Name: measuring mitochondrial substrate flux in recombinant perfringolysin o-permeabilized cells
Uploaded: 2021-08-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells at JoVE.com

Die Autoren danken den Mitarbeitern der Abteilung für Physiologie an der Medizinischen Fakultät in Hradec Králové und der Abteilung für Pathophysiologie der Dritten Medizinischen Fakultät für die Hilfe bei chemikalien und Probenvorbereitung. Diese Arbeit wurde durch die Stipendienprogramme der Karlsuniversität PROGRES Q40/02, den Zuschuss des tschechischen Gesundheitsministeriums NU21-01-00259, den Zuschuss der tschechischen Wissenschaftsstiftung 18-10144 und das INOMED-Projekt CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 unterstützt, das vom Ministerium für Bildung, Jugend und Sport der Tschechischen Republik und von der Europäischen Union finanziert wurde.

1. Einen Tag vor dem Assay
<ol><li>Herstellung von Reagenzien und Substraten.<ol>
<li>Mitochondriale Assay-Lösung (MAS): Herstellung von Stammlösungen aller Reagenzien wie in Tabelle 1beschrieben. Erwärmen Sie die Bestände an Mannitol und Saccharose auf 37 °C, um sich vollständig aufzulösen. Mischen Sie die Reagenzien, um 2x MAS vorzubereiten, dann erwärmen Sie die Mischung auf 37 ° C. Stellen Sie den pH-Wert mit 5N KOH auf 7,4 (~ 7 ml) ein, fügen Sie dann Wasser hinzu, um das Volumen auf 1 ...

<ol>
	<li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion.">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li><li>Murphy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function,+biology,+and+role+in+disease:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).</li><li>Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+key+role+of+anaplerosis+and+cataplerosis+for+citric+acid+cycle+function.">The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).</li><li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics 3. , (2002).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Sta&#328;kov&#225;, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+mitochondrial+substrate+flux+in+a+mouse+model+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101 (2020).</li><li>Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+measurement+of+respiratory+activity+in+permeabilized+cells+using+extracellular+flux+analysis.">Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).</li><li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinediones+are+acute,+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier.">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).</li><li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode.">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li><li>Elkalaf, M., T&#367;ma, P., Weiszenstein, M., Pol&#225;k, J., Trnka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+probe+Methyltriphenylphosphonium+(TPMP)+inhibits+the+Krebs+cycle+enzyme+2-Oxoglutarate+dehydrogenase.">Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase.</a> PLoS One. 11 (8), 0161413 (2016).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), 21746 (2011).</li></ol>

Dieses Protokoll ist eine Modifikation der zuvor veröffentlichten Studien7,8,9,10 und des Produkt-Benutzerhandbuchs. Im Gegensatz zum Protokoll des Herstellers wird anstelle von 3x MAS 2x MAS verwendet, da 2× MAS leichter aufzulösen ist und nach dem Einfrieren keine Ausfällungen bildet. Gefrorene 2x MAS Aliquots können bis zu sechs Monate gelagert werden und zeigen konsistente Ergebnisse. ...

Die Mikroplatten-basierte Respirometrie hat die mitochondriale Forschung revolutioniert, indem sie die Untersuchung der Zellatmung einer kleinen Stichprobengrößeermöglicht 1. Die Zellatmung wird im Allgemeinen als Indikator für die mitochondriale Funktion oder "Dysfunktion" angesehen, obwohl der mitochondriale Funktionsumfang über die Energieproduktion hinausgeht2. Unter aeroben Bedingungen extrahieren Mitochondrien die in verschiedenen Substraten gespeicherte Energie, indem sie diese Substrate abbauen und in metabolische Zwischenprodukte umwandeln, die den Zitronensäurezyklus3 antreiben können (Abbildung 1). Der kontinuierliche Fluss von Substraten ist essentiell für den Fluss des Zitronensäurezyklus, um hochenergetische "Elektronendonatoren" zu erzeugen, die Elektronen an die Elektronentransportkette liefern, die einen Protonengradienten über die innere mitochondriale Membran erzeugt, so dass die ATP-Synthase ADP zu ATP4phosphorylieren kann. Daher muss ein experimentelles Design zur Untersuchung der mitochondrialen Atmung die Probennatur (intakte Zellen, permeabilisierte Zellen oder isolierte Mitochondrien) und mitochondriale Substrate umfassen.
Zellen halten einen Vorrat an einheimischen Substraten5, und Mitochondrien oxidieren mehrere Arten von Substraten gleichzeitig6, was die Interpretation von Ergebnissen aus Experimenten an intakten Zellen erschwert. Ein gängiger Ansatz zur Untersuchung der mitochondrialen Fähigkeit, ein ausgewähltes Substrat zu oxidieren, besteht darin, Mitochondrien zu isolieren oder die untersuchten Zellen zu permeabilisieren5. Obwohl isolierte Mitochondrien ideal für quantitative Studien sind, ist der Isolationsprozess mühsam. Es steht vor technischen Schwierigkeiten wie der Notwendigkeit eines großen Stichprobenumfangs, der Reinheit der Ausbeute und der Reproduzierbarkeit der Technik5. Permeabilisierte Zellen bieten eine Lösung für die Nachteile der mitochondrialen Isolierung; Routinemäßige Permeabilisatoren der Detergenziennatur sind jedoch nicht spezifisch und können die mitochondrialen Membranen schädigen5.
Rekombinantes Perfringolysin O (rPFO) wurde als selektives Plasmamembranpermeabilisierungsmittel7angeboten und in mehreren Studien7,8,9,10erfolgreich in Kombination mit einem extrazellulären Flussmittelanalysator eingesetzt . Wir haben ein Protokoll mit rPFO modifiziert, um den mitochondrialen Substratfluss mit dem extrazellulären Flussanalysator XFe96 zu screenen. In diesem Protokoll werden vier verschiedene Substratoxidationswege in zwei zellulären Phänotypen verglichen, während ausreichende Replikate und die richtige Kontrolle für jedes getestete Material vorhanden sind.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adinosine 5&#8242; -diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A5285</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8674</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A3803</td>
			<td>store at 2 - 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C2920</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D8418</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>63559</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>03777</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H7523</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(-)Malic acid disodium salt</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M9138</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid sodium salt hydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G5889</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnissium chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M2670</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>O4876</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl-DL-carnitine chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4509</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>484016</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5655</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>R8875</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Wave Desktop Software</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td></td>
			<td>Download from www.agilent.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P2256</td>
			<td>store at 2 - 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S2378</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S7903</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>W3500</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF calibrant</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Plasma membrane permeabilizer</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>102504-100</td>
			<td>Recombinant perfringolysin O (rPFO) - Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring mitochondrial substrate flux in recombinant perfringolysin o-permeabilized cells

Der mitochondriale Substratfluss ist ein Unterscheidungsmerkmal jedes Zelltyps, und Veränderungen seiner Komponenten wie Transporter, Kanäle oder Enzyme sind an der Pathogenese mehrerer Krankheiten beteiligt. Mitochondrialer Substratfluss kann mit intakten Zellen, permeabilisierten Zellen oder isolierten Mitochondrien untersucht werden. Die Untersuchung intakter Zellen stößt aufgrund der gleichzeitigen Oxidation verschiedener Substrate auf mehrere Probleme. Außerdem enthalten mehrere Zelltypen interne Speicher verschiedener Substrate, die die Interpretation der Ergebnisse erschweren. Methoden wie die mitochondriale Isolierung oder die Verwendung von Permeabilisatoren sind nicht leicht reproduzierbar. Die Isolierung reiner Mitochondrien mit intakten Membranen in ausreichenden Mengen aus kleinen Proben ist problematisch. Die Verwendung von nicht-selektiven Permeabilisatoren verursacht verschiedene Grade unvermeidlicher mitochondrialer Membranschäden. Rekombinantes Perfringolysin O (rPFO) wurde dank seiner Fähigkeit, die Plasmamembran selektiv zu permeabilisieren, ohne die mitochondriale Integrität zu beeinträchtigen, als geeigneterer Permeabilisator angeboten. In Kombination mit der Mikroplatten-Respirometrie ermöglicht es, den Fluss mehrerer mitochondrialer Substrate mit genügend Replikaten innerhalb eines Experiments unter Verwendung einer minimalen Anzahl von Zellen zu testen. In dieser Arbeit beschreibt das Protokoll eine Methode zum Vergleich des mitochondrialen Substratflusses von zwei verschiedenen zellulären Phänotypen oder Genotypen und kann angepasst werden, um verschiedene mitochondriale Substrate oder Inhibitoren zu testen.

Beginnen Sie mit der Normalisierung der Ergebnisse auf die zweite Messung der Baseline-Atmung, um Werte als Prozentsatz der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) anzuzeigen. Die Ergebnisse des Assays sind in abbildung 5, Abbildung 6, Abbildung 7 und Abbildung 8 dargestellt. Es ist wichtig, jeder Gruppe die richtigen Hintergrundbohrungen zuzuweisen und die Hintergrundbohrungen...

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Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells

In dieser Arbeit beschreiben wir ein modifiziertes Protokoll zum Testen des mitochondrialen respiratorischen Substratflusses unter Verwendung von rekombinantem Perfringolysin O in Kombination mit mikroplattenbasierter Respirometrie. Mit diesem Protokoll zeigen wir, wie Metformin die mitochondriale Atmung von zwei verschiedenen Tumorzelllinien beeinflusst.

Messung des mitochondrialen Substratflusses in rekombinanten Perfringolysin O-permeabilisierten Zellen

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or ...

Weil es den Mitochondria-Substratfluss testet, der mit verschiedenen Pathologien oder Behandlungen betroffen sein kann. Zum Beispiel werden wir es heute verwenden, um die Reaktion von Krebszellen auf die Metformin-Behandlung aufzudecken. Es erfordert eine minimale Anzahl von Zellen bei ausreichenden Replikaten und angemessener Kontrolle für jedes einzelne Material.Der Analysator ist nur für Forschungszwecke bestimmt. Diese Technik kann Fehler im mitochondrialen Stoffwechsel identifizieren und kann verwendet werden, um Kriegermedikamente zu bewerten, die Mitochondrien beeinflussen. Das Verfahren wird Karolina Vaneckova, eine Studentin und Forschungstechnikerin aus meinem Labor, demonstrieren.Um zu beginnen, säen Sie A549-Zellen mit einer Dichte von 20.000 Zellen pro Vertiefung in Säulen, zwei bis 11 eines Seepferdchens XF 96 Zellkultur-Mikroplatte. Die Spalten eins und 12 bleiben als Hintergrundschachts leer. Füllen Sie die leeren Wells mit einem gleichen Volumen des Zellkulturmediums und inkubieren Sie die Zellen dann bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid zur Zellanlagerung.Nach drei bis vier Stunden 100 Mikroliter Zellkulturmedium in die Wells geben. Behandeln Sie die experimentellen Gruppenspalten sieben bis 11 mit einem millimolaren Metformin und die Kontrollgruppe mit einem gleichen Volumen sterilen destillierten Wassers und bringen Sie die Platte dann zum Inkubator zurück. Zur Hydratation der Sensoren werden 200 Mikroliter steriles Wasser pro Vertiefung in die Versorgungsplatte pipettiert.Geben Sie dann die Sensorpatrone vorsichtig zurück, während Sie den Sensor in Wasser tauchen. Inkubieren Sie die Kartusche in einem kohlendioxidfreien Inkubator bei 37 Grad Celsius bis zum nächsten Tag. Schalten Sie den Analysator und die Steuereinheit ein.Starten Sie die Gerätesteuerungs- und Datenerfassungssoftware und entwerfen Sie das Assay-Protokoll wie im Textmanuskript beschrieben. Erstellen Sie unter Gruppendefinitionen vier Injektionsstrategien, bei denen sich Port A je nach injiziertem Substrat unterscheidet, und benennen Sie die Strategien nach den Substraten oder Abkürzungen. Weisen Sie Oligomycin Port B, FCCP Port C und Rotenone Antimycin A-Gemisch Port D zu.Erstellen und benennen Sie acht Gruppen, unter der Plattenzuordnung, weisen Sie gruppen den entsprechenden Wells zu.Speichern Sie dann das Protokoll als gebrauchsfertige Vorlage. Lassen Sie den Analysatorschalter eingeschaltet, damit sich die Temperatur über Nacht stabilisieren kann. Entsorgen Sie am nächsten Tag das Wasser von der Versorgungsplatte und fügen Sie 200 Mikroliter des vorgewärmten Kalifrants pro Vertiefung in die Versorgungsplatte hinzu.Bringen Sie die Kartusche bis zum Zeitpunkt des Assays in den kohlendioxidfreien Inkubator zurück. Halten Sie eine Feuchtigkeitsquelle im Inneren des Inkubators aufrecht und schalten Sie die Lüfterdrehzahl aus oder reduzieren Sie sie auf ein Minimum, um eine schnelle Verdunstung des Kalifants zu vermeiden. Bereiten Sie fünf Milliliter der Arbeitslösung der Substrate und Inhibitoren mit vorgewärmter zweifach mitochondrialer Assay-Lösung, 5% BSA und sterilem Wasser wie im Textmanuskript beschrieben her.Als nächstes laden Sie die Injektorports mit Substrat und Inhibitoren, wie im Steuermanuskript beschrieben. Klicken Sie zur Kalibrierung auf der Registerkarte Assay ausführen auf den Startlauf, um den Test zu starten. Setzen Sie die geladene Zensorkassette ein und warten Sie, bis die Kalibrierung abgeschlossen ist.Bereiten Sie ein 20 Milliliter Assay-Medium vor, indem Sie zweifache mitochondriale Assay-Lösung, steriles Wasser und 5% BSA in einem 50-Milliliter-Röhrchen mischen. Fügen Sie zwei Mikroliter von 10 mikromolaren rekombinanten Perfringolysin O hinzu, um eine Konzentration von einem Nanomolar zu erreichen. Und setzen Sie die Mischung mit sanftem Pipettieren wieder auf, um Schütteln und Wirbeln zu vermeiden.Die Tube bis zum Gebrauch bei 37 Grad Celsius inkubieren. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um die Zellen und die leeren leeren Brunnen zweimal zu waschen, wobei Sie vorgewärmte kalzium- und magnesiumfreie PBS-Lösung verwenden. Verwerfen Sie das PBS und fügen Sie 180 Mikroliter des vorgewärmten Assay-Mediums zur Zellpermeabilisierung hinzu.Ersetzen Sie unmittelbar nach der Permeabilisierung die Versorgungsplatte der kalibrierten Sensorkartusche durch die Zellplatte mit permeabilisierten Zellen und starten Sie die Messung. Die Behandlungsgruppe hatte eine höhere Rate an Succinat-induzierter Atmung. Das Ansprechen von A549-Zellen auf die Metformin-Behandlung war höher als das von Hep G2. Für die Pyruvatmalat-induzierte Atmung zeigten A549-Zellen eine erhöhte Induktion im Vergleich zu Hep G2-Zellen zwischen fünf und 15 Minuten.Ähnliche Ergebnisse wurden für die Glutamatmalat-induzierte Atmung und die Palmitoylcarnitin-Malat-induzierte Atmung erzielt. Um die richtige Konzentration von Substrat und Inhibitoren zu erreichen. Das richtige Volume muss in den richtigen Port geladen werden.Wenn eine Veränderung in einem Stoffwechselweg eines bestimmten Substrats identifiziert wird, muss die Funktion der Enzyme und Transporter, die an diesem Weg beteiligt sind, bewertet werden.

Research

JoVE Journal

Biology

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

Ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Protein in mCD1d Insektenzellen.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Forschung

Biologie

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Probing für Mitochondriale komplexe Aktivität in humanen embryonalen Stammzellen

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Mess Glutathion-induzierte Fütterung Antwort in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

Hochauflösende Respirationstest zur Beurteilung mitochondrialen Funktion in permeabilisierten und Intakte Zellen

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Assessing Autophagic Flux durch Messung von LC3, p62 und LAMP1 Co-Lokalisierung mittels Multispektral Imaging Flow Cytometry

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Vorübergehende Expression und zelluläre Lokalisation von rekombinanten Proteinen in gezüchteten Insektenzellen

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Messung des Energiestoffwechsels in explantierten Netzhautgewebe extrazelluläre Flux-Analyse

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...