Name: measuring mitochondrial substrate flux in recombinant perfringolysin o-permeabilized cells
Uploaded: 2021-08-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells at JoVE.com

Forfatterne takker de ansatte på Institut for Fysiologi på Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet i Hradec Králové og Institut for Patofysiologi på Det Tredje Sundhedsvidenskabelige Fakultet for hjælp til fremstilling af kemikalier og prøver. Dette arbejde blev støttet af Charles University tilskud programmer PROGRES Q40/02, tjekkiske sundhedsministerium tilskud NU21-01-00259, Tjekkisk Videnskab Foundation tilskud 18-10144 og INOMED projekt CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 finansieret af Ministeriet for Uddannelse, Ungdom og Sport i Tjekkiet og af Den Europæiske Union.

1. En dag før analysen
<ol><li>Fremstilling af reagenser og substrater.<ol>
<li>Mitokondrieanalyseopløsning (MAS): Udarbejde lageropløsninger af alle reagenser som beskrevet i tabel 1. Varm lagrene af mannitol og saccharose til 37 °C for at opløses fuldstændigt. Bland reagenserne til fremstilling af 2x MAS, og varm derefter blandingen til 37 °C. Juster pH med 5N KOH til 7,4 (~7 mL), tilsæt derefter vand for at bringe volumen op til 1 L. Filtersterilisation og opbevar aliquots ved -20 °C indti...

<ol>
	<li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion.">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li><li>Murphy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function,+biology,+and+role+in+disease:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).</li><li>Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+key+role+of+anaplerosis+and+cataplerosis+for+citric+acid+cycle+function.">The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).</li><li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics 3. , (2002).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Sta&#328;kov&#225;, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+mitochondrial+substrate+flux+in+a+mouse+model+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101 (2020).</li><li>Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+measurement+of+respiratory+activity+in+permeabilized+cells+using+extracellular+flux+analysis.">Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).</li><li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinediones+are+acute,+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier.">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).</li><li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode.">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li><li>Elkalaf, M., T&#367;ma, P., Weiszenstein, M., Pol&#225;k, J., Trnka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+probe+Methyltriphenylphosphonium+(TPMP)+inhibits+the+Krebs+cycle+enzyme+2-Oxoglutarate+dehydrogenase.">Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase.</a> PLoS One. 11 (8), 0161413 (2016).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), 21746 (2011).</li></ol>

Denne protokol er en ændring af tidligere offentliggjorte undersøgelser7,8,9,10 og produktbrugervejledningen. I modsætning til producentens protokol anvendes 2x MAS i stedet for 3x MAS, da 2× MAS er lettere at opløse og ikke danner nedbør efter frysning. Frosne 2x MAS aliquots kan opbevares op til seks måneder og vise ensartede resultater. En anden forskel er at inkludere ADP i komponent...

Mikropladebaseret respirometri har revolutioneret mitokondrieforskning ved at muliggøre studiet af cellulært åndedræt af en lille prøvestørrelse1. Cellulær respiration betragtes generelt som en indikator for mitokondriefunktion eller 'dysfunktion', på trods af at mitokondriespektret af funktioner strækker sig ud over energiproduktion2. Under aerobe forhold udvinder mitokondrier den energi, der lagres i forskellige substrater, ved at nedbryde og omdanne disse substrater til metaboliske mellemprodukter, der kan give næring tilcitronsyrecyklussen 3 (Figur 1). Den kontinuerlige flux af substrater er afgørende for strømmen af citronsyre cyklus til at generere høj energi 'elektron donorer', som leverer elektroner til elektron transport kæde, der genererer en proton gradient på tværs af den indre mitokondriemembran, gør det muligt ATP-synthase at fosforylatere ADP til ATP4. Derfor skal et eksperimentelt design til analyse af mitokondrie respiration omfatte prøven naturen (intakte celler, permeabilized celler, eller isolerede mitokondrier) og mitokondrie substrater.
Celler holder et lager af indfødte substrater5, og mitokondrier oxiderer flere typer substrater samtidigt6, hvilket komplicerer fortolkningen af resultater fra eksperimenter udført på intakte celler. En fælles tilgang til at undersøge mitokondrie evne til at oxidere et udvalgt substrat er at isolere mitokondrier eller permeabilize de undersøgte celler5. Selvom isolerede mitokondrier er ideelle til kvantitative undersøgelser, er isolationsprocessen besværlig. Det står over for tekniske vanskeligheder såsom behovet for stor prøvestørrelse, renhed af udbyttet og reproducerbarhed af teknikken5. Permeabiliserede celler tilbyder en løsning til ulemperne ved mitokondrieisolering; rutinemæssige permeabiliseringsmidler af vaskemiddelkarakter er dog ikke specifikke og kan beskadige mitokondriemembraner5.
Rekombinant perfringolysin O (rPFO) blev tilbudt som et selektivt plasmamembranpermeabiliserende middel7, og det blev anvendt med succes i kombination med en ekstracellulær fluxanalysator i flere undersøgelser7,8,9,10. Vi har ændret en protokol ved hjælp af rPFO til at screene mitokondrie substrat flux ved hjælp af XFe96 ekstracellulære flux analysator. I denne protokol sammenlignes fire forskellige substratoxiderende veje i to cellulære fænotyper, mens der er tilstrækkelige replikater og den korrekte kontrol for hvert testet materiale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adinosine 5&#8242; -diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A5285</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8674</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A3803</td>
			<td>store at 2 - 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C2920</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D8418</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>63559</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>03777</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H7523</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(-)Malic acid disodium salt</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M9138</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid sodium salt hydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G5889</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnissium chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M2670</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>O4876</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl-DL-carnitine chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4509</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>484016</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5655</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>R8875</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Wave Desktop Software</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td></td>
			<td>Download from www.agilent.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P2256</td>
			<td>store at 2 - 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S2378</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S7903</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>W3500</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF calibrant</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Plasma membrane permeabilizer</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>102504-100</td>
			<td>Recombinant perfringolysin O (rPFO) - Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring mitochondrial substrate flux in recombinant perfringolysin o-permeabilized cells

Mitokondrie substrat flux er et kendetegn ved hver celletype, og ændringer i dens komponenter såsom transportører, kanaler eller enzymer er involveret i patogenesen af flere sygdomme. Mitokondrie substrat flux kan studeres ved hjælp af intakte celler, permeabilized celler, eller isolerede mitokondrier. Undersøgelse af intakte celler støder på flere problemer på grund af samtidig oxidation af forskellige substrater. Desuden indeholder flere celletyper interne lagre af forskellige substrater, der komplicerer resultatfortolkning. Metoder såsom mitokondrie isolation eller ved hjælp af permeabilizing agenter er ikke let reproducerbare. Isolering af ren mitokondrier med intakte membraner i tilstrækkelige mængder fra små prøver er problematisk. Brug af ikke-selektive permeabilizers forårsager forskellige grader af uundgåelige mitokondrie membran skader. Rekombinant perfringolysin O (rPFO) blev tilbudt som en mere passende permeabilizer, takket være sin evne til selektivt permeabilize plasmamembran uden at påvirke mitokondrie integritet. Når det bruges i kombination med mikroplade respirometri, det gør det muligt at teste flux af flere mitokondrie substrater med nok replikerer inden for et eksperiment, mens du bruger et minimalt antal celler. I dette arbejde beskriver protokollen en metode til at sammenligne mitokondriesubstrat flux af to forskellige cellulære fænotyper eller genotyper og kan tilpasses til at teste forskellige mitokondrie substrater eller hæmmere.

Start med at normalisere resultaterne til den anden måling af baseline respiration for at vise værdier som iltforbrugsprocent (OCR%). Resultaterne af analysen er vist i figur 5, figur 6, figur 7 og figur 8. Det er vigtigt at tildele de rigtige baggrunds brønde for hver gruppe og inaktivere baggrunds brønde i andre grupper. Figur 5 vise...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells at JoVE.com

Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells

I dette arbejde beskriver vi en modificeret protokol til test af mitokondriesubstratstrømpe ved hjælp af rekombinant perfringolysin O i kombination med mikropladebaseret respirometri. Med denne protokol viser vi, hvordan metformin påvirker mitokondrie respiration af to forskellige tumorcellelinjer.

Måling mitokondrie substrat flux i rekombinant perfringolysin O-Permeabilized celler

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or ...

Fordi det tester mitokondrier substrat flux, der kan blive påvirket med forskellige patologier eller behandlinger. For eksempel vil vi i dag bruge det til at afsløre kræftcellerespons på Metformin-behandling. Det kræver et minimalt antal celler, samtidig med at der er tilstrækkelige replikter og passende kontrol for hvert enkelt materiale.Analysator er kun til forskningsbrug. Denne teknik kan identificere fejl i mitokondrie metabolisme og kan bruges til at evaluere krigere narkotika, der påvirker mitokondrier. Demonstrere proceduren vil være Karolina Vaneckova en bachelorstuderende og forskningstekniker fra mit laboratorium.For at begynde frø A549 celler ved en densitet på 20.000 celler pr. brønd i kolonner, to til 11 af en søhest XF 96 cellekultur mikroplade. Forlader kolonne et og 12 tomme som baggrund brønde. Fyld de tomme brønde med et lige volumen af cellekulturmediet, og inkuber derefter cellerne ved 37 grader Celsius i en befugtet inkubator med 5% kuldioxid til celletilbehør.Efter tre til fire timer tilsættes 100 mikroliter af cellekulturmedie i Wells. Behandl forsøgsgruppekolonnerne syv til 11 med en millimolar Metformin og kontrolgruppen med et tilsvarende volumen sterilt destilleret vand, og returner derefter pladen til inkubatoren. Til fugtning af sensorerne, pipette 200 mikroliter af sterilt vand pr godt ind i utility plade.Sæt derefter forsigtigt sensorpatronen tilbage, mens sensoren nedsænkes i vand. Inkuber patronen i en kuldioxidfri inkubator ved 37 grader Celsius indtil næste dag. Tænd analysator og styreenheden.Start instrumentstyrings- og dataindsamlingssoftwaren, og design analyseprotokollen som beskrevet i tekstmanuskriptet. Under gruppedefinitioner skal du oprette fire injektionsstrategier, hvor port A adskiller sig alt efter det injicerede substrat og navngive strategierne efter substraterne eller forkortelserne. Tildel Oligomycin til port B, FCCP til port C og Rotenone Antimycin En blanding til port D.Create og navngiv otte grupper under pladekortet tildele grupper til de tilsvarende Brønde.Gem derefter protokollen som en skabelon, der er klar til brug. Lad analysatoren tænde for at lade temperaturen stabilisere sig natten over. Den næste dag skal du kassere vandet fra brugspladen og tilsæt 200 mikroliter af den forvarmede calibrant pr. Brønd i brugspladen.Returner patronen til den kuldioxidfrie inkubator indtil tidspunktet for analysen. Opretholde en kilde til fugtighed inde i inkubatoren og slukke eller reducere blæserhastigheden til et minimum, for at undgå hurtig fordampning af calibrant. Forbered fem milliliter af arbejdsopløsningen af substrater og hæmmere med forvarmet to gange mitokondrie assay opløsning, 5% BSA og sterilt vand som beskrevet i tekstmanuskriptet.Læs derefter injektorhavnene med substrat og hæmmere som beskrevet i skattemanuskriptet. For kalibrering under køre assay fanen, skal du klikke på startkørslen for at starte analysen. Sæt den indlæste censorpatron i, og vent på, at kalibreringen er fuldført.Forbered en 20 milliliter analyse medium, ved at blande to gange mitokondrie assay opløsning, sterilt vand og 5% BSA i en 50 milliliter rør. Tilsæt to mikroliter af 10 mikromolar rekombinant perfringolysin O, for at opnå en koncentration af en nanomolar. Og suspendere blandingen igen med blid pipettering, undgå at ryste og hvirvle.Inkuber røret ved 37 grader Celsius indtil brug. Brug en multikanal pipette til at vaske cellerne og de tomme tomme brønde to gange ved hjælp af forvarmet calcium- og magnesiumfri PBS-opløsning. Kassér PBS og tilsæt 180 mikroliter af det forvarmede analysemedium til cellepermeabilisering.Umiddelbart efter permeabilisering udskiftes brugspladen på den kalibrerede sensorpatron med cellepladen, der indeholder permeabiliserede celler, og målingen startes. Behandlingsgruppen havde en højere grad af succinate induceret respiration. A549-cellernes respons på Metformin-behandling var højere end Hep G2. For pyruvat malat induceret respiration, A549 celler viste øget induktion i forhold til Hep G2 celler mellem fem til 15 minutter.Lignende resultater blev opnået for glutamat malat induceret respiration og palmitoylcarnitin malat induceret respiration. For at opnå den rigtige koncentration af substrat og hæmmere. Den rigtige diskenhed skal indlæses i den rigtige port.Når der konstateres en ændring i en metabolisk vej af et bestemt substrat, vil det være nødvendigt at vurdere funktionen af de enzymer og transportører, der er involveret i denne vej.

Research

JoVE Journal

Biology

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Måling Glutathion-induceret Fodring respons i Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

Høj opløsning respirometri at vurdere mitokondrie funktion i permeabiliseret og intakte celler

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Samtidig måling af Mitokondriel Calcium og mitokondriemembranen Potentiale i levende celler ved Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Vurdering af autofagisk fluks ved at måle LC3-, p62- og LAMP1-co-lokalisering ved anvendelse af multispektral billedflowcytometri

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Et grafisk brugergrænseflade til softwareassisteret sporing af proteinkoncentration i dynamiske cellulære protrusioner

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Transient ekspression og Cellulær Lokalisering af rekombinante proteiner i dyrkede insektceller

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Måling af energimetabolisme i eksplanterede retinale væv ved hjælp af ekstracellulære Flux analyse

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...