Name: measuring mitochondrial substrate flux in recombinant perfringolysin o-permeabilized cells
Uploaded: 2021-08-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells at JoVE.com

Les auteurs remercient les membres du personnel du Département de physiologie de la Faculté de médecine de Hradec Králové et du Département de physiopathologie de la Troisième Faculté de médecine pour leur aide à la préparation des produits chimiques et des échantillons. Ce travail a été soutenu par les programmes de subventions de l’Université Charles PROGRES Q40/02, la subvention du ministère tchèque de la Santé NU21-01-00259, la subvention de la Fondation tchèque pour la science 18-10144 et le projet INOMED CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 financé par le ministère de l’Éducation, de la Jeunesse et des Sports de la République tchèque et par l’Union européenne.

1. Un jour avant le test
<ol><li>Préparation des réactifs et des substrats.<ol>
<li>Solution d’essai mitochondrial (MAS) : Préparer des solutions mères de tous les réactifs comme décrit dans le tableau 1. Réchauffer les stocks de mannitol et de saccharose à 37 °C pour les dissoudre complètement. Mélanger les réactifs pour préparer 2x MAS, puis chauffer le mélange à 37 °C. Réglez le pH avec 5N KOH à 7,4 (~ 7 mL), puis ajoutez de l’eau pour porter le volume à 1 L. Filtrez stérili...

<ol>
	<li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion.">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li><li>Murphy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function,+biology,+and+role+in+disease:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).</li><li>Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+key+role+of+anaplerosis+and+cataplerosis+for+citric+acid+cycle+function.">The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).</li><li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics 3. , (2002).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Sta&#328;kov&#225;, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+mitochondrial+substrate+flux+in+a+mouse+model+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101 (2020).</li><li>Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+measurement+of+respiratory+activity+in+permeabilized+cells+using+extracellular+flux+analysis.">Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).</li><li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinediones+are+acute,+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier.">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).</li><li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode.">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li><li>Elkalaf, M., T&#367;ma, P., Weiszenstein, M., Pol&#225;k, J., Trnka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+probe+Methyltriphenylphosphonium+(TPMP)+inhibits+the+Krebs+cycle+enzyme+2-Oxoglutarate+dehydrogenase.">Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase.</a> PLoS One. 11 (8), 0161413 (2016).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), 21746 (2011).</li></ol>

Ce protocole est unemodification des études7,8,9,10 publiées précédemment et du guide de l’utilisateur du produit. Contrairement au protocole du fabricant, 2x MAS est utilisé au lieu de 3x MAS, car 2× MAS est plus facile à dissoudre et ne forme pas de précipitations après le gel. Les aliquotes MAS congelées 2x peuvent être conservées jusqu’à six mois et montrent des résultats ...

La respirométrie à base de microplaques a révolutionné la recherche mitochondriale en permettant l’étude de la respiration cellulaire d’un échantillon de petite taille1. La respiration cellulaire est généralement considérée comme un indicateur de la fonction mitochondriale ou du « dysfonctionnement », malgré le fait que la gamme mitochondriale des fonctions s’étend au-delà de la production d’énergie2. Dans des conditions aérobies, les mitochondries extraient l’énergie stockée dans différents substrats en décomposant et en convertissant ces substrats en intermédiaires métaboliques pouvant alimenter le cycle de l’acide citrique3 (Figure 1). Le flux continu de substrats est essentiel pour que le flux du cycle de l’acide citrique génère des « donneurs d’électrons » à haute énergie, qui délivrent des électrons à la chaîne de transport d’électrons qui génère un gradient de protons à travers la membrane mitochondriale interne, permettant à l’ATP-synthase de phosphoryler ADP en ATP4. Par conséquent, une conception expérimentale pour tester la respiration mitochondriale doit inclure la nature de l’échantillon (cellules intactes, cellules perméabilisées ou mitochondries isolées) et les substrats mitochondriaux.
Les cellules conservent un stock de substrats indigènes5, et les mitochondries oxydent plusieurs types de substrats simultanément6, ce qui complique l’interprétation des résultats obtenus à partir d’expériences réalisées sur des cellules intactes. Une approche courante pour étudier la capacité mitochondriale à oxyder un substrat sélectionné consiste à isoler les mitochondries ou à perméabiliser les cellules étudiées5. Bien que les mitochondries isolées soient idéales pour les études quantitatives, le processus d’isolement est laborieux. Il fait face à des difficultés techniques telles que la nécessité d’un échantillon de grande taille, la pureté du rendement et la reproductibilité de la technique5. Les cellules perméabilisées offrent une solution aux inconvénients de l’isolement mitochondrial; cependant, les agents perméabilisants de routine de nature détergente ne sont pas spécifiques et peuvent endommager les membranes mitochondriales5.
La perfringolysine O recombinante (FPSR) a été proposée comme agent sélectif de perméabilisation de la membraneplasmique 7,et elle a été utilisée avec succès en association avec un analyseur de flux extracellulaire dans plusieurs études7,8,9,10. Nous avons modifié un protocole utilisant rPFO pour filtrer le flux de substrat mitochondrial à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire XFe96. Dans ce protocole, quatre voies d’oxydation de substrat différentes dans deux phénotypes cellulaires sont comparées tout en ayant suffisamment de répliques et le contrôle approprié pour chaque matériau testé.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adinosine 5&#8242; -diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A5285</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8674</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A3803</td>
			<td>store at 2 - 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C2920</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D8418</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>63559</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>03777</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H7523</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(-)Malic acid disodium salt</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M9138</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid sodium salt hydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G5889</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnissium chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M2670</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>O4876</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl-DL-carnitine chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4509</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>484016</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5655</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>R8875</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Wave Desktop Software</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td></td>
			<td>Download from www.agilent.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P2256</td>
			<td>store at 2 - 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S2378</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S7903</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>W3500</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF calibrant</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Plasma membrane permeabilizer</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>102504-100</td>
			<td>Recombinant perfringolysin O (rPFO) - Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring mitochondrial substrate flux in recombinant perfringolysin o-permeabilized cells

Le flux de substrat mitochondrial est une caractéristique distinctive de chaque type de cellule, et des changements dans ses composants tels que les transporteurs, les canaux ou les enzymes sont impliqués dans la pathogenèse de plusieurs maladies. Le flux de substrat mitochondrial peut être étudié à l’aide de cellules intactes, de cellules perméabilisées ou de mitochondries isolées. L’étude de cellules intactes rencontre plusieurs problèmes dus à l’oxydation simultanée de différents substrats. En outre, plusieurs types de cellules contiennent des réserves internes de différents substrats qui compliquent l’interprétation des résultats. Les méthodes telles que l’isolement mitochondrial ou l’utilisation d’agents perméabilisants ne sont pas facilement reproductibles. Isoler des mitochondries pures avec des membranes intactes en quantité suffisante à partir de petits échantillons est problématique. L’utilisation de perméabilisateurs non sélectifs provoque divers degrés de dommages inévitables à la membrane mitochondriale. La perfringolysine O recombinante (FPSR) a été proposée comme perméabilisant plus approprié, grâce à sa capacité à perméabiliser sélectivement la membrane plasmique sans affecter l’intégrité mitochondriale. Lorsqu’il est utilisé en combinaison avec la microflamétrie, il permet de tester le flux de plusieurs substrats mitochondriaux avec suffisamment de répliques dans une expérience tout en utilisant un nombre minimal de cellules. Dans ce travail, le protocole décrit une méthode pour comparer le flux de substrat mitochondrial de deux phénotypes ou génotypes cellulaires différents et peut être personnalisé pour tester divers substrats ou inhibiteurs mitochondriaux.

Commencez par normaliser les résultats à la deuxième mesure de la respiration de base pour afficher des valeurs telles que le pourcentage de taux de consommation d’oxygène (OCR). Les résultats de l’essai sont présentés dans les figures 5, figure 6, figure 7 et figure 8. Il est important d’attribuer les puits de fond appropriés pour chaque groupe et d’in...

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Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells

Dans ce travail, nous décrivons un protocole modifié pour tester le flux de substrat respiratoire mitochondrial en utilisant la perfringolysine O recombinante en combinaison avec la respirométrie à base de microplaques. Avec ce protocole, nous montrons comment la metformine affecte la respiration mitochondriale de deux lignées cellulaires tumorales différentes.

Mesure du flux de substrat mitochondrial dans les cellules O-perméabilisées de perfringolysine recombinante

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or ...

Parce qu’il teste le flux de substrat mitochondrial qui peut être affecté par différentes pathologies ou traitements. Par exemple, aujourd’hui, nous allons l’utiliser pour révéler la réponse des cellules cancéreuses au traitement par la metformine. Il nécessite un nombre minimal de cellules tout en ayant suffisamment de répliques et un contrôle approprié pour chaque matériau distinct.L’analyseur est destiné à la recherche uniquement. Cette technique peut identifier les erreurs dans le métabolisme mitochondrial et peut être utilisée pour évaluer les médicaments des guerriers affectant les mitochondries. Karolina Vaneckova, étudiante de premier cycle et technicienne de recherche de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.Pour commencer à ensemencer des cellules A549 à une densité de 20 000 cellules par puits en colonnes, deux à 11 d’une micro-plaque de culture cellulaire XF 96 d’hippocampe. Laisser les colonnes un et 12 vides comme puits d’arrière-plan. Remplissez les puits vides avec un volume égal du milieu de culture cellulaire, puis incubez les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5% de dioxyde de carbone pour la fixation cellulaire.Après trois à quatre heures, ajoutez 100 microlitres de milieu de culture cellulaire dans les puits. Traiter les colonnes du groupe expérimental de sept à 11 avec une metformine millimolaire et le groupe témoin avec un volume égal d’eau distillée stérile, puis renvoyer la plaque à l’incubateur. Pour hydrater les capteurs, pipettez 200 microlitres d’eau stérile par puits dans la plaque de service.Ensuite, retournez soigneusement la cartouche du capteur tout en immergeant le capteur dans l’eau. Incuber la cartouche dans un incubateur sans dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius jusqu’au lendemain. Allumez l’analyseur et l’unité de commande.Démarrez le logiciel de contrôle de l’instrument et d’acquisition de données, puis concevez le protocole d’essai tel que décrit dans le manuscrit textuel. Sous les définitions de groupe, créez quatre stratégies d’injection où le port A diffère selon le substrat injecté et nommez les stratégies d’après les substrats ou les abréviations. Assignez l’oligomycine au port B, le FCCP au port C et le mélange d’antimycine à la roténone A au port D.Créez et nommez huit groupes, sous la carte de plaque, attribuez des groupes aux puits correspondants.Enregistrez ensuite le protocole en tant que modèle prêt à l’emploi. Laissez l’analyseur allumé pour permettre à la température de se stabiliser pendant la nuit. Le lendemain, jetez l’eau de la plaque utilitaire et ajoutez 200 microlitres de calibrant préchauffé par puits dans la plaque utilitaire.Retournez la cartouche dans l’incubateur sans dioxyde de carbone jusqu’au moment du dosage. Maintenez une source d’humidité à l’intérieur de l’incubateur et éteignez ou réduisez la vitesse du ventilateur au minimum, afin d’éviter une évaporation rapide de l’étrier. Préparer cinq millilitres de la solution de travail des substrats et des inhibiteurs avec une solution de dosage mitochondriale préchauffée à deux fois, 5% de BSA et de l’eau stérile comme décrit dans le manuscrit du texte.Ensuite, chargez les orifices de l’injecteur avec du substrat et des inhibiteurs comme décrit dans le manuscrit fiscal. Pour l’étalonnage sous l’onglet Exécuter le test, cliquez sur le début de l’exécution pour démarrer le test. Insérez la cartouche de censure chargée et attendez la fin de l’étalonnage.Préparer un milieu d’essai de 20 millilitres en mélangeant deux fois la solution d’essai mitochondriale, de l’eau stérile et 5% de BSA dans un tube de 50 millilitres. Ajouter deux microlitres de 10 micromolaires recombinants perfringolysine O, pour atteindre une concentration d’un nanomolaire. Et re-suspendre le mélange avec un pipetage doux, en évitant les secousses et les vortex.Incuber le tube à 37 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Utilisez une pipette multicanal pour laver les cellules et les puits vides deux fois, en utilisant une solution de PBS sans calcium et magnésium préchauffée. Jetez le PBS et ajoutez 180 microlitres du milieu d’essai préchauffé pour la perméabilisation cellulaire.Immédiatement après la perméabilisation, remplacez la plaque utilitaire de la cartouche de capteur étalonnée par la plaque de cellule contenant des cellules perméabilisées et commencez la mesure. Le groupe de traitement avait un taux plus élevé de respiration induite par le succinate. La réponse des cellules A549 au traitement par la metformine était supérieure à celle de l’hépatite G2. Pour la respiration induite par le malate de pyruvate, les cellules A549 ont montré une induction accrue par rapport aux cellules Hep G2 entre cinq et 15 minutes.Des résultats similaires ont été obtenus pour la respiration induite par le malate de glutamate et la respiration induite par le malate de palmitoylcarnitine. Pour atteindre la bonne concentration de substrat et d’inhibiteurs. Le bon volume doit être chargé dans le bon port.Lorsqu’un changement dans une voie métabolique d’un certain substrat est identifié, il sera nécessaire d’évaluer la fonction des enzymes et des transporteurs impliqués dans cette voie.

Research

JoVE Journal

Biology

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Recherche

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