Name: measuring mitochondrial substrate flux in recombinant perfringolysin o-permeabilized cells
Uploaded: 2021-08-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells at JoVE.com

Forfatterne takker de ansatte ved Institutt for fysiologi ved Det medisinske fakultet i Hradec Králové og Institutt for patofysiologi ved Det tredje fakultet for medisin for hjelp med kjemikalier og prøvepreparering. Dette arbeidet ble støttet av Charles Universitys tilskuddsprogrammer PROGRES Q40/02, Det tsjekkiske helsedepartementet gir NU21-01-00259, tsjekkisk science foundation grant 18-10144 og INOMED prosjekt CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 finansiert av Departementet for utdanning, ungdom og sport i Tsjekkia og av EU.

1. En dag før analysen
<ol><li>Fremstilling av reagenser og substrater.<ol>
<li>Mitokondrieanalyseløsning (MAS): Klargjør lagerløsninger for alle reagenser som beskrevet i tabell 1. Varm opp lagrene av mannitol og sukrose til 37 °C for å oppløses helt. Bland reagensene for å forberede 2x MAS, og varm deretter blandingen til 37 °C. Juster pH med 5N KOH til 7,4 (~7 ml), tilsett deretter vann for å bringe volumet opp til 1 L. Filtersterilisere og lagre aliquots ved -20 °C til måledagen.</li>
...

<ol>
	<li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion.">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li><li>Murphy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function,+biology,+and+role+in+disease:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).</li><li>Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+key+role+of+anaplerosis+and+cataplerosis+for+citric+acid+cycle+function.">The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).</li><li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics 3. , (2002).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Sta&#328;kov&#225;, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+mitochondrial+substrate+flux+in+a+mouse+model+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101 (2020).</li><li>Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+measurement+of+respiratory+activity+in+permeabilized+cells+using+extracellular+flux+analysis.">Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).</li><li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinediones+are+acute,+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier.">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).</li><li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode.">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li><li>Elkalaf, M., T&#367;ma, P., Weiszenstein, M., Pol&#225;k, J., Trnka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+probe+Methyltriphenylphosphonium+(TPMP)+inhibits+the+Krebs+cycle+enzyme+2-Oxoglutarate+dehydrogenase.">Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase.</a> PLoS One. 11 (8), 0161413 (2016).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), 21746 (2011).</li></ol>

Denne protokollen er en endring av tidligere publiserte studier7,8,9,10 og produktbrukerhåndboken. I motsetning til produsentens protokoll brukes 2x MAS i stedet for 3x MAS, siden 2× MAS er lettere å oppløse og danner ikke nedbør etter frysing. Frosne 2x MAS aliquots kan lagres opptil seks måneder og vise konsistente resultater. En annen forskjell er å inkludere ADP i komponentene i 2x M...

Mikroplatebasert respirometri har revolusjonert mitokondrieforskning ved å muliggjøre studiet av cellulær respirasjon av en liten prøvestørrelse1. Cellulær respirasjon betraktes generelt som en indikator på mitokondriefunksjon eller 'dysfunksjon', til tross for at mitokondrieområdet av funksjoner strekker seg utover energiproduksjonen2. Under aerobe forhold trekker mitokondrier ut energien som er lagret i forskjellige substrater ved å bryte ned og konvertere disse substratene til metabolske mellomprodukter som kan drive sitronsyresyklusen3 (figur 1). Den kontinuerlige strømmen av substrater er avgjørende for strømmen av sitronsyresyklusen for å generere høyenergi "elektrondonorer", som leverer elektroner til elektrontransportkjeden som genererer en protongradient over den indre mitokondriemembranen, slik at ATP-syntase kan fosforylere ADP til ATP4. Derfor må en eksperimentell design for å analyse mitokondrie respirasjon inkludere prøven natur (intakte celler, permeabiliserte celler, eller isolerte mitokondrier) og mitokondrie substrater.
Celler holder en butikk med innfødte substrater5, og mitokondrier oksiderer flere typer substrater samtidig6, noe som kompliserer tolkningen av resultater oppnådd fra eksperimenter utført på intakte celler. En vanlig tilnærming for å undersøke mitokondrie evne til å oksidere et valgt substrat er å isolere mitokondrier eller permeabilisere de undersøkte cellene5. Selv om isolerte mitokondrier er ideelle for kvantitative studier, er isolasjonsprosessen arbeidskrevende. Det står overfor tekniske vanskeligheter som behovet for stor prøvestørrelse, renhet av utbyttet og reproduserbarhet av teknikken5. Permeabiliserte celler tilbyr en løsning for ulempene ved mitokondrieisolasjon; Rutinemessige permeabiliserende midler av vaskemiddel natur er imidlertid ikke spesifikke og kan skade mitokondriemembraner5.
Rekombinant perfringolysin O (rPFO) ble tilbudt som et selektivt plasmamembranpermeabiliserende middel7, og det ble brukt vellykket i kombinasjon med en ekstracellulær fluksanalysator i flere studier7,8,9,10. Vi har modifisert en protokoll ved hjelp av rPFO for å screene mitokondrie substrat flux ved hjelp av XFe96 ekstracellulær flux analysator. I denne protokollen sammenlignes fire forskjellige substratoksidasjonsveier i to cellulære fenotyper mens de har tilstrekkelige replikeringer og riktig kontroll for hvert testet materiale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adinosine 5&#8242; -diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A5285</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8674</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A3803</td>
			<td>store at 2 - 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C2920</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D8418</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>63559</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>03777</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H7523</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(-)Malic acid disodium salt</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M9138</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid sodium salt hydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G5889</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnissium chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M2670</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>O4876</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl-DL-carnitine chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4509</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>484016</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5655</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>R8875</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Wave Desktop Software</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td></td>
			<td>Download from www.agilent.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P2256</td>
			<td>store at 2 - 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S2378</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S7903</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>W3500</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF calibrant</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Plasma membrane permeabilizer</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>102504-100</td>
			<td>Recombinant perfringolysin O (rPFO) - Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring mitochondrial substrate flux in recombinant perfringolysin o-permeabilized cells

Mitokondrie substratflux er en kjennetegn ved hver celletype, og endringer i komponentene som transportører, kanaler eller enzymer er involvert i patogenesen av flere sykdommer. Mitokondrie substrat flux kan studeres ved hjelp av intakte celler, permeabiliserte celler eller isolert mitokondrier. Undersøkelse av intakte celler støter på flere problemer på grunn av samtidig oksidasjon av forskjellige substrater. Dessuten inneholder flere celletyper interne lagre av forskjellige substrater som kompliserer resultattolkning. Metoder som mitokondrieisolasjon eller bruk av permeabiliserende midler er ikke lett reproduserbare. Det er problematisk å isolere rene mitokondrier med intakte membraner i tilstrekkelige mengder fra små prøver. Bruk av ikke-selektive permeabilisatorer forårsaker ulike grader av uunngåelig mitokondriemembranskade. Rekombinant perfringolysin O (rPFO) ble tilbudt som en mer passende permeabilizer, takket være dens evne til selektivt å permeabilisere plasmamembran uten å påvirke mitokondrieintegriteten. Når det brukes i kombinasjon med mikroplate respirometri, tillater det å teste fluxen til flere mitokondrie substrater med nok replikeringer i ett eksperiment mens du bruker et minimalt antall celler. I dette arbeidet beskriver protokollen en metode for å sammenligne mitokondrie substratfluks av to forskjellige cellulære fenotyper eller genotyper og kan tilpasses for å teste ulike mitokondrie substrater eller inhibitorer.

Begynn med å normalisere resultatene til det andre målet for baseline respirasjon for å vise verdier som oksygenforbruksrateprosent (OCR%). Resultatene av analysen vises i Figur 5, Figur 6, Figur 7 og Figur 8. Det er viktig å tildele de riktige bakgrunnsbrønnene for hver gruppe og inaktivere bakgrunnsbrønnene til andre grupper. Figur 5</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells at JoVE.com

Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells

I dette arbeidet beskriver vi en modifisert protokoll for å teste mitokondrie substratfluks ved hjelp av rekombinant perfringolysin O i kombinasjon med mikroplatebasert respirometri. Med denne protokollen viser vi hvordan metformin påvirker mitokondrie respirasjon av to forskjellige tumorcellelinjer.

Måling av mitokondrie substrat flux i rekombinante perfringolysin O-permeabiliserte celler

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or ...

Fordi det tester mitokondrier substrat flux som kan påvirkes med ulike patologier eller behandlinger. For eksempel vil vi i dag bruke den til å avsløre kreftcellerespons på Metformin-behandling. Det krever et minimalt antall celler mens du har tilstrekkelige repliker og passende kontroll for hvert distinkt materiale.Analysatoren er kun til forskningsbruk. Denne teknikken kan identifisere feil i mitokondriemetabolismen og kan brukes til å evaluere krigeres stoffer som påvirker mitokondrier. Å demonstrere prosedyren vil være Karolina Vaneckova en bachelorstudent og forskningstekniker fra laboratoriet mitt.For å begynne frø A549 celler med en tetthet på 20.000 celler per brønn i kolonner, to til 11 av en sjøhest XF 96 cellekultur mikroplate. La kolonne 1 og 12 stå tomme som bakgrunnsbrønner. Fyll de tomme brønnene med et likt volum av cellekulturmediet, og inkuber deretter cellene ved 37 grader Celsius i en fuktet inkubator med 5% karbondioksid for cellevedlegg.Etter tre til fire timer legger du til 100 mikroliter cellekulturmedium i brønnene. Behandle den eksperimentelle gruppen kolonner syv til 11 med en millimolar Metformin og kontrollgruppen med et likt volum sterilt destillert vann, og returner deretter platen til inkubatoren. For hydrering av sensorene, pipette 200 mikroliter sterilt vann per brønn inn i bruksplaten.Returner deretter sensorpatronen forsiktig mens du nedsenker sensoren i vann. Inkuber patronen i en karbondioksidfri inkubator ved 37 grader Celsius til neste dag. Slå på analysatoren og kontrollenheten.Start instrumentkontrollen og datainnsamlingsprogramvaren, og design analyseprotokollen som beskrevet i tekstmanuskriptet. Under gruppedefinisjoner oppretter du fire injeksjonsstrategier der port A avviker i henhold til det injiserte substratet og navngir strategiene etter substratene eller forkortelsene. Tilordne Oligomycin til port B, FCCP til port C og Rotenone Antimycin En blanding til port D.Create og navngi åtte grupper, under platekartet, tilordne grupper til de tilsvarende brønnene.Deretter lagrer du protokollen som en mal som er klar til bruk. La analysatorbryteren være på slik at temperaturen stabiliserer seg over natten. Neste dag, kast vannet fra strømplaten og tilsett 200 mikroliter av forvarmet kalibrant per brønn i bruksplaten.Returner patronen til den karbondioksidfrie inkubatoren til analysetidspunktet. Oppretthold en fuktighetskilde inne i inkubatoren og slå av eller reduser viftehastigheten til et minimum, for å unngå rask fordampning av kalibratoren. Forbered fem milliliter av arbeidsløsningen til substratene og inhibitorene med forvarmet to ganger mitokondrieanalyseløsning, 5% BSA og sterilt vann som beskrevet i tekstmanuskriptet.Deretter laster du injektorportene med substrat og inhibitorer som beskrevet i skattemanuskriptet. For kalibrering under fanen kjør analyse, klikk på startkjøringen for å starte analysen. Sett inn den lastede sensurpatronen og vent til kalibreringen er fullført.Forbered en 20 milliliter analysemedium, ved å blande to ganger mitokondrieanalyseløsning, sterilt vann og 5% BSA i et 50 milliliterrør. Tilsett to mikroliter med 10 mikromolar rekombinant perfringolysin O, for å oppnå en konsentrasjon på en nanomolar. Og re-suspendere blandingen med mild pipettering, unngå risting og virveling.Inkuber røret ved 37 grader Celsius til bruk. Bruk en flerkanals pipette til å vaske cellene og de tomme tomme brønnene to ganger, ved hjelp av forvarmet kalsium- og magnesiumfri PBS-løsning. Kast PBS og tilsett 180 mikroliter av det forvarmede analysemediet for cellepermeabilisering.Umiddelbart etter permeabilisering må du skifte ut verktøyplaten til den kalibrerte sensorpatronen med celleplaten som inneholder permeabiliserte celler og starte målingen. Behandlingsgruppen hadde en høyere grad av kortfattelig inspirasjon. Responsen fra A549-celler til Metformin-behandling var høyere enn Hep G2. For pyruvat malate indusert respirasjon viste A549 celler økt induksjon sammenlignet med Hep G2-celler mellom fem og 15 minutter.Lignende resultater ble oppnådd for glutamat malate indusert åndedrett og palmitoylcarnitine malate indusert respirasjon. For å oppnå riktig konsentrasjon av substrat og inhibitorer. Riktig volum må lastes inn i høyre port.Når en endring i en metabolsk bane av et bestemt substrat er identifisert, vil det være nødvendig å vurdere funksjonen til enzymer og transportører som er involvert i den banen.

Research

JoVE Journal

Biology

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Måling glutation-indusert Fôring Response i Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

Høy oppløsning respirometri å vurdere mitokondrienes funksjon i permeabilized og intakte celler

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Samtidig Måling av mitokondrie Kalsium og Mitokondriell membranpotensialet i levende celler med fluorescerende mikros

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Vurdere autophagic Flux ved å måle LC3, p62 og LAMP1 Co-lokalisering ved hjelp av flerspektral bildeflow-cytometri

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Et grafisk brukergrensesnitt for programvareassistert sporing av proteinkonsentrasjon i dynamiske cellulære protrusjoner

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Forbigående Expression og cellulær lokalisering av rekombinante proteiner i dyrkede insektceller

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Måling av energi Metabolism i Explanted netthinnen vev ekstracellulære Flux analyse

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...