Name: high-throughput, robust and highly time-flexible method for surface sterilization of arabidopsis seeds
Uploaded: 2021-10-04T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds at JoVE.com

Denna forskning finansierades av den autonoma provinsen Trento genom kärnfinansiering av Ecogenomics-gruppen Fondazione E. Mach.

1. Reagenser och medieförberedelser
<ol><li>Förbered 70% etanollösning: Tillsätt 737 ml 95% teknisk etanol till 263 ml destillerat vatten. Blanda ordentligt. OBS: Förbered 70% etanollösning på en icke-steril arbetsbänk. VARNING: Etanol är mycket brandfarligt och kan orsaka allvarlig irritation i ögonen. Håll dig borta från lågor och värmekällor. Vid kontakt med ögonen, skölj med rikligt med vatten.</li>
	<li>Förbered 5% blekmedelslösning: Tillsätt 5 ml hushållsblekmedel (innehållande ~3,5% n...

<ol>
	<li>Somerville, C., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fortunate+choice:+The+history+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">A fortunate choice: The history of Arabidopsis as a model plant.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (11), 883-889 (2002).</li><li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).</li><li>Initiative, T. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+genome+sequence+of+the+flowering+plant+Arabidopsis+thaliana.">Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.</a> Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).</li><li>Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-DNA+as+an+insertional+mutagen+in+Arabidopsis.">T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 11 (12), 2283-2290 (1999).</li><li>Speulman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-component+enhancer-inhibitor+transposon+mutagenesis+system+for+functional+analysis+of+the+arabidopsis+genome.">A two-component enhancer-inhibitor transposon mutagenesis system for functional analysis of the arabidopsis genome.</a> Plant Cell. 11 (10), 1853-1866 (1999).</li><li>Jander, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethylmethanesulfonate+saturation+mutagenesis+in+Arabidopsis+to+determine+frequency+of+herbicide+resistance.">Ethylmethanesulfonate saturation mutagenesis in Arabidopsis to determine frequency of herbicide resistance.</a> Plant Physiology. 131 (1), 139-146 (2003).</li><li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. -. S., Niu, Q. -. W., Chua, N. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method.">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).</li><li>Togninalli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AraPheno+and+the+AraGWAS+catalog+2020:+A+major+database+update+including+RNA-Seq+and+knock-out+mutation+data+for+Arabidopsis+thaliana.">AraPheno and the AraGWAS catalog 2020: A major database update including RNA-Seq and knock-out mutation data for Arabidopsis thaliana.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 1063-1068 (2020).</li><li>Lan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AtMAD:+Arabidopsis+thaliana+multi-omics+association+database.">AtMAD: Arabidopsis thaliana multi-omics association database.</a> Nucleic Acids Research. 49 (1), 1445-1451 (2021).</li><li>Xu, J., Trainotti, L., Li, M., Varotto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+isoprene+synthase+affects+ABA-and+drought-related+gene+expression+and+enhances+tolerance+to+abiotic+stress.">Overexpression of isoprene synthase affects ABA-and drought-related gene expression and enhances tolerance to abiotic stress.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-21 (2020).</li><li>Czarnecki, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+knock-down+of+six+non-family+genes+using+a+single+synthetic+RNAi+fragment+in+Arabidopsis+thaliana.">Simultaneous knock-down of six non-family genes using a single synthetic RNAi fragment in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 12 (1), 1-11 (2016).</li><li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high-efficiency+genome+editing+in+arabidopsis+using+YAO+promoter-driven+CRISPR/Cas9+system.">high-efficiency genome editing in arabidopsis using YAO promoter-driven CRISPR/Cas9 system.</a> Molecular Plant. 8 (12), 1820-1823 (2015).</li><li>Liu, Y., Gao, Y., Gao, Y., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+of+floral+development+genes+in+Arabidopsis+with+CRISPR/Cas9+using+the+RNA+endoribonuclease+Csy4+processing+system.">Targeted deletion of floral development genes in Arabidopsis with CRISPR/Cas9 using the RNA endoribonuclease Csy4 processing system.</a> Horticulture Research. 6 (1), (2019).</li><li>Grefen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+and+in+vivo+interactions+of+the+Arabidopsis+thaliana+ethylene+receptor+family+members.">Subcellular localization and in vivo interactions of the Arabidopsis thaliana ethylene receptor family members.</a> Molecular Plant. 1 (2), 308-320 (2008).</li><li>Gazzani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+MIR168+paralogs+in+Brassicaceae.">Evolution of MIR168 paralogs in Brassicaceae.</a> BMC Evolutionary Biology. 9 (1), (2009).</li><li>Lee, S., Korban, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+Arabidopsis+thaliana+phytochelatin+synthase+(AtPCS1)+by+cadmium+during+early+stages+of+plant+development.">Transcriptional regulation of Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase (AtPCS1) by cadmium during early stages of plant development.</a> Planta. 215 (4), 689-693 (2002).</li><li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+FRET-FLIM+reveals+cell-type-specific+protein+interactions+in+Arabidopsis+roots.">In vivo FRET-FLIM reveals cell-type-specific protein interactions in Arabidopsis roots.</a> Nature. 548 (7665), 97-102 (2017).</li><li>Freire-Rios, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+DNA+elements+mediating+ARF+transcription+factor+binding+and+auxin-responsive+gene+expression+in+Arabidopsis.">Architecture of DNA elements mediating ARF transcription factor binding and auxin-responsive gene expression in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24557-24566 (2020).</li><li>Rivero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+arabidopsis+plants:+Growth,+preservation+of+seeds,+transformation,+and+genetic+crosses.">Handling arabidopsis plants: Growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses.</a> Methods in Molecular Biology. 1062, 3-25 (2014).</li><li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+and+salt+stress+tolerance+of+an+arabidopsis+glutathione+S-transferase+U17+knock-out+mutant+are+attributed+to+the+combined+effect+of+glutathione+and+abscisic+acid.">Drought and salt stress tolerance of an arabidopsis glutathione S-transferase U17 knock-out mutant are attributed to the combined effect of glutathione and abscisic acid.</a> Plant Physiology. 158 (1), 340-351 (2012).</li><li>Li, D. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+a+large+dataset+indicates+that+internal+transcribed+spacer+(ITS)+should+be+incorporated+into+the+core+barcode+for+seed+plants.">Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (49), 19641-19646 (2011).</li><li>Mathur, J., Koncz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+maintenance+of+cell+suspension+cultures.+Arabidopsis+Protocols.">Establishment and maintenance of cell suspension cultures. Arabidopsis Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 82, 27-30 (1998).</li><li>Li, M., Cappellin, L., Xu, J., Biasioli, F., Varotto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+for+in+planta+characterization+of+VOC+biosynthetic+genes+by+PTR-ToF-MS.">High-throughput screening for in planta characterization of VOC biosynthetic genes by PTR-ToF-MS.</a> Journal of Plant Research. 133 (1), 123-131 (2020).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+recapitulation+of+isoprene+synthase+evolution+from+ocimene+synthases.">In planta recapitulation of isoprene synthase evolution from ocimene synthases.</a> Molecular Biology and Evolution. 34 (10), 2583-2599 (2017).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+isoprene+emission+in+Arecaceae+(palms).">Evolution of isoprene emission in Arecaceae (palms).</a> Evolutionary Applications. 14, 902-914 (2020).</li><li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bio+assays+with+tobacco+tissue+cultures.">A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures.</a> Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).</li><li>Bent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+method.">Arabidopsis thaliana floral dip transformation method.</a> Methods in Molecular Biology. 343, 87-104 (2006).</li><li>Lundberg, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+core+Arabidopsis+thaliana+root+microbiome.">Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome.</a> Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).</li><li>Tkacz, A., Cheema, J., Chandra, G., Grant, A., Poole, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+succession+of+the+rhizosphere+microbiota+depends+upon+plant+type+and+soil+composition.">Stability and succession of the rhizosphere microbiota depends upon plant type and soil composition.</a> ISME Journal. 9 (11), 2349-2359 (2015).</li><li>Singh, N., Gaddam, S. R., Singh, D., Trivedi, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+arsenic+stress+response+by+ethylene+biosynthesis+and+signaling+in+Arabidopsis+thaliana.">Regulation of arsenic stress response by ethylene biosynthesis and signaling in Arabidopsis thaliana.</a> Environmental and Experimental Botany. 185, 104408 (2021).</li><li>Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+method+for+high-throughput+sterilization+of+Arabidopsis+seeds.">Standardized method for high-throughput sterilization of Arabidopsis seeds.</a> Journal of Visualized Experiments: JOVE. (128), e56587 (2017).</li><li>Acemi, A., &#214;zen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+in+vitro+asymbiotic+seed+germination+protocol+for+Serapias+vomeracea.">Optimization of in vitro asymbiotic seed germination protocol for Serapias vomeracea.</a> The EuroBiotech Journal. 3 (3), 143-151 (2019).</li></ol>

Sterilisering av frön är det grundläggande steget för funktionella studier i arabidopsis. Även om det ofta utförs för många olika ändamål, finns begränsade studier om hög genomströmning utsäde ytan sterilisering i Arabidopsis tillgängliga.
Hittills använder en av metoderna med högsta genomströmning klorgas som genereras genom att blanda blekmedel med koncentrerad HCl. Även om denna metod kräver begränsad praktisk tid, använder den en gas som är mycket giftig för männis...

Arabidopsis är en diploid växtart som tillhör familjen Brassicaceae. Dess relativt korta livscykel (två månader per generation under långa växtförhållanden), liten växtstorlek och självbestämning med produktion av hundratals frön per växt har gjort det till den första grundläggande växtmodellarten1,2. Dessutom var dess genom heltsekvenserade 3, omfattande omvända genetikverktyg (mättat T-DNA, transposon och kemiskt mutageniserade populationer) finns tillgängliga4,5,6,och effektiv Agrobacterium-medieradomvandling är väletablerad för att erhålla tillräckliga transgena linjer för ytterligare nedströmsarbete7 . Således har stora framsteg gjorts under de senaste två decennierna med arabidopsis som modellart för att dissekera olika aspekter av växtbiologi på molekylär nivå, inklusive naturlig, genetisk och fenotypisk variation8,9.
För att funktionellt karakterisera gener av intresse för arabidopsis är sådd ytsterilisering för att eliminera svamp- och bakterieföroreningar det nödvändiga steget för många nedströmsprotokoll som kräver yxkulturer. Genetisk omvandling för överuttryck10, knock-down (RNA-I11) eller knock-out (genomredigering12,13) av genfunktion, subcellulärlokalisering 14, promotoraktivitet15,16, proteinprotein17 och protein-DNA-interaktion18, för att citera endast de vanligaste applikationerna, alla kräver en fröyta sterilisering steg. Således, trots sin relativa enkelhet, spelar fröytan sterilisering en grundläggande roll i många funktionella analyser.
Hittills har två huvudkategorier av steriliseringsmetoder för fröytor utvecklats baserat antingen på gas- eller vätskefassterilisering19. Medan genomströmningen av gasfasfröytan sterilisering är medelhög till hög, har användningen av den farliga reagensklorgasen som ytsteriliseringsmedel hindrat dess breda tillämpning. Metoder baserade på sterilisering i vätskefas förlitar sig tvärtom på mildare kemikalier som etanol och blekmedelslösningar för ytsterilisering, och de används mer i stor utsträckning trots att de har en i sig lägre genomströmning än klorrorkomigation. I allmänhet används ofta två olika metoder som använder flytande reagenser. En metod som till stor del används är baserad på tvättning med etanol och blekmedel vid olika koncentrationer under olikatidsperioder 20,21. En annan metod är baserad på applicering av blekmedel endast21,22. Båda metoderna tillämpas främst för småskalig sterilisering av fröytan. Men i många experiment är det nödvändigt att screena många Arabidopsis transgena linjer som härrör från en omvandling15,23 eller skärm parallellt många transgena linjer som genereras från olika omvandlingar24,25. Såvitt vi vet har ingen vätskebaserad metod för hög genomströmning frö yta sterilisering publicerats, vilket utgör, även om föga erkända, en viktig flaskhals för funktionella genomik metoder. Därför är utveckling av säkra, robusta och höggenomströmningsmetoder för sterilisering av fröytan ett nödvändigt och kritiskt steg mot framgången för den funktionella karakteriseringen av många gener samtidigt.
För detta ändamål presenteras i den aktuella studien en förbättrad metod för ytsterilisering av Arabidopsisfrön. Denna metod är säker, låg kostnad, mycket robust och hög genomströmning, vilket möjliggör hantering av 96 oberoende linjer inom en timme från början av fröytan sterilisering till slutet av frösådd i Petri-rätter. Metoden som demonstreras bygger på allmänt tillgänglig, grundläggande laboratorieinstrumentering som en vakuumpump, förbrukningsglas och plastvaror. Denna förbättrade metod ger forskarsamhället ett säkert, enkelt och prisvärt tillvägagångssätt för att effektivisera sterilisering av fröytan med en genomströmning som är tillräcklig för moderna funktionella genomikmetoder i Arabidopsis och andra icke-modell växtarter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aquarium valve</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B074CYC5SD</td>
			<td>Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis Col-0 wild-type seeds</td>
			<td>Nottingham Arabidopsis Stock Center</td>
			<td>N1093</td>
			<td>Wild type seeds (sensitive to kanamycin)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583&#8211;2599). Available on request from the authors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628188</td>
			<td>Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog medium including vitamins</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0222</td>
			<td>Standard medium for plant sterile culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller</td>
			<td>Brand</td>
			<td>26300</td>
			<td>Used to operate the serological pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tube 1</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9591.1</td>
			<td>Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tube 2</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9587.1</td>
			<td>Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve&#160; (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap with connectors</td>
			<td>Roth</td>
			<td>PY86.1</td>
			<td>2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Brand</td>
			<td>27823</td>
			<td>Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shakeret al.</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td>TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technical ethanol</td>
			<td>ITW Reagents (Nova Chimica Srl)</td>
			<td>212800</td>
			<td>Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>655205</td>
			<td>Non-ionic detergent acting as surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal tubing connectors</td>
			<td>Roth</td>
			<td>Y523.1</td>
			<td>Can be used to improve/simplify tubing connections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>WP6222050</td>
			<td>Used for making the suction device</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput, robust and highly time-flexible method for surface sterilization of arabidopsis seeds

Arabidopsis är den överlägset växtmodellart som används mest för funktionella studier. Ytsteriliseringen av Arabidopsisfrön är ett grundläggande steg som krävs mot detta ändamål. Därför är det av största vikt att fastställa arabidopsislindsteriliseringsmetoder med hög genomströmning för att hantera tiotals till hundratals prover (t.ex. transgena linjer, ekotyper eller mutanter) på en gång. En steriliseringsmetod för fröytan baserad på effektiv eliminering av vätska i rör med en hemlagad suganordning konstruerad från en gemensam vakuumpump presenteras i denna studie. Genom att dramatiskt minska arbetsintensiv praktisk tid med denna metod är det möjligt att hantera flera hundra prover på en dag med liten ansträngning. Seriens tidskursanalyser visade vidare ett mycket flexibelt tidsintervall för ytsterilisering genom att upprätthålla höga spiringshastigheter. Denna metod kan enkelt anpassas för ytsterilisering av andra typer av små frön med enkel anpassning av suganordningen enligt fröstorleken och den hastighet som önskas för att eliminera vätskan.

För att bedöma den tid som krävs för hela steriliseringsförfarandet för utsäde beräknades tidsskillnaderna för vätskehantering 96 prover i det nuvarande protokollet och jämfördes med traditionella pipetteringsmetoder. Resultatet indikerar att det aktuella protokollet sparar tid, vilket minskar vätskehanteringstiden till en fjärdedel av det med de traditionella protokollen(tabell 1). Tabellen belyser vidare att vätskeborttagningstiden i det nuvarande protokollet sparar mer tid än de tradit...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds at JoVE.com

High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds

Ett protokoll med hög genomströmning för ytsterilisering av Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) frön tillhandahålls, vilket optimerar vätskehanteringsstegen med en enkel suganordning konstruerad med en vakuumpump. Hundratals fröprover kan ytsteriliseras på en dag.

Hög genomströmning, robust och mycket tidsflexibel metod för ytsterilisering av arabidopsisfrön

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental ...

Detta protokoll förbättrar fröytan sterilisering, ett grundläggande steg i funktionell genomik av modellarten Arabidopsisthaliana. De främsta fördelarna med denna teknik är enkel och hög genomströmning, vilket möjliggör bearbetning av hundratals prover per dag. Med några enkla modifieringar kan denna metod tillämpas på många andra modell- och icke-modellväxtarter.För första gången användare, var uppmärksam på temperaturen på mediet och centrifugeringshastigheten eftersom de båda är avgörande för frööverlevnad. Till att börja med, förbered 70% etanol genom att tillsätta 95% teknisk etanol till destillerat vatten och blanda noggrant. Förbered sedan 5% blekmedelslösning genom att tillsätta fem milliliter hushållsblekmedel till 95 ml sterilt destillerat vatten.Tillsätt sedan några droppar nonioniskt tvättmedel till blekmedelslösningen och blanda noggrant. Förbered sedan halvhållfasta Murashige- och Skoog-medium genom att tillsätta 2,2 gram MS-mediumpulver inklusive vitaminer och 10 gram sackaros i 800 milliliter destillerat vatten. Justera pH-värdet på mediet till 5,7 med en molar kaliumhydroxid och ta sedan upp volymen till en liter med destillerat vatten.Aliquot 500 milliliter av mediet i en enliterflaska och tillsätt fyra gram agar för att förbereda ett fast medium. Efter autoklavering, låt mediet svalna till 50 till 53 grader Celsius i ett vattenbad. Häll sedan det i Petri-rätter under den laminära flödeshuven.För att förbereda selektivt medium, tillsätt kanamycin till mediet och häll det i Petri-rätter som visats tidigare. För att ställa in aspiratorn, anslut vakuumpumpinloppet till ena änden av ett polyetenrör av lämplig storlek. Anslut sedan den andra änden av röret till utloppet på tvåvägslocket på dekantantationsflaskan.Linda slangens korsning tätt med en tätningsfilm för att säkerställa lufttät anslutning. Anslut sedan ett andra polyetenrör till skruvlockets inlopp på dekantationsflaskan. Anslut sedan den andra sidan av röret till utloppet av en akvarieventil utrustad med ett tunt polyetenrör.Om det behövs, linda korsningen med tätningsfilmen för att eliminera luftläckage. Efter märkning av två partier av 48 1,5 milliliter mikrocentrifugerör med progressiva siffror, tillsätt 100 till 200 Arabidopsisfrön till var och en av de 96 sterila mikrocentrifugerören, ungefär en till två millimeter ovanför botten av rörets koniska ände. Därefter, med hjälp av en 10-milliliter steril serologisk pipett, tillsätt cirka en milliliter 70% etanol i varje rör och stäng försiktigt locken.Skaka rören med en svängningsfrekvens på åtta hertz i tre minuter i en shaker. Ta sedan bort adaptrarna från skakapparaten och överför dem till korgen på en bänkskiva mikrocentrifuge för att snurra ner fröna med hjälp av pulsfunktionen. Efter att ha överfört rören till ett rack, öppna alla rör under den laminära flödeshuven.Rör inte vid den del av locken som är insatt i rören för att undvika kontaminering. Montera sedan en steril 200-mikroliter gul spets under den laminära flödeshuven på akvarieventilinloppet hos den hemlagade aspiratorn och slå på pumpen. Sätt i spetsen strax ovanför frönas nivå för att undvika att röra fröna när du suger vätskan.Därefter, med hjälp av en 10-milliliter steril serologisk pipett, alikvot en milliliter 5% blekmedelslösning i varje rör. Stäng locken innan du sätter tillbaka rören i skakningsadaptern och skaka sedan rören som visats tidigare. Efter att ha snurrat ner fröna med hjälp av pulsfunktionen hos en bänkcentrifufuger, montera en ny steril 200-mikroliter gul spets på akvarieventilen och slå på pumpen.Sätt in spetsen ovanför frönas nivå för att undvika att röra fröna när du suger blekmedelslösningen. Därefter, med hjälp av en 10-milliliter steril serologisk pipett, alikvot en milliliter steriliserat vatten i varje rör. Efter att ha monterat en ny steril 200-mikroliter gul spets på akvarieventilen, slå på pumpen.Sätt in spetsen strax ovanför frönas nivå för att undvika att röra fröna när du suger vattnet. Slutligen, aliquot 500 mikroliter steriliserat vatten i varje rör och stäng alla lock i laminär flödeshuven. Fröna är nu redo att sås.Vid behov, håll rören i rumstemperatur i upp till några timmar eller vid fyra grader Celsius över natten. Överför fröna med 300 till 400 mikroliter sterilt vatten med en en milliliter pipett. Efter överföring av 10 rör, häll 1,5 till två milliliter smält halv styrka Murashige och Skoog medium utan antibiotika i varje tallrik.Virvla snabbt plattan för att fördela fröna och tejpa plattorna på motsatta sidor. Linda plattorna i plast- eller aluminiumfolie och placera dem i kylskåp i tre dagar i mörkret för att få enhetlig spiring. Spiring analyser utförs på dag två, tre, fyra och sju anges inga betydande skillnader mellan 10 till 40 minuter sterilisering tid med 70%etanol.Men när steriliseringstiden överskred 40 minuter minskade spiringsgraden. På motsvarande sätt minskade också gröna cotyledon-uppkomsten. Baserat på studien valdes tre minuter för 70% etanol och tre minuter för 5% blekmedel som minimitid för att sterilisera fröna.För att visa att de frön som ursprungligen användes ursprungligen var förorenade med mikroorganismer såddes icke-sterila frön direkt på plattorna. Jämfört med sterila frön visade icke-sterila frön ett svamputseende efter två dagar, som spred sig över plattorna efter en sju dagars spiring. En korskontamineringsanalys utförd med hjälp av en enda steril pipettspets för att bearbeta olika fröprover visade att inga gröna cotyledons observerades i Columbia-0 genotypfrön sådda i plattor med kanamycin.Parallellt, i Columbia-0 frön sådda i plattor utan kanamycin, verkade alla cotyledons gröna efter spiring. Dessa resultat indikerar ingen överföring av kontaminering mellan proverna trots att man använder en enda pipettspets för att avlägsna den sterila lösningen. Denna procedur är grunden för många andra funktionella genomikmetoder som genöveruttryck, genomredigering, subcellulär lokalisering, promotoraktivitet och protein-protein och protein-DNA-interaktioner.

Research

JoVE Journal

Biology

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

En hög genomströmning Metod för Zebrafish Spermier Frysförvaring och In Vitro Befruktning

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

En snabb hög kapacitet metod för kartläggning Ribonucleoproteins (RNPs) om mänskliga pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: En metod för odling Arabidopsis Och tomatplantor i 96-brunnar för high-throughput Genotypning

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Hög genomströmning Kristallisering av membranproteiner Använda Lipidic Bicelle Metod

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

En hög genomströmning metod för mätning av glomerulär filtration Rate i medveten möss

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Effektiv och snabb isolering av tidigt stadium embryon från<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Frön

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

Mycket effektiv Ligering av små RNA-molekyler för MicroRNA Kvantifiering av hög genomströmning sekvense

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Återvinning av vuxna zebrafisk Hjärtan för hög genomströmning Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Hög kapacitet Screening för kemiska modulatorer av Post-transkription Reglerade Gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...