Name: high-throughput, robust and highly time-flexible method for surface sterilization of arabidopsis seeds
Uploaded: 2021-10-04T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds at JoVE.com

Esta pesquisa foi financiada pela Província Autônoma de Trento através do financiamento central do grupo de Ecogenômica de Fondazione E. Mach.

1. Reagentes e preparação da mídia
<ol><li>Prepare 70% solução de etanol: Adicione 737 mL de 95% de etanol técnico a 263 mL de água destilada. Homogeneizar. NOTA: Prepare a solução de 70% de etanol em um banco de trabalho não estéril. ATENÇÃO: O etanol é altamente inflamável e pode causar séria irritação nos olhos. Mantenha-se longe de chamas e fontes de calor. Em caso de contato com os olhos, enxágue com água abundante.</li>
	<li>Prepare 5% solução de alvejante: Adicione 5 mL de alvejante d...

<ol>
	<li>Somerville, C., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fortunate+choice:+The+history+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">A fortunate choice: The history of Arabidopsis as a model plant.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (11), 883-889 (2002).</li><li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).</li><li>Initiative, T. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+genome+sequence+of+the+flowering+plant+Arabidopsis+thaliana.">Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.</a> Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).</li><li>Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-DNA+as+an+insertional+mutagen+in+Arabidopsis.">T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 11 (12), 2283-2290 (1999).</li><li>Speulman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-component+enhancer-inhibitor+transposon+mutagenesis+system+for+functional+analysis+of+the+arabidopsis+genome.">A two-component enhancer-inhibitor transposon mutagenesis system for functional analysis of the arabidopsis genome.</a> Plant Cell. 11 (10), 1853-1866 (1999).</li><li>Jander, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethylmethanesulfonate+saturation+mutagenesis+in+Arabidopsis+to+determine+frequency+of+herbicide+resistance.">Ethylmethanesulfonate saturation mutagenesis in Arabidopsis to determine frequency of herbicide resistance.</a> Plant Physiology. 131 (1), 139-146 (2003).</li><li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. -. S., Niu, Q. -. W., Chua, N. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method.">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).</li><li>Togninalli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AraPheno+and+the+AraGWAS+catalog+2020:+A+major+database+update+including+RNA-Seq+and+knock-out+mutation+data+for+Arabidopsis+thaliana.">AraPheno and the AraGWAS catalog 2020: A major database update including RNA-Seq and knock-out mutation data for Arabidopsis thaliana.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 1063-1068 (2020).</li><li>Lan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtMAD:+Arabidopsis+thaliana+multi-omics+association+database.">AtMAD: Arabidopsis thaliana multi-omics association database.</a> Nucleic Acids Research. 49 (1), 1445-1451 (2021).</li><li>Xu, J., Trainotti, L., Li, M., Varotto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+isoprene+synthase+affects+ABA-and+drought-related+gene+expression+and+enhances+tolerance+to+abiotic+stress.">Overexpression of isoprene synthase affects ABA-and drought-related gene expression and enhances tolerance to abiotic stress.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-21 (2020).</li><li>Czarnecki, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+knock-down+of+six+non-family+genes+using+a+single+synthetic+RNAi+fragment+in+Arabidopsis+thaliana.">Simultaneous knock-down of six non-family genes using a single synthetic RNAi fragment in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 12 (1), 1-11 (2016).</li><li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-efficiency+genome+editing+in+arabidopsis+using+YAO+promoter-driven+CRISPR/Cas9+system.">high-efficiency genome editing in arabidopsis using YAO promoter-driven CRISPR/Cas9 system.</a> Molecular Plant. 8 (12), 1820-1823 (2015).</li><li>Liu, Y., Gao, Y., Gao, Y., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+of+floral+development+genes+in+Arabidopsis+with+CRISPR/Cas9+using+the+RNA+endoribonuclease+Csy4+processing+system.">Targeted deletion of floral development genes in Arabidopsis with CRISPR/Cas9 using the RNA endoribonuclease Csy4 processing system.</a> Horticulture Research. 6 (1), (2019).</li><li>Grefen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+and+in+vivo+interactions+of+the+Arabidopsis+thaliana+ethylene+receptor+family+members.">Subcellular localization and in vivo interactions of the Arabidopsis thaliana ethylene receptor family members.</a> Molecular Plant. 1 (2), 308-320 (2008).</li><li>Gazzani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+MIR168+paralogs+in+Brassicaceae.">Evolution of MIR168 paralogs in Brassicaceae.</a> BMC Evolutionary Biology. 9 (1), (2009).</li><li>Lee, S., Korban, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+Arabidopsis+thaliana+phytochelatin+synthase+(AtPCS1)+by+cadmium+during+early+stages+of+plant+development.">Transcriptional regulation of Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase (AtPCS1) by cadmium during early stages of plant development.</a> Planta. 215 (4), 689-693 (2002).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+FRET-FLIM+reveals+cell-type-specific+protein+interactions+in+Arabidopsis+roots.">In vivo FRET-FLIM reveals cell-type-specific protein interactions in Arabidopsis roots.</a> Nature. 548 (7665), 97-102 (2017).</li><li>Freire-Rios, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+DNA+elements+mediating+ARF+transcription+factor+binding+and+auxin-responsive+gene+expression+in+Arabidopsis.">Architecture of DNA elements mediating ARF transcription factor binding and auxin-responsive gene expression in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24557-24566 (2020).</li><li>Rivero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+arabidopsis+plants:+Growth,+preservation+of+seeds,+transformation,+and+genetic+crosses.">Handling arabidopsis plants: Growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses.</a> Methods in Molecular Biology. 1062, 3-25 (2014).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+and+salt+stress+tolerance+of+an+arabidopsis+glutathione+S-transferase+U17+knock-out+mutant+are+attributed+to+the+combined+effect+of+glutathione+and+abscisic+acid.">Drought and salt stress tolerance of an arabidopsis glutathione S-transferase U17 knock-out mutant are attributed to the combined effect of glutathione and abscisic acid.</a> Plant Physiology. 158 (1), 340-351 (2012).</li><li>Li, D. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+a+large+dataset+indicates+that+internal+transcribed+spacer+(ITS)+should+be+incorporated+into+the+core+barcode+for+seed+plants.">Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (49), 19641-19646 (2011).</li><li>Mathur, J., Koncz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+maintenance+of+cell+suspension+cultures.+Arabidopsis+Protocols.">Establishment and maintenance of cell suspension cultures. Arabidopsis Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 82, 27-30 (1998).</li><li>Li, M., Cappellin, L., Xu, J., Biasioli, F., Varotto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+in+planta+characterization+of+VOC+biosynthetic+genes+by+PTR-ToF-MS.">High-throughput screening for in planta characterization of VOC biosynthetic genes by PTR-ToF-MS.</a> Journal of Plant Research. 133 (1), 123-131 (2020).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+recapitulation+of+isoprene+synthase+evolution+from+ocimene+synthases.">In planta recapitulation of isoprene synthase evolution from ocimene synthases.</a> Molecular Biology and Evolution. 34 (10), 2583-2599 (2017).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+isoprene+emission+in+Arecaceae+(palms).">Evolution of isoprene emission in Arecaceae (palms).</a> Evolutionary Applications. 14, 902-914 (2020).</li><li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bio+assays+with+tobacco+tissue+cultures.">A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures.</a> Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).</li><li>Bent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+method.">Arabidopsis thaliana floral dip transformation method.</a> Methods in Molecular Biology. 343, 87-104 (2006).</li><li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana+root+microbiome.">Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome.</a> Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).</li><li>Tkacz, A., Cheema, J., Chandra, G., Grant, A., Poole, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+succession+of+the+rhizosphere+microbiota+depends+upon+plant+type+and+soil+composition.">Stability and succession of the rhizosphere microbiota depends upon plant type and soil composition.</a> ISME Journal. 9 (11), 2349-2359 (2015).</li><li>Singh, N., Gaddam, S. R., Singh, D., Trivedi, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+arsenic+stress+response+by+ethylene+biosynthesis+and+signaling+in+Arabidopsis+thaliana.">Regulation of arsenic stress response by ethylene biosynthesis and signaling in Arabidopsis thaliana.</a> Environmental and Experimental Botany. 185, 104408 (2021).</li><li>Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+method+for+high-throughput+sterilization+of+Arabidopsis+seeds.">Standardized method for high-throughput sterilization of Arabidopsis seeds.</a> Journal of Visualized Experiments: JOVE. (128), e56587 (2017).</li><li>Acemi, A., &#214;zen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+in+vitro+asymbiotic+seed+germination+protocol+for+Serapias+vomeracea.">Optimization of in vitro asymbiotic seed germination protocol for Serapias vomeracea.</a> The EuroBiotech Journal. 3 (3), 143-151 (2019).</li></ol>

A esterilização de sementes é o passo fundamental para estudos funcionais em Arabidopsis. Embora seja frequentemente realizada para muitos propósitos diferentes, estudos limitados sobre esterilização de superfície de sementes de alta produtividade em Arabidopsis estão disponíveis.
Até agora, um dos métodos com maior rendimento é o uso de gás cloro gerado pela mistura de alvejante com HCl concentrado. Embora este método exija tempo prático limitado, ele usa um gás altamente tóx...

Arabidopsis é uma espécie de planta diploide pertencente à família Brassicaceae. Seu ciclo de vida relativamente curto (dois meses por geração em condições de crescimento prolongado), tamanho de plantas pequenos e auto-polinização com a produção de centenas de sementes por planta fizeram dela a primeira espécie fundamental do modelo vegetal1,2. Além disso, seu genoma foi totalmente sequenciado3, extensas ferramentas genéticas reversas (T-DNA saturado, transposon e populações quimicamente mutagenizadas) estão disponíveis4,5,6, e a transformação eficaz agrobacterium-mediada é bem estabelecida para obter linhas transgênicas suficientes para mais trabalho a jusante7 . Assim, nas últimas duas décadas, grandes avanços foram alcançados utilizando a Arabidopsis como espécie modelo para dissecar diversos aspectos da biologia vegetal no nível molecular, incluindo variação natural, genética e fenotípica8,9.
Para caracterizar funcionalmente genes de interesse na Arabidopsis, a esterilização da superfície das sementes para eliminar contaminantes fúngicos e bacterianos é o passo pré-requisito para muitos protocolos a jusante que requerem culturas axeônicas. Transformação genética para a superexpressão10, knock-down (RNA-I11) ou knock-out (edição de genoma12,13) da função genética, localização subcelular14,atividade promotora15,16, proteína-proteína17 e interação proteína-DNA18, para citar apenas as aplicações mais comuns, todas necessitam de uma etapa de esterilização superficial de sementes. Assim, apesar de sua relativa simplicidade, a esterilização da superfície das sementes desempenha um papel fundamental em muitas análises funcionais.
Até agora, duas grandes categorias de métodos de esterilização de superfície de sementes foram desenvolvidas com base no gás ou na esterilização em fase líquida19. Embora o throughput de esterilização da superfície de sementes em fase de gás seja médio a alto, o uso do gás de cloro de reagente perigoso como agente de esterilização superficial tem dificultado sua ampla aplicação. Métodos baseados na esterilização em fase líquida, pelo contrário, dependem de produtos químicos mais leves, como etanol e soluções alvejantes para esterilização superficial, e são mais amplamente utilizados, apesar de terem um rendimento inerentemente menor do que a fumigação de cloro. Em geral, dois métodos diferentes que usam reagentes líquidos são comumente utilizados. Um método amplamente utilizado é baseado na lavagem com etanol e alvejante em diferentes concentrações por diferentes períodos detempo 20,21. Outro método baseia-se na aplicação de alvejanteapenas 21,22. Ambos os métodos são aplicados principalmente para esterilização de superfície de sementes em pequena escala. No entanto, em muitos experimentos, é necessário telar muitas linhas transgênicas arabidopsis derivadas de uma transformação15,23 ou tela em paralelo muitas linhas transgênicas geradas a partir de diferentes transformações24,25. Pelo que sabemos, nenhum método baseado em líquido para esterilização de superfície de sementes de alta produtividade foi publicado, o que constitui, embora pouco reconhecido, um importante gargalo para abordagens de genômica funcional. Portanto, desenvolver métodos seguros, robustos e de alta produtividade para a esterilização da superfície de sementes é um passo necessário e crítico para o sucesso da caracterização funcional de muitos genes ao mesmo tempo.
Para isso, no presente estudo, é apresentado um método aprimorado para esterilização superficial de sementes arabidopsis. Este método é seguro, de baixo custo, altamente robusto e de alta produtividade, permitindo o manuseio de 96 linhas independentes dentro de uma hora desde o início da esterilização da superfície das sementes até o fim da semeadura em placas de Petri. O método demonstrado conta com instrumentação de laboratório amplamente disponível, como uma bomba de vácuo, vidros consumíveis e utensílios plásticos. Este método aprimorado fornece à comunidade científica uma abordagem segura, simples e acessível para simplificar a esterilização da superfície das sementes com uma throughput adequada às abordagens modernas de genômica funcional em Arabidopsis e outras espécies vegetais não modelo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aquarium valve</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B074CYC5SD</td>
			<td>Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis Col-0 wild-type seeds</td>
			<td>Nottingham Arabidopsis Stock Center</td>
			<td>N1093</td>
			<td>Wild type seeds (sensitive to kanamycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583&#8211;2599). Available on request from the authors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628188</td>
			<td>Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog medium including vitamins</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0222</td>
			<td>Standard medium for plant sterile culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller</td>
			<td>Brand</td>
			<td>26300</td>
			<td>Used to operate the serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tube 1</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9591.1</td>
			<td>Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tube 2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9587.1</td>
			<td>Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve&#160; (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap with connectors</td>
			<td>Roth</td>
			<td>PY86.1</td>
			<td>2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Brand</td>
			<td>27823</td>
			<td>Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shakeret al.</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technical ethanol</td>
			<td>ITW Reagents (Nova Chimica Srl)</td>
			<td>212800</td>
			<td>Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>655205</td>
			<td>Non-ionic detergent acting as surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal tubing connectors</td>
			<td>Roth</td>
			<td>Y523.1</td>
			<td>Can be used to improve/simplify tubing connections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>WP6222050</td>
			<td>Used for making the suction device</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput, robust and highly time-flexible method for surface sterilization of arabidopsis seeds

Arabidopsis é de longe a espécie modelo vegetal mais utilizada para estudos funcionais. A esterilização superficial das sementes arabidopsis é um passo fundamental necessário para este fim. Assim, é primordial estabelecer métodos de esterilização superficial de sementes arabidopsis de alto rendimento para lidar com dezenas a centenas de amostras (por exemplo, linhas transgênicas, ecotipos ou mutantes) ao mesmo tempo. Um método de esterilização de superfície de sementes baseado na eliminação eficiente de líquido em tubos com um dispositivo de sucção caseiro construído a partir de uma bomba de vácuo comum é apresentado neste estudo. Reduzindo drasticamente o tempo prático com este método manuseando várias centenas de amostras em um dia é possível com pouco esforço. As análises do curso-período da série indicaram ainda uma faixa de tempo altamente flexível de esterilização superficial, mantendo altas taxas de germinação. Este método poderia ser facilmente adaptado para esterilização superficial de outros tipos de pequenas sementes com simples personalização do dispositivo de sucção de acordo com o tamanho da semente, e a velocidade desejada para eliminar o líquido.

Para avaliar o tempo necessário para todo o procedimento de esterilização de sementes, foram calculadas as diferenças de tempo para o manuseio líquido de 96 amostras no protocolo atual e comparadas com os métodos tradicionais de pipetação. O resultado indica que o protocolo atual economiza tempo, cortando o tempo de manuseio líquido para um quarto disso com os protocolos tradicionais(Tabela 1). A tabela destaca ainda que o tempo de remoção de líquidos no protocolo atual economiza mais tempo d...

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High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds

É fornecido um protocolo de alta produtividade para a esterilização superficial de sementes arabidopsisthaliana (Arabidopsis), otimizando as etapas de manuseio líquido com um simples dispositivo de sucção construído com uma bomba de vácuo. Centenas de amostras de sementes podem ser esterilizadas em um dia.

Método de alta produtividade, robusto e altamente flexível para esterilização superficial de sementes arabidopsis

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental ...

Este protocolo melhora a esterilização da superfície das sementes, um passo fundamental na genômica funcional da espécie modelo Arabidopsisthaliana. As principais vantagens dessa técnica são facilidade e alto rendimento, permitindo o processamento de centenas de amostras por dia. Com algumas modificações simples, este método pode ser aplicado a muitas outras espécies de plantas modelo e não-modelo.Para usuários iniciantes, preste atenção à temperatura do meio e à velocidade de centrifugação, pois ambos são críticos para a sobrevivência das sementes. Para começar, prepare 70% de etanol adicionando 95% de etanol técnico à água destilada e misturando bem. Em seguida, prepare a solução de 5% de alvejante adicionando cinco mililitros de alvejante doméstico a 95 mililitros de água destilada estéril.Em seguida, adicione algumas gotas de detergente noniônico à solução de alvejante e misture bem. Em seguida, prepare o meio Murashige e Skoog de meia resistência adicionando 2,2 gramas de pó médio ms, incluindo vitaminas e 10 gramas de sacarose em 800 mililitros de água destilada. Ajuste o pH do médio para 5,7 usando um hidróxido de potássio molar e leve o volume até um litro usando água destilada.Alíquota de 500 mililitros do meio em uma garrafa de um litro, e adicione quatro gramas de ágar para preparar um meio sólido. Após a autoclavagem, deixe o meio esfriar até 50 a 53 graus Celsius em um banho de água. Em seguida, despeje-o em pratos petri sob o capô de fluxo laminar.Para preparar o meio seletivo, adicione kanamicina ao meio e despeje-a em pratos de Petri, como demonstrado anteriormente. Para configurar o aspirador, conecte a entrada da bomba de vácuo a uma extremidade de um tubo de polietileno de tamanho adequado. Em seguida, conecte a outra extremidade do tubo à saída da tampa bidirenal da garrafa de decantação.Enrole firmemente a junção do tubo com uma película de vedação para garantir a conexão hermética. Em seguida, conecte um segundo tubo de polietileno à entrada da tampa do parafuso na garrafa de decantação. Em seguida, conecte o outro lado do tubo à saída de uma válvula de aquário equipada com um fino tubo de polietileno.Se necessário, enrole a junção com o filme de vedação para eliminar o vazamento de ar. Depois de rotular dois lotes de tubos de microcentrífa de 1,5 mililitro com números progressivos, adicione 100 a 200 sementes arabidopsis a cada um dos 96 tubos de microcentrifuus estéreis, aproximadamente um a dois milímetros acima da parte inferior da extremidade cônica do tubo. Em seguida, usando uma pipeta serológica estéril de 10 mililitros, adicione cerca de um mililitro de 70% de etanol em cada tubo e feche cuidadosamente as tampas.Agite os tubos em uma frequência de oscilação de oito hertz por três minutos em um shaker. Em seguida, remova os adaptadores do agitador e transfira-os para a cesta de um microcentrifuuge benchtop para girar as sementes usando a função de pulso. Depois de transferir os tubos para um rack, abra todos os tubos sob o capô de fluxo laminar.Não toque na parte das tampas que se encaixam nos tubos para evitar contaminação. Em seguida, sob a capa de fluxo laminar, coloque uma ponta amarela de 200 microliteres estérei na entrada da válvula de aquário do aspirador caseiro, e ligue a bomba. Insira a ponta logo acima do nível das sementes para evitar tocar nas sementes ao sugar o líquido.Em seguida, usando uma pipeta serológica estéril de 10 mililitros, aliquot um mililitro de solução de alvejante de 5% em cada tubo. Feche as tampas antes de colocar os tubos de volta nos adaptadores do agitador e, em seguida, agite os tubos como demonstrado anteriormente. Depois de girar as sementes usando a função de pulso de uma centrífuga no topo do banco, coloque uma nova ponta amarela de 200 microliter estéril na válvula do aquário e ligue a bomba.Insira a ponta acima do nível das sementes para evitar tocar nas sementes ao sugar a solução de alvejante. Em seguida, usando uma pipeta serológica estéril de 10 mililitros, aliquot um mililitro de água esterilizada em cada tubo. Depois de encaixar uma nova ponta amarela de 200 microliter estéril na válvula do aquário, ligue a bomba.Insira a ponta logo acima do nível das sementes para evitar tocar nas sementes ao sugar a água. Finalmente, alíquota de 500 microliters de água esterilizada em cada tubo, e feche todas as tampas na capa de fluxo laminar. As sementes estão prontas para serem semeadas.Se necessário, mantenha os tubos em temperatura ambiente por até algumas horas ou a quatro graus Celsius durante a noite. Usando uma pipeta de um mililitro, transfira as sementes com 300 a 400 microliters de água estéril em uma placa de Petri. Depois de transferir 10 tubos, despeje 1,5 a dois mililitros de murashige de meia-força derretido e meio Skoog sem antibióticos em cada placa.Gire rapidamente a placa para distribuir as sementes e tape as placas em lados opostos. Enrole as placas em papel alumínio ou papel alumínio e coloque-as em uma geladeira por três dias no escuro para obter germinação uniforme. As análises de germinação realizadas nos dias dois, três, quatro e sete não indicaram diferenças significativas entre 10 a 40 minutos de tempo de esterilização com 70% de etanol.No entanto, quando o tempo de esterilização excedeu 40 minutos, as taxas de germinação diminuíram. Correspondentemente, as taxas de emergência de cotyledon verde também diminuíram. Com base no estudo, foram selecionados três minutos para 70% de etanol e três minutos para alvejante de 5%, como o tempo mínimo para esterilizar as sementes.Para demonstrar que as sementes utilizadas originalmente estavam contaminadas com microrganismos, as sementes não estéreis foram semeadas diretamente nas placas. Em comparação com as sementes estéreis, as sementes não estéreis apresentaram uma aparência fúngica após dois dias, que se espalharam por todas as placas após uma germinação de sete dias. Um ensaio de contaminação cruzada realizado usando uma única ponta de pipeta estéril para processar diferentes amostras de sementes mostrou que não foram observados cotilledons verdes nas sementes genótipos columbia-0 semeadas em placas com kanamicina.Em paralelo, na Columbia-0 sementes semeadas em placas sem kanamicina, todos os cotilledons apareceram verdes após a germinação. Estes resultados indicam que não há transferência de contaminação entre as amostras, apesar de usar uma única ponta de pipeta para remover a solução estéril. Este procedimento é a base para muitos outros métodos de genômica funcional, como superexpressão genética, edição de genomas, localização subcelular, atividade do promotor e interações proteína-proteína e proteína-DNA.

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