Name: measuring mitochondrial substrate flux in recombinant perfringolysin o-permeabilized cells
Uploaded: 2021-08-13T14:30:00
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लेखकों Hradec Králové में चिकित्सा के संकाय में फिजियोलॉजी विभाग के कर्मचारियों के सदस्यों और रसायनों और नमूनों की तैयारी के साथ मदद के लिए चिकित्सा के तीसरे संकाय में Pathophysiology विभाग के सदस्यों को धन्यवाद. इस काम को चार्ल्स विश्वविद्यालय अनुदान कार्यक्रमों PROGRES Q40/02, चेक स्वास्थ्य मंत्रालय अनुदान NU21-01-00259, चेक विज्ञान फाउंडेशन अनुदान 18-10144 और INOMED परियोजना CZ.02.1.01/0.0/0.0/0.0/18_069/0010046 द्वारा समर्थित किया गया था, जो चेक गणराज्य के शिक्षा, युवा और खेल मंत्रालय और यूरोपीय संघ द्वारा वित्त पोषित है।

1. परख से पहले एक दिन
<ol><li>अभिकर्मकों और substrates की तैयारी.<ol>
<li>माइटोकॉन्ड्रियल परख समाधान (एमएएस): तालिका 1में वर्णित के रूप में सभी अभिकर्मकों के स्टॉक समाधान तैयार करें। पूरी तरह से भंग करने के लिए 37 डि?...

<ol>
	<li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion.">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li><li>Murphy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function,+biology,+and+role+in+disease:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).</li><li>Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+key+role+of+anaplerosis+and+cataplerosis+for+citric+acid+cycle+function.">The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).</li><li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics 3. , (2002).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Sta&#328;kov&#225;, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+mitochondrial+substrate+flux+in+a+mouse+model+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101 (2020).</li><li>Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+measurement+of+respiratory+activity+in+permeabilized+cells+using+extracellular+flux+analysis.">Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).</li><li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinediones+are+acute,+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier.">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).</li><li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode.">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li><li>Elkalaf, M., T&#367;ma, P., Weiszenstein, M., Pol&#225;k, J., Trnka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+probe+Methyltriphenylphosphonium+(TPMP)+inhibits+the+Krebs+cycle+enzyme+2-Oxoglutarate+dehydrogenase.">Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase.</a> PLoS One. 11 (8), 0161413 (2016).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), 21746 (2011).</li></ol>

यह प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित अध्ययन7,8,9,10 और उत्पाद उपयोगकर्ता गाइड का एक संशोधन है। निर्माता के प्रोटोकॉल के विपरीत, 3x MAS के बजाय 2x MAS का उपयोग किया जाता है, क्...

माइक्रोप्लेट-आधारित श्वसनमिति ने एक छोटे से नमूना आकार1के सेलुलर श्वसन के अध्ययन को सक्षम करके माइटोकॉन्ड्रियल अनुसंधान में क्रांति ला दी है। सेलुलर श्वसन को आम तौर पर माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन या 'डिसफंक्शन' के संकेतक के रूप में माना जाता है, इस तथ्य के बावजूद कि कार्यों की माइटोकॉन्ड्रियल रेंज ऊर्जा उत्पादन से परे फैली हुईहै। एरोबिक स्थितियों में, माइटोकॉन्ड्रिया विभिन्न सब्सट्रेट्स में संग्रहीत ऊर्जा को तोड़कर और इन सब्सट्रेट्स को चयापचय मध्यवर्ती में परिवर्तित करके निकालता है जो साइट्रिक एसिड चक्र3 (चित्रा 1)को ईंधन दे सकता है। सब्सट्रेट्स का निरंतर प्रवाह साइट्रिक एसिड चक्र के प्रवाह के लिए उच्च ऊर्जा 'इलेक्ट्रॉन दाताओं' को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है, जो इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला में इलेक्ट्रॉनों को वितरित करता है जो आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली में एक प्रोटॉन ढाल उत्पन्न करता है, एटीपी-सिंथेज़ को एटीपी4के लिए फॉस्फोराइलेट एडीपी को सक्षम करता है। इसलिए, माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन परख करने के लिए एक प्रयोगात्मक डिजाइन में नमूना प्रकृति (बरकरार कोशिकाओं, permeabilized कोशिकाओं, या पृथक माइटोकॉन्ड्रिया) और माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट शामिल होना चाहिए।
कोशिकाएं स्वदेशीसब्सट्रेट्स 5का एक स्टोर रखती हैं, और माइटोकॉन्ड्रिया कई प्रकार के सब्सट्रेट्स को एक साथ6ऑक्सीकरण करते हैं, जो बरकरार कोशिकाओं पर किए गए प्रयोगों से प्राप्त परिणामों की व्याख्या को जटिल बनाता है। एक चयनित सब्सट्रेट को ऑक्सीकरण करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल क्षमता की जांच करने के लिए एक सामान्य दृष्टिकोण माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करना या जांच की गई कोशिकाओं को परमेबिलाइज़ करनाहै। यद्यपि पृथक माइटोकॉन्ड्रिया मात्रात्मक अध्ययन के लिए आदर्श हैं, अलगाव प्रक्रिया श्रमसाध्य है। यह तकनीकी कठिनाइयों का सामना करता है जैसे कि बड़े नमूना आकार की आवश्यकता, उपज की शुद्धता, और तकनीक की पुनरुत्पादकता5। Permeabilized कोशिकाएं माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव के नुकसान के लिए एक समाधान प्रदान करती हैं; हालांकि, डिटर्जेंट प्रकृति के नियमित permeabilizing एजेंट विशिष्ट नहीं हैं और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली को नुकसान पहुंचा सकते हैं5।
पुनः संयोजक perfringolysin O (rPFO) एक चयनात्मक प्लाज्मा झिल्ली permeabilizing एजेंट 7 के रूप में की पेशकश की गई थी, और यह सफलतापूर्वककईअध्ययनों 7,8,9,10में एक extracellular फ्लक्स विश्लेषक के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया गया था। हमने XFe96 एक्स्ट्रासेल्युलर फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट फ्लक्स को स्क्रीन करने के लिए आरपीएफओ का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल को संशोधित किया है। इस प्रोटोकॉल में, दो सेलुलर फेनोटाइप में चार अलग-अलग सब्सट्रेट ऑक्सीकरण मार्गों की तुलना की जाती है, जबकि प्रत्येक परीक्षण की गई सामग्री के लिए पर्याप्त प्रतिकृति और उचित नियंत्रण होता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adinosine 5&#8242; -diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A5285</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8674</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A3803</td>
			<td>store at 2 - 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C2920</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D8418</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>63559</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>03777</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H7523</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(-)Malic acid disodium salt</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M9138</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid sodium salt hydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G5889</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnissium chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M2670</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>O4876</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl-DL-carnitine chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4509</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>484016</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5655</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>R8875</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Wave Desktop Software</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td></td>
			<td>Download from www.agilent.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P2256</td>
			<td>store at 2 - 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S2378</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S7903</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>W3500</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF calibrant</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Plasma membrane permeabilizer</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>102504-100</td>
			<td>Recombinant perfringolysin O (rPFO) - Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring mitochondrial substrate flux in recombinant perfringolysin o-permeabilized cells

माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट फ्लक्स प्रत्येक सेल प्रकार की एक विशिष्ट विशेषता है, और इसके घटकों जैसे ट्रांसपोर्टर, चैनल, या एंजाइमों में परिवर्तन कई बीमारियों के रोगजनन में शामिल हैं। माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट फ्लक्स का अध्ययन बरकरार कोशिकाओं, permeabilized कोशिकाओं, या पृथक माइटोकॉन्ड्रिया का उपयोग करके किया जा सकता है। अक्षुण्ण कोशिकाओं की जांच विभिन्न सब्सट्रेट्स के एक साथ ऑक्सीकरण के कारण कई समस्याओं का सामना करती है। इसके अलावा, कई सेल प्रकारों में विभिन्न सब्सट्रेट्स के आंतरिक भंडार होते हैं जो परिणामों की व्याख्या को जटिल बनाते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव या permeabilizing एजेंटों का उपयोग करने जैसे तरीके आसानी से पुन: प्रस्तुत करने योग्य नहीं हैं। छोटे नमूनों से पर्याप्त मात्रा में बरकरार झिल्ली के साथ शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करना समस्याग्रस्त है। गैर-चयनात्मक permeabilizers का उपयोग अपरिहार्य माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षति के विभिन्न डिग्री का कारण बनता है। पुनः संयोजक perfringolysin O (rPFO) को एक अधिक उपयुक्त permeabilizer के रूप में पेश किया गया था, माइटोकॉन्ड्रियल अखंडता को प्रभावित किए बिना चुनिंदा रूप से प्लाज्मा झिल्ली को permeabilize करने की क्षमता के लिए धन्यवाद। जब माइक्रोप्लेट श्वसनमिति के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है, तो यह कोशिकाओं की न्यूनतम संख्या का उपयोग करते हुए एक प्रयोग के भीतर पर्याप्त प्रतिकृति के साथ कई माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट के प्रवाह का परीक्षण करने की अनुमति देता है। इस काम में, प्रोटोकॉल दो अलग-अलग सेलुलर फेनोटाइप या जीनोटाइप के माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट फ्लक्स की तुलना करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है और विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट या अवरोधकों का परीक्षण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

ऑक्सीजन खपत दर प्रतिशत (OCR%) के रूप में मूल्यों को दिखाने के लिए बेसलाइन श्वसन के दूसरे माप के लिए परिणामों को सामान्य करके शुरू करें। परख के परिणामों को चित्र 5, चित्र 6 , चित्र 7 , और <strong clas...

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Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells

इस काम में, हम माइक्रोप्लेट-आधारित रेस्पिरोमेट्री के साथ संयोजन में पुनः संयोजक perfringolysin O का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन सब्सट्रेट फ्लक्स का परीक्षण करने के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल के साथ, हम दिखाते हैं कि मेटफॉर्मिन दो अलग-अलग ट्यूमर सेल लाइनों के माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को कैसे प्रभावित करता है।

पुनः संयोजक Perfringolysin O-Permeabilized कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल सब्सट्रेट फ्लक्स को मापना

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or ...

क्योंकि यह माइटोकॉन्ड्रिया सब्सट्रेट फ्लक्स का परीक्षण करता है जो विभिन्न विकृतियों या उपचारों से प्रभावित हो सकता है। उदाहरण के लिए, आज हम इसका उपयोग मेटफॉर्मिन उपचार के लिए कैंसर सेल प्रतिक्रिया को प्रकट करने के लिए करेंगे। इसके लिए कोशिकाओं की एक न्यूनतम संख्या की आवश्यकता होती है, जबकि प्रत्येक विशिष्ट सामग्री के लिए पर्याप्त प्रतिकृति और उचित नियंत्रण होता है।विश्लेषक केवल अनुसंधान उपयोग के लिए है। यह तकनीक माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय में त्रुटियों की पहचान कर सकती है और इसका उपयोग माइटोकॉन्ड्रिया को प्रभावित करने वाले योद्धाओं की दवाओं का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन कैरोलिना Vaneckova मेरी प्रयोगशाला से एक स्नातक छात्र और अनुसंधान तकनीशियन होगा.स्तंभों में 20, 000 कोशिकाओं के घनत्व पर बीज A549 कोशिकाओं को शुरू करने के लिए, एक सीहॉर्स XF 96 सेल संस्कृति माइक्रो-प्लेट के दो से 11। स्तंभ एक और 12 को पृष्ठभूमि कुओं के रूप में खाली छोड़ना. सेल संस्कृति माध्यम की एक समान मात्रा के साथ रिक्त वेल्स को भरें, फिर सेल अनुलग्नक के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।तीन से चार घंटे के बाद, वेल्स में सेल कल्चर माध्यम के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। एक मिलीमोलर मेटफॉर्मिन के साथ सात से 11 तक प्रयोगात्मक समूह स्तंभों का इलाज करें और बाँझ आसुत पानी की समान मात्रा के साथ नियंत्रण समूह, फिर प्लेट को इनक्यूबेटर में वापस कर दें। सेंसर को हाइड्रेट करने के लिए, उपयोगिता प्लेट में प्रति अच्छी तरह से बाँझ पानी के पिपेट 200 माइक्रोलीटर।फिर सेंसर को पानी में डुबोते समय सावधानी से सेंसर कारतूस वापस कर दें। अगले दिन तक 37 डिग्री सेल्सियस पर कार्बन डाइऑक्साइड मुक्त इनक्यूबेटर में कारतूस को इनक्यूबेट करें। विश्लेषक और नियंत्रण इकाई पर स्विच करें।साधन नियंत्रण और डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर शुरू करें, और पाठ पांडुलिपि में वर्णित के रूप में परख प्रोटोकॉल डिजाइन। समूह परिभाषाओं के तहत, चार इंजेक्शन रणनीतियां बनाएं जहां पोर्ट ए इंजेक्ट किए गए सब्सट्रेट के अनुसार भिन्न होता है और सब्सट्रेट या संक्षेप के बाद रणनीतियों का नाम देता है। पोर्ट बी को ओलिगोमाइसिन असाइन करें, सी और रोटेनोन एंटीमाइसिन पोर्ट डी.क्रिएट करने के लिए एक मिश्रण को पोर्ट करें और प्लेट मैप के नीचे आठ समूहों का नाम दें, संबंधित वेल्स को समूह असाइन करें।फिर प्रोटोकॉल को उपयोग करने के लिए तैयार टेम्पलेट के रूप में सहेजें। तापमान को रात भर स्थिर करने की अनुमति देने के लिए विश्लेषक स्विच को चालू छोड़ दें। अगले दिन, उपयोगिता प्लेट से पानी को छोड़ दें और उपयोगिता प्लेट में प्रति अच्छी तरह से पूर्व-गर्म कैलिब्रेंट के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें।परख के समय तक कार्बन डाइऑक्साइड मुक्त इनक्यूबेटर के लिए कारतूस वापस. इनक्यूबेटर के अंदर आर्द्रता के स्रोत को बनाए रखें और कैलिब्रेंट के तेजी से वाष्पीकरण से बचने के लिए पंखे की गति को कम से कम या कम करने के लिए बंद करें या कम करें। पाठ पांडुलिपि में वर्णित के रूप में पूर्व गर्म दो बार माइटोकॉन्ड्रियल परख समाधान, 5% बीएसए और बाँझ पानी के साथ substrates और inhibitors के काम समाधान के पांच milliliters तैयार करें।इसके बाद, कर पांडुलिपि में वर्णित सब्सट्रेट और अवरोधकों के साथ इंजेक्टर बंदरगाहों को लोड करें। रन परख टैब के तहत अंशांकन के लिए, परख शुरू करने के लिए शुरू चलाने पर क्लिक करें। लोड किए गए सेंसर कारतूस डालें और अंशांकन के पूरा होने की प्रतीक्षा करें।परख माध्यम के एक 20 milliters तैयार, दो बार माइटोकॉन्ड्रियल परख समाधान, बाँझ पानी और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 5% बीएसए मिश्रण से. एक नैनोमोलर की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 10 माइक्रोमोलर पुनः संयोजक perfringolysin O के दो माइक्रोलीटर जोड़ें। और कोमल pipetting के साथ मिश्रण को फिर से निलंबित, मिलाते हुए और भंवर से बचने.उपयोग तक ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं और खाली खाली वेल्स को दो बार धोने के लिए एक बहु-चैनल पिपेट का उपयोग करें, पूर्व-गर्म कैल्शियम और मैग्नीशियम मुक्त पीबीएस समाधान का उपयोग करके। पीबीएस को त्यागें और सेल permeabilization के लिए पूर्व गर्म परख माध्यम के 180 microliters जोड़ें.Permeabilization के तुरंत बाद सेल प्लेट permeabilized कोशिकाओं युक्त के साथ कैलिब्रेटेड सेंसर कारतूस की उपयोगिता प्लेट को प्रतिस्थापित करें और माप शुरू करें। उपचार समूह में सक्सिनेट प्रेरित श्वसन की उच्च दर थी। मेटफॉर्मिन उपचार के लिए A549 कोशिकाओं की प्रतिक्रिया हेप G2 की तुलना में अधिक थी। पाइरूवेट मैलेट प्रेरित श्वसन के लिए, A549 कोशिकाओं ने पांच से 15 मिनट के बीच हेप जी 2 कोशिकाओं की तुलना में बढ़ी हुई प्रेरण दिखाई।इसी तरह के परिणाम ग्लूटामेट मैलेट प्रेरित श्वसन और palmitoylcarnitine malate प्रेरित श्वसन के लिए प्राप्त किए गए थे। सब्सट्रेट और अवरोधकों की सही एकाग्रता प्राप्त करने के लिए। सही वॉल्यूम को सही पोर्ट में लोड किया जाना चाहिए।जब एक निश्चित सब्सट्रेट के चयापचय मार्ग में परिवर्तन की पहचान की जाती है, तो उस मार्ग में शामिल एंजाइमों और ट्रांसपोर्टरों के कार्य का आकलन करना आवश्यक होगा।

Research

JoVE Journal

Biology

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

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CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

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Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

हाइड्रा में glutathione प्रेरित दूध पिलाने की प्रतिक्रिया को मापने

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

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Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

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Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

एलसी 3, पी 62, और एलएएमपी 1 को मापकर आटोफैजिक फ्लक्स का मूल्यांकन करना मल्टी-स्पेक्ट्रल इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करना

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

डायनामिक सेलुलर प्रोट्र्रेशन में प्रोटीन एकाग्रता के सॉफ़्टवेयर-सहायता प्राप्त ट्रैकिंग के लिए एक ग्राफ़िकल यूजर इंटरफेस

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

क्षणिक अभिव्यक्ति और पुनः संयोजक प्रोटीन के सेलुलर स्थानीयकरण सुसंस्कृत कीट कोशिकाओं में

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Extracellular फ्लक्स विश्लेषण का उपयोग Explanted रेटिना ऊतक में ऊर्जा चयापचय का मापन

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