Name: measuring mitochondrial substrate flux in recombinant perfringolysin o-permeabilized cells
Uploaded: 2021-08-13T14:30:00
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著者らは、フラデック・クラロヴェの医学部生理学部門の職員と第3医学部の病態生理学科の職員に、化学物質とサンプルの調製に協力してくれたことに感謝する。この研究は、チャールズ大学の助成プログラムPROGRES Q40/02、チェコ保健省補助金NU21-01-00259、チェコ科学財団助成金18-10144、INOMEDプロジェクトCZ.02.1.01/0.0/18_069/0010046によって支援されました。

1. アッセイの前日
<ol><li>試薬および基質の調製。<ol>
<li>ミトコンドリアアッセイ溶液(MAS): 表1に記載されている全ての試薬のストック溶液を準備する。マンリトールとスクロースの在庫を37°Cに温め、完全に溶解します。試薬を混合して2倍のMASを調製し、その後、混合物を37°Cに温める。 5N KOHでpHを7.4(〜7 mL)に調整し、水を加え、体積を最大1 L.ろ過滅にし、測定日まで-20°Cでア?...

<ol>
	<li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion.">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li><li>Murphy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function,+biology,+and+role+in+disease:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).</li><li>Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+key+role+of+anaplerosis+and+cataplerosis+for+citric+acid+cycle+function.">The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).</li><li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics 3. , (2002).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Sta&#328;kov&#225;, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+mitochondrial+substrate+flux+in+a+mouse+model+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101 (2020).</li><li>Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+measurement+of+respiratory+activity+in+permeabilized+cells+using+extracellular+flux+analysis.">Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).</li><li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinediones+are+acute,+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier.">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).</li><li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode.">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li><li>Elkalaf, M., T&#367;ma, P., Weiszenstein, M., Pol&#225;k, J., Trnka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+probe+Methyltriphenylphosphonium+(TPMP)+inhibits+the+Krebs+cycle+enzyme+2-Oxoglutarate+dehydrogenase.">Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase.</a> PLoS One. 11 (8), 0161413 (2016).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), 21746 (2011).</li></ol>

このプロトコルは、以前に発表された研究7、8、9、10と製品ユーザーガイドの変更です。メーカーのプロトコルとは対照的に、2x MASは3倍MASの代わりに使用され、2×MASは溶解しやすく、凍結後に沈殿物を形成しません。凍結された2x MASアリコートは、最大6ヶ月保存でき、一貫した結果を示すことが...

マイクロプレートベースの呼吸数は、小さいサンプルサイズ1の細胞呼吸の研究を可能にすることによってミトコンドリア研究に革命を起こしました。細胞呼吸は、ミトコンドリア機能または「機能不全」の指標として一般的に考えられるが、ミトコンドリアの機能範囲がエネルギー産生を超えて広がっている2。好気条件では、ミトコンドリアは、これらの基質を分解して、クエン酸サイクル3 を燃料とすることができる代謝中間体に変換することによって、異なる基質に蓄えられているエネルギーを抽出する(図1)。基質の連続流束は、クエン酸サイクルの流れに不可欠であり、高エネルギーの「電子ドナー」を生成し、内部ミトコンドリア膜を横切って陽子勾配を生成する電子輸送鎖に電子を送達し、ATP合成酵素がADPをATP4にリン酸化することを可能にする。したがって、ミトコンドリア呼吸をアッセイする実験計画には、サンプル性質(無傷細胞、透過細胞、または単離ミトコンドリア)およびミトコンドリア基質を含まなければならない。
細胞は先住民族の基質5の貯蔵を維持し、ミトコンドリアは、同時に数種類の基質を酸化する6、無傷の細胞に対して行われた実験から得られた結果の解釈を複雑にする。選択した基質を酸化するミトコンドリア能力を調査する一般的なアプローチは、ミトコンドリアを単離するか、または調査した細胞5を透過させることである。分離ミトコンドリアは定量的研究に理想的ですが、分離プロセスは面倒です。大きなサンプルサイズ、収率の純度、技術5の再現性などの技術的な困難に直面しています。透過細胞はミトコンドリアの分離の欠点のためのソリューションを提供します;;しかし、洗剤の日常的な透過性剤は特異的ではなく、ミトコンドリア膜5に損傷を与える可能性がある。
組換えペルフリンゴライシンO(rPFO)は、選択的な血漿膜透過性剤7として提供され、そして、いくつかの研究7、8、9、10において細胞外フラックス分析装置との併用に成功した。XFe96細胞外フラックス分析装置を用いて、rPFOを用いてミトコンドリア基質フラックスをスクリーニングするプロトコルを改変した。このプロトコルでは、2つの細胞型の4つの異なる基質酸化経路を比較し、試験した各材料に対して十分な反復と適切な制御を有する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adinosine 5&#8242; -diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A5285</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8674</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A3803</td>
			<td>store at 2 - 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C2920</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D8418</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>63559</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>03777</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H7523</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(-)Malic acid disodium salt</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M9138</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid sodium salt hydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G5889</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnissium chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M2670</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>O4876</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl-DL-carnitine chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4509</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>484016</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5655</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>R8875</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Wave Desktop Software</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td></td>
			<td>Download from www.agilent.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P2256</td>
			<td>store at 2 - 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S2378</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S7903</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>W3500</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF calibrant</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Plasma membrane permeabilizer</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>102504-100</td>
			<td>Recombinant perfringolysin O (rPFO) - Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring mitochondrial substrate flux in recombinant perfringolysin o-permeabilized cells

ミトコンドリア基質フラックスは、各細胞型の特徴であり、トランスポーター、チャネル、酵素などの成分の変化が、いくつかの疾患の病因に関与している。ミトコンドリア基質フラックスは、インタクト細胞、透過細胞、または単離ミトコンドリアを用いて研究することができる。無傷の細胞を調査することは、異なる基質の同時酸化のためにいくつかの問題に遭遇する。また、いくつかの細胞タイプは結果解釈を複雑にする異なる基質の内部ストアを含む。ミトコンドリアの分離や透過性の薬剤の使用などの方法は、容易に再現できません。小さいサンプルから十分な量の無傷の膜で純粋なミトコンドリアを分離することは問題である。非選択的パーメアビライザーを使用すると、さまざまな程度の不可避ミトコンドリア膜損傷を引き起こす。組換えペルフリンゴライシンO(rPFO)は、ミトコンドリア完全性に影響を与えることなく、細胞膜を選択的に透過させる能力のおかげで、より適切なパーメアビライザーとして提供された。マイクロプレートの呼吸数と組み合わせて使用すると、最小数の細胞を使用しながら、1回の実験内で十分な反復を伴ういくつかのミトコンドリア基質のフラックスをテストすることができます。本研究では、このプロトコルは、2つの異なる細胞表現型または遺伝子型のミトコンドリア基質フラックスを比較する方法を説明し、様々なミトコンドリア基質または阻害剤を試験するようにカスタマイズすることができる。

まず、結果をベースライン呼吸の2回目の測定に正規化し、酸素消費率(OCR%)として値を示します。アッセイの結果は、図5、図6、図7、図8に示されています。各グループに適切なバックグラウンドウェルを割り当て、他のグループのバックグラウンドウェルを無効にすることが重?...

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Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells

本研究では、マイクロプレートベースの呼吸法と組み合わせて組み換えパーフリンゴライシンOを用いてミトコンドリア呼吸基質フラックスを試験する改変プロトコルについて説明する。このプロトコルを用いて、メトホルミンが2つの異なる腫瘍細胞株のミトコンドリア呼吸にどのように影響するかを示す。

組換えペルフリンゴライシンO-透過細胞におけるミトコンドリア基質フラックスの測定

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or ...

それは異なる病理または処置で影響を受けることができるミトコンドリア基質フラックスをテストするので。例えば、今日はメトホルミン治療に対する癌細胞応答を明らかにするためにそれを使用します。それは十分な複製および各異なる材料のための適切な制御を有する間、細胞の最小数を必要とする。分析器は研究用です。この技術は、ミトコンドリア代謝のエラーを識別することができ、ミトコンドリアに影響を与える戦士の薬物を評価するために使用することができます.手順を実証するカロリーナ・ヴァネコワは、私の研究室の学部生と研究技術者です。A549細胞を列内のウェルあたり20,000個の密度で、2〜11のタツノオトシゴXF 96細胞培養マイクロプレートで開始する。列 1 と 12 を背景ウェルとして空のままにします。ブランクウェルに同量の細胞培養培地を充填し、加湿インキュベーターでセルを5%の二酸化炭素で培養します。3~4時間後、ウェルズに100マイクロリットルの細胞培養培地を加える。実験群列7~11を1ミリモルメトホルミンで、対照群を等量の滅菌蒸留水で処理し、プレートをインキュベーターに戻します。センサーを水分補給するために、ユーティリティプレートにウェルあたり滅菌水のピペット200マイクロリットル。その後、センサーを水中に浸しながら、センサーカートリッジを慎重に返却します。カートリッジを次の日まで摂氏37度で炭酸ガスフリーインキュベーターにインキュベートします。アナライザと制御装置のスイッチをオンにします。計測器制御およびデータ取得ソフトウェアを起動し、テキスト原稿に記載されているようにアッセイプロトコルを設計します。グループ定義の下で、ポートAが注入された基板に応じて異なる4つの注入戦略を作成し、基板または略称の後に戦略を挙げてください。ポート D.Create にポート C とロテノーン アンティマイシン A の混合ポートにオリゴマイシンを割り当て、プレート マップの下で 8 つのグループに名前を付け、対応するウェルにグループを割り当てます。次に、プロトコルをテンプレートを使用する準備として保存します。温度が一晩安定するように、アナライザのスイッチをオンのままにします。翌日、ユーティリティプレートから水を捨て、ユーティリティプレートにウェルごとに200マイクロリットルの事前温めキャリブラントを追加します。測定時までカートリッジを二酸化炭素フリーインキュベーターに戻します。インキュベーター内の湿度の源を維持し、キャリブラントの急速な蒸発を避けるために、ファン速度を最小限にオフまたは減らします。テキスト原稿に記載されているように、ミトコンドリアアッセイ溶液、5%BSAおよび滅菌水を2回事前に加温した基質および阻害剤の働く溶液の5ミリリットルを調製する。次に、税務原稿に記載されているように、注射器ポートに基質および阻害剤をロードする。[実行アッセイ]タブでキャリブレーションを行う場合は、開始実行をクリックしてアッセイを開始します。装填された検閲カートリッジを挿入し、キャリブレーションが完了するのを待ちます。20ミリリットルのアッセイ培地を調製し、ミトコンドリアアッセイ溶液、滅菌水、5%BSAを50ミリリットルチューブに混合します。10マイクロモル組換えパーフリンゴライシンOの2マイクロリットルを加え、1ナノモルの濃度を達成する。そして、揺れや渦を避け、穏やかなピペットで混合物を再中断します。使用するまで摂氏37度でチューブをインキュベートします。マルチチャネルピペットを使用して、細胞と空の空白のウェルズを2回洗浄し、事前に温めたカルシウムとマグネシウムフリーPBS溶液を使用します。PBSを廃棄し、細胞透過性のために予温アッセイ媒体の180マイクロリットルを加えます。パーメアビライズ後すぐに、校正されたセンサーカートリッジのユーティリティプレートをパーメアビライズされた細胞を含むセルプレートに交換し、測定を開始します。治療群は、コハク酸誘発呼吸率が高い。メトホルミン治療に対するA549細胞の応答は、ヘップG2よりも高かった。ピルビン酸の熱い誘発呼吸について、A549細胞は5〜15分の間のHep G2細胞と比較して増加した誘導を示した。同様の結果がグルタミン酸マレート誘発呼吸およびパルミトイルカルニチンの誘発呼吸について得られた。基質および阻害剤の適切な濃度を達成する。右側のボリュームを正しいポートにロードする必要があります。ある基質の代謝経路の変化が同定された場合、その経路に関与する酵素およびトランスポーターの機能を評価する必要がある。

Research

JoVE Journal

Biology

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

昆虫細胞における組換えmCD1dタンパク質の製造方法。

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

ヒト胚性幹細胞のミトコンドリア複合体活性の状態調査

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

ハイドラ内グルタチオンによって誘発される摂食応答を測定する

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

透過処理と無傷の細胞でミトコンドリア機能を評価するために高解像度呼吸計測

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

蛍光顕微鏡による生細胞内のミトコンドリアのカルシウムとミトコンドリア膜電位の同時測定

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いたLC3、p62、およびLAMP1共局在の測定によるオートファジーフラックスの評価

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

培養昆虫細胞における一過性発現および組換えタンパク質の細胞内局在

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

細胞外のフラックスを用いた Explanted 網膜組織のエネルギー代謝の測定

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...