた発芽分析では、70%エタノールによる10~40分の殺菌時間の間に有意な差は示さなかった。しかし、殺菌時間が40分を超えると、発芽率は低下した。これに対応して、緑色のコチルドン出現率も低下した。研究に基づき、70%エタノールに対して3分間、5%漂白剤に対して3分間、種子を殺菌する最小時間として選択した。もともと使用されていた種子が微生物で汚染されていることを実証するために、非無菌種子をプレートに直接播種した。無菌種子と比較して、非無菌種子は、7日間の発芽後にプレート全体に広がる2日後に真菌の出現を示した。異なる種子サンプルを処理するために単一の滅菌ピペットチップを使用して行われた交差汚染アッセイは、カナマイシンを用いたプレートに播種されたコロンビア-0遺伝子型種子では緑色のコチルドンが観察されなかったことを示した。並行して、コロンビア-0種子ではカナマイシンなしでプレートに播種され、すべてのコチルドンは発芽後に緑色に見えた。これらの結果は、滅菌溶液を除去するために単一のピペット先端を使用したにもかかわらず、サンプル間の汚染の持ち越しを示さない。この手順は、遺伝子過剰発現、ゲノム編集、細胞内局在化、プロモーター活性、タンパク質とタンパク質-DNA相互作用などの他の多くの機能性ゲノミクス法の基礎となる。

Research

JoVE Journal

Biology

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