Name: high-throughput, robust and highly time-flexible method for surface sterilization of arabidopsis seeds
Uploaded: 2021-10-04T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds at JoVE.com

Denne forskningen ble finansiert av den autonome provinsen Trento gjennom kjernefinansiering av Ecogenomics-gruppen av Fondazione E. Mach.

1. Reagenser og medieforberedelse
<ol><li>Forbered 70% etanolløsning: Tilsett 737 ml 95% teknisk etanol til 263 ml destillert vann. Bland grundig. MERK: Klargjør 70 % etanoloppløsning på en ikke-steril arbeidsbenk. FORSIKTIG: Etanol er svært brannfarlig og kan forårsake alvorlig irritasjon i øynene. Holdes unna flammer og varmekilder. Ved kontakt med øynene, skyll med rikelig vann.</li>
	<li>Forbered 5% blekemiddeloppløsning: Tilsett 5 ml husholdningsblekemiddel (inneholder ~ 3,5% natriumhypokloritt, NaC...

<ol>
	<li>Somerville, C., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fortunate+choice:+The+history+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">A fortunate choice: The history of Arabidopsis as a model plant.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (11), 883-889 (2002).</li><li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).</li><li>Initiative, T. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+genome+sequence+of+the+flowering+plant+Arabidopsis+thaliana.">Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.</a> Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).</li><li>Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-DNA+as+an+insertional+mutagen+in+Arabidopsis.">T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 11 (12), 2283-2290 (1999).</li><li>Speulman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-component+enhancer-inhibitor+transposon+mutagenesis+system+for+functional+analysis+of+the+arabidopsis+genome.">A two-component enhancer-inhibitor transposon mutagenesis system for functional analysis of the arabidopsis genome.</a> Plant Cell. 11 (10), 1853-1866 (1999).</li><li>Jander, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethylmethanesulfonate+saturation+mutagenesis+in+Arabidopsis+to+determine+frequency+of+herbicide+resistance.">Ethylmethanesulfonate saturation mutagenesis in Arabidopsis to determine frequency of herbicide resistance.</a> Plant Physiology. 131 (1), 139-146 (2003).</li><li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. -. S., Niu, Q. -. W., Chua, N. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method.">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).</li><li>Togninalli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AraPheno+and+the+AraGWAS+catalog+2020:+A+major+database+update+including+RNA-Seq+and+knock-out+mutation+data+for+Arabidopsis+thaliana.">AraPheno and the AraGWAS catalog 2020: A major database update including RNA-Seq and knock-out mutation data for Arabidopsis thaliana.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 1063-1068 (2020).</li><li>Lan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtMAD:+Arabidopsis+thaliana+multi-omics+association+database.">AtMAD: Arabidopsis thaliana multi-omics association database.</a> Nucleic Acids Research. 49 (1), 1445-1451 (2021).</li><li>Xu, J., Trainotti, L., Li, M., Varotto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+isoprene+synthase+affects+ABA-and+drought-related+gene+expression+and+enhances+tolerance+to+abiotic+stress.">Overexpression of isoprene synthase affects ABA-and drought-related gene expression and enhances tolerance to abiotic stress.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-21 (2020).</li><li>Czarnecki, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+knock-down+of+six+non-family+genes+using+a+single+synthetic+RNAi+fragment+in+Arabidopsis+thaliana.">Simultaneous knock-down of six non-family genes using a single synthetic RNAi fragment in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 12 (1), 1-11 (2016).</li><li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-efficiency+genome+editing+in+arabidopsis+using+YAO+promoter-driven+CRISPR/Cas9+system.">high-efficiency genome editing in arabidopsis using YAO promoter-driven CRISPR/Cas9 system.</a> Molecular Plant. 8 (12), 1820-1823 (2015).</li><li>Liu, Y., Gao, Y., Gao, Y., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+of+floral+development+genes+in+Arabidopsis+with+CRISPR/Cas9+using+the+RNA+endoribonuclease+Csy4+processing+system.">Targeted deletion of floral development genes in Arabidopsis with CRISPR/Cas9 using the RNA endoribonuclease Csy4 processing system.</a> Horticulture Research. 6 (1), (2019).</li><li>Grefen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+and+in+vivo+interactions+of+the+Arabidopsis+thaliana+ethylene+receptor+family+members.">Subcellular localization and in vivo interactions of the Arabidopsis thaliana ethylene receptor family members.</a> Molecular Plant. 1 (2), 308-320 (2008).</li><li>Gazzani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+MIR168+paralogs+in+Brassicaceae.">Evolution of MIR168 paralogs in Brassicaceae.</a> BMC Evolutionary Biology. 9 (1), (2009).</li><li>Lee, S., Korban, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+Arabidopsis+thaliana+phytochelatin+synthase+(AtPCS1)+by+cadmium+during+early+stages+of+plant+development.">Transcriptional regulation of Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase (AtPCS1) by cadmium during early stages of plant development.</a> Planta. 215 (4), 689-693 (2002).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+FRET-FLIM+reveals+cell-type-specific+protein+interactions+in+Arabidopsis+roots.">In vivo FRET-FLIM reveals cell-type-specific protein interactions in Arabidopsis roots.</a> Nature. 548 (7665), 97-102 (2017).</li><li>Freire-Rios, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+DNA+elements+mediating+ARF+transcription+factor+binding+and+auxin-responsive+gene+expression+in+Arabidopsis.">Architecture of DNA elements mediating ARF transcription factor binding and auxin-responsive gene expression in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24557-24566 (2020).</li><li>Rivero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+arabidopsis+plants:+Growth,+preservation+of+seeds,+transformation,+and+genetic+crosses.">Handling arabidopsis plants: Growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses.</a> Methods in Molecular Biology. 1062, 3-25 (2014).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+and+salt+stress+tolerance+of+an+arabidopsis+glutathione+S-transferase+U17+knock-out+mutant+are+attributed+to+the+combined+effect+of+glutathione+and+abscisic+acid.">Drought and salt stress tolerance of an arabidopsis glutathione S-transferase U17 knock-out mutant are attributed to the combined effect of glutathione and abscisic acid.</a> Plant Physiology. 158 (1), 340-351 (2012).</li><li>Li, D. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+a+large+dataset+indicates+that+internal+transcribed+spacer+(ITS)+should+be+incorporated+into+the+core+barcode+for+seed+plants.">Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (49), 19641-19646 (2011).</li><li>Mathur, J., Koncz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+maintenance+of+cell+suspension+cultures.+Arabidopsis+Protocols.">Establishment and maintenance of cell suspension cultures. Arabidopsis Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 82, 27-30 (1998).</li><li>Li, M., Cappellin, L., Xu, J., Biasioli, F., Varotto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+in+planta+characterization+of+VOC+biosynthetic+genes+by+PTR-ToF-MS.">High-throughput screening for in planta characterization of VOC biosynthetic genes by PTR-ToF-MS.</a> Journal of Plant Research. 133 (1), 123-131 (2020).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+recapitulation+of+isoprene+synthase+evolution+from+ocimene+synthases.">In planta recapitulation of isoprene synthase evolution from ocimene synthases.</a> Molecular Biology and Evolution. 34 (10), 2583-2599 (2017).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+isoprene+emission+in+Arecaceae+(palms).">Evolution of isoprene emission in Arecaceae (palms).</a> Evolutionary Applications. 14, 902-914 (2020).</li><li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bio+assays+with+tobacco+tissue+cultures.">A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures.</a> Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).</li><li>Bent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+method.">Arabidopsis thaliana floral dip transformation method.</a> Methods in Molecular Biology. 343, 87-104 (2006).</li><li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana+root+microbiome.">Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome.</a> Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).</li><li>Tkacz, A., Cheema, J., Chandra, G., Grant, A., Poole, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+succession+of+the+rhizosphere+microbiota+depends+upon+plant+type+and+soil+composition.">Stability and succession of the rhizosphere microbiota depends upon plant type and soil composition.</a> ISME Journal. 9 (11), 2349-2359 (2015).</li><li>Singh, N., Gaddam, S. R., Singh, D., Trivedi, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+arsenic+stress+response+by+ethylene+biosynthesis+and+signaling+in+Arabidopsis+thaliana.">Regulation of arsenic stress response by ethylene biosynthesis and signaling in Arabidopsis thaliana.</a> Environmental and Experimental Botany. 185, 104408 (2021).</li><li>Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+method+for+high-throughput+sterilization+of+Arabidopsis+seeds.">Standardized method for high-throughput sterilization of Arabidopsis seeds.</a> Journal of Visualized Experiments: JOVE. (128), e56587 (2017).</li><li>Acemi, A., &#214;zen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+in+vitro+asymbiotic+seed+germination+protocol+for+Serapias+vomeracea.">Optimization of in vitro asymbiotic seed germination protocol for Serapias vomeracea.</a> The EuroBiotech Journal. 3 (3), 143-151 (2019).</li></ol>

Sterilisering av frø er det grunnleggende trinnet for funksjonelle studier i Arabidopsis. Selv om det ofte utføres for mange forskjellige formål, er begrensede studier på høygjennomstrømning frø overflatesterilisering i Arabidopsis tilgjengelig.
Så langt bruker en av metodene med høyest gjennomstrømning klorgass generert ved å blande blekemiddel med konsentrert HCl. Selv om denne metoden krever begrenset praktisk tid, bruker den en gass som er svært giftig for mennesker<sup class="...

Arabidopsis er en diploid planteart som tilhører Brassicaceae-familien. Den relativt korte livssyklusen (to måneder per generasjon under lange vekstforhold), liten plantestørrelse og selvbestøvning med produksjon av hundrevis av frø per plante har gjort det til den første grunnleggende plantemodellarten1,2. I tillegg var genomet fullt sekvensert3, omfattende omvendte genetikkverktøy (mettet T-DNA, transposon og kjemisk mutageniserte populasjoner) er tilgjengelige4,5,6, og effektiv Agrobacterium-mediert transformasjon er veletablert for å oppnå tilstrekkelige transgene linjer for videre nedstrømsarbeid7. . I løpet av de siste to tiårene har det derfor blitt oppnådd store fremskritt ved å bruke Arabidopsis som modellart for å dissekere ulike aspekter av plantebiologi på molekylært nivå, inkludert naturlig, genetisk og fenotypisk variasjon8,9.
For å funksjonelt karakterisere gener av interesse for Arabidopsis, er frøoverflatesterilisering for å eliminere sopp- og bakterieforurensninger det nødvendige trinnet for mange nedstrømsprotokoller som krever akseniske kulturer. Genetisk transformasjon for overekspression10, knock-down (RNA-I11) eller knock-out (genomredigering12,13) av genfunksjon, subcellulær lokalisering14, promotoraktivitet15,16, proteinprotein17 og protein-DNA-interaksjon18, for å sitere bare de vanligste applikasjonene, alle nødvendiggjør et frøoverflatesteriliseringstrinn. Til tross for sin relative enkelhet spiller frøoverflatesterilisering en grunnleggende rolle i mange funksjonelle analyser.
Så langt er to hovedkategorier av frøoverflatesteriliseringsmetoder utviklet basert enten på gass- eller væskefasesterilisering19. Mens gjennomstrømningen av gassfasefrøoverflatesterilisering er middels til høy, har bruk av farlig reagensklorgass som overflatesteriliseringsmiddel hindret den brede anvendelsen. Metoder basert på væskefasesterilisering, tvert imot, er avhengige av mildere kjemikalier som etanol og blekemiddelløsninger for overflatesterilisering, og de er mer utbredt til tross for at de har en iboende lavere gjennomstrømning enn klorfumigering. Generelt brukes to forskjellige metoder som bruker flytende reagenser ofte. En i stor grad brukt metode er basert på vask med etanol og blekemiddel ved forskjellige konsentrasjoner i forskjellig varighet av tid20,21. En annen metode er basert på bruk av blekemiddel bare21,22. Begge metodene brukes hovedsakelig til småskala frøoverflatesterilisering. I mange eksperimenter er det imidlertid nødvendig å screene mange Arabidopsis transgene linjer avledet fra en transformasjon15,23 eller skjerm parallelt mange transgene linjer generert fra forskjellige transformasjoner24,25. Så vidt vi vet, er det ikke publisert noen væskebasert metode for høygjennomstrømning av frøoverflatesterilisering, noe som utgjør, selv om den er lite anerkjent, en viktig flaskehals for funksjonelle genomiske tilnærminger. Derfor er utvikling av sikre, robuste og høygjennomstrømningsmetoder for frøoverflatesterilisering et nødvendig og kritisk skritt mot suksessen til funksjonell karakterisering av mange gener samtidig.
For dette formål, i den nåværende studien, presenteres en forbedret metode for overflatesterilisering av Arabidopsis frø. Denne metoden er trygg, rimelig, svært robust og høy gjennomstrømning, slik at håndtering av 96 uavhengige linjer innen en time fra begynnelsen av frøoverflatesterilisering til slutten av frøsåing i Petri-retter. Metoden som demonstreres er avhengig av allment tilgjengelig, grunnleggende laboratorieinstrumentering som en vakuumpumpe, forbruksglass og plastvarer. Denne forbedrede metoden gir det vitenskapelige samfunnet en trygg, enkel og rimelig tilnærming for å effektivisere frøoverflatesterilisering med en gjennomstrømning som er tilstrekkelig til moderne funksjonelle genomiske tilnærminger i Arabidopsis og andre ikke-modell plantearter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aquarium valve</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B074CYC5SD</td>
			<td>Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis Col-0 wild-type seeds</td>
			<td>Nottingham Arabidopsis Stock Center</td>
			<td>N1093</td>
			<td>Wild type seeds (sensitive to kanamycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583&#8211;2599). Available on request from the authors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628188</td>
			<td>Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog medium including vitamins</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0222</td>
			<td>Standard medium for plant sterile culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller</td>
			<td>Brand</td>
			<td>26300</td>
			<td>Used to operate the serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tube 1</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9591.1</td>
			<td>Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tube 2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9587.1</td>
			<td>Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve&#160; (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap with connectors</td>
			<td>Roth</td>
			<td>PY86.1</td>
			<td>2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Brand</td>
			<td>27823</td>
			<td>Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shakeret al.</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technical ethanol</td>
			<td>ITW Reagents (Nova Chimica Srl)</td>
			<td>212800</td>
			<td>Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>655205</td>
			<td>Non-ionic detergent acting as surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal tubing connectors</td>
			<td>Roth</td>
			<td>Y523.1</td>
			<td>Can be used to improve/simplify tubing connections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>WP6222050</td>
			<td>Used for making the suction device</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput, robust and highly time-flexible method for surface sterilization of arabidopsis seeds

Arabidopsis er den desidert plantemodellarten som er mest brukt til funksjonelle studier. Overflatesteriliseringen av Arabidopsis frø er et grunnleggende skritt som kreves mot denne enden. Dermed er det viktig å etablere høygjennomstrømning Arabidopsis frø overflatesteriliseringsmetoder for å håndtere titalls til hundrevis av prøver (f.eks. transgene linjer, økotyper eller mutanter) samtidig. En frøoverflatesteriliseringsmetode basert på effektiv eliminering av væske i rør med en hjemmelaget sugeenhet konstruert av en vanlig vakuumpumpe presenteres i denne studien. Ved å dramatisk redusere arbeidsintensiv hands-on tid med denne metoden håndtering av flere hundre prøver på en dag er mulig med liten innsats. Serietidsanalyser indikerte videre et svært fleksibelt tidsrom for overflatesterilisering ved å opprettholde høye spiringshastigheter. Denne metoden kan enkelt tilpasses for overflatesterilisering av andre typer små frø med enkel tilpasning av sugeenheten i henhold til frøstørrelsen, og hastigheten som ønskes for å eliminere væsken.

For å vurdere tiden som kreves for hele frøsteriliseringsprosedyren, ble tidsforskjellene for væskehåndtering 96 prøver i den nåværende protokollen beregnet og sammenlignet med tradisjonelle pipetteringsmetoder. Resultatet indikerer at den gjeldende protokollen sparer tid, og kutter væskehåndteringstiden til en fjerdedel av den med de tradisjonelle protokollene (Tabell 1). Tabellen fremhever videre at væskefjerningstiden i den nåværende protokollen sparer mer tid enn de tradisjonelle metodene...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds at JoVE.com

High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds

En høy gjennomstrømningsprotokoll for overflatesterilisering av Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) frø er gitt, og optimaliserer væskehåndteringstrinnene med en enkel sugeenhet konstruert med en vakuumpumpe. Hundrevis av frøprøver kan overflatesteriliseres på en dag.

Høy gjennomstrømning, robust og svært tidsfleksibel metode for overflatesterilisering av arabidopsisfrø

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental ...

Denne protokollen forbedrer frøoverflatesterilisering, et grunnleggende skritt i funksjonell genomikk av modellarten Arabidopsisthaliana. De viktigste fordelene med denne teknikken er enkel og høy gjennomstrømning, slik at behandling av hundrevis av prøver per dag. Med noen enkle modifikasjoner kan denne metoden brukes på mange andre modell- og ikke-modell plantearter.For førstegangsbrukere, vær oppmerksom på temperaturen på mediet og sentrifugeringshastigheten, da de begge er kritiske for frøoverlevelse. Til å begynne med, forbered 70% etanol ved å legge til 95% teknisk etanol til destillert vann og bland grundig. Deretter forbereder du 5% blekemiddelløsning ved å legge til fem milliliter husholdningsblekemiddel til 95 milliliter sterilt destillert vann.Tilsett deretter noen dråper ikke-ionisk vaskemiddel til blekemiddeloppløsningen, og bland grundig. Deretter forbereder du halvstyrke Murashige og Skoog medium ved å tilsette 2,2 gram MS middels pulver, inkludert vitaminer og 10 gram sukrose i 800 milliliter destillert vann. Juster pH i mediet til 5,7 ved hjelp av en molar kaliumhydroksid, og ta deretter volumet opp til en liter ved hjelp av destillert vann.Aliquot 500 milliliter av mediet i en en-liters flaske, og tilsett fire gram agar for å forberede et solid medium. Etter autoklavering, la mediet avkjøles ned til 50 til 53 grader Celsius i et vannbad. Hell den deretter i Petri-retter under laminær strømningshette.For å forberede selektivt medium, legg kanamycin til mediet, og hell det i Petri-retter som vist tidligere. For å sette opp aspiratoren, koble vakuumpumpeinntaket til den ene enden av et polyetylenrør av passende størrelse. Koble deretter den andre enden av røret til utløpet av det toveis lokket på dekanteringsflasken.Vikle slangens veikryss tett med en tetningsfilm for å sikre lufttett tilkobling. Deretter kobler du et annet polyetylenrør til innløpet på skruehetten på dekanteringsflasken. Koble deretter den andre siden av røret til utløpet av en akvariumventil utstyrt med et tynt polyetylenrør.Om nødvendig, pakk krysset med tetningsfilmen for å eliminere luftlekkasje. Etter å ha merket to partier med 48 1,5 milliliter mikrosenterrør med progressive tall, legg til 100 til 200 Arabidopsis frø til hver av de 96 sterile mikrocentrifugerørene, omtrent en til to millimeter over bunnen av den koniske enden av røret. Deretter legger du til rundt en milliliter 70% etanol i hvert rør ved hjelp av en 10 milliliter steril serologisk pipette, og lukker forsiktig lokkene.Rist rørene med en oscillasjonsfrekvens på åtte hertz i tre minutter i en shaker. Fjern deretter adapterne fra shakeren og overfør dem i kurven til en stasjonær mikrosenter for å spinne ned frøene ved hjelp av pulsfunksjonen. Etter å ha overført rørene til et stativ, åpne alle rør under laminær strømningshette.Ikke berør den delen av lokkene som passer inn i rørene for å unngå forurensning. Deretter, under laminær strømningshette, passer en steril 200-mikroliter gul spiss på akvariet ventilinntaket til den hjemmelagde aspiratoren, og slå på pumpen. Sett spissen like over frønivået for å unngå å berøre frøene når du suger væsken.Deretter bruker du en 10 milliliter steril serologisk pipette, aliquot en milliliter 5% blekemiddeloppløsning i hvert rør. Lukk dekslene før du setter rørene tilbake i shakeradapterne, og rist deretter rørene som vist tidligere. Etter å ha spinnet ned frøene ved hjelp av pulsfunksjonen til en stasjonær sentrifuge, monter en ny steril 200-mikroliter gul spiss på akvarieventilen, og slå på pumpen.Sett spissen over frønivået for å unngå å berøre frøene når du suger blekemiddeloppløsningen. Deretter bruker du en 10 milliliter steril serologisk pipette, aliquot en milliliter sterilisert vann i hvert rør. Etter å ha montert en ny steril 200-mikroliter gul spiss på akvarieventilen, slå på pumpen.Sett inn spissen like over frønivået for å unngå å berøre frøene når du suger vannet. Til slutt, aliquot 500 mikroliter sterilisert vann i hvert rør, og lukk alle lokkene i laminær strømningshetten. Frøene er nå klare til å bli sådd.Hold om nødvendig rørene ved romtemperatur i opptil noen timer eller ved fire grader Celsius over natten. Bruk en en milliliter pipette, overfør frøene med 300 til 400 mikroliter sterilt vann til en Petri-tallerken. Etter å ha overført 10 rør, hell 1,5 til to milliliter smeltet halvstyrke Murashige og Skoog medium uten antibiotika i hver plate.Virvle raskt platen for å distribuere frøene, og tape platene på motsatte sider. Pakk platene i plast- eller aluminiumsfolie, og legg dem i kjøleskap i tre dager i mørket for å oppnå jevn spiring. Spiringsanalyser utført på dag to, tre, fire og syv indikerte ingen signifikante forskjeller mellom 10 og 40 minutters steriliseringstid med 70% etanol.Men da steriliseringstiden oversteg 40 minutter, falt spiringsratene. Tilsvarende gikk også de grønne cotyledon-fremveksten ned. Basert på studien ble tre minutter for 70% etanol og tre minutter for 5% blekemiddel valgt som minimumstid for sterilisering av frøene.For å demonstrere at frøene som ble brukt opprinnelig var forurenset med mikroorganismer, ble ikke-sterile frø sådd direkte på platene. Sammenlignet med sterile frø viste ikke-sterile frø et sopputseende etter to dager, som spredte seg over platene etter en syv-dagers spiring. En krysskontamineringsanalyse utført ved hjelp av en enkelt steril pipettespiss for å behandle forskjellige frøprøver viste at ingen grønne cotyledoner ble observert i Columbia-0 genotypefrø sådd i plater med kanamycin.Parallelt, i Columbia-0 frø sådd i plater uten kanamycin, virket alle cotyledoner grønne etter spiring. Disse resultatene indikerer ingen overføring av forurensning mellom prøver til tross for bruk av en enkelt pipettespiss for å fjerne den sterile løsningen. Denne prosedyren er grunnlaget for mange andre funksjonelle genomiske metoder som genovertrykk, genomredigering, subcellulær lokalisering, promotoraktivitet og proteinprotein- og protein-DNA-interaksjoner.

Research

JoVE Journal

Biology

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: A Method for voksende Arabidopsis Og tomatplanter i 96-brønn plater for høy gjennomstrømming Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

High-throughput krystallisering av membran proteiner Bruke Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

En High-throughput metode for måling av glomerulær filteringsrate i Bevisste Mus

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Effektiv og Rapid Isolering av tidlig stadium embryo fra<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Frø

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

Meget Effektiv Ligering av små RNA molekyler for mikroRNA kvantifisering av høy gjennomstrømming Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Utvinning av Voksen sebrafisk Hearts for høy gjennomstrømming Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Høy gjennomstrømming Screening for kjemi modulatorer av Post-transcriptionally Regulerte Gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...