Name: measuring mitochondrial substrate flux in recombinant perfringolysin o-permeabilized cells
Uploaded: 2021-08-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells at JoVE.com

Os autores agradecem aos funcionários do Departamento de Fisiologia da Faculdade de Medicina de Hradec Králové e do Departamento de Fisiopatologia da Terceira Faculdade de Medicina pela ajuda com a preparação de produtos químicos e amostras. Este trabalho foi apoiado pelos programas de bolsas da Universidade Charles PROGRES Q40/02, O Ministério da Saúde tcheco concede nu21-01-00259, a Fundação Tcheca de Ciências concede 18-10144 e o projeto INOMED CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 financiado pelo Ministério da Educação, Juventude e Esportes da República Tcheca e pela União Europeia.

1. Um dia antes do ensaio
<ol><li>Preparação de reagentes e substratos.<ol>
<li>Solução de ensaio mitocondrial (MAS): Prepare soluções de estoque de todos os reagentes descritos na Tabela 1. Aqueça os estoques de manitol e sacarose a 37 °C para dissolver completamente. Misture os reagentes para preparar 2x MAS e aqueça a mistura a 37 °C. Ajuste o pH com 5N KOH para 7,4 (~7 mL), depois adicione água para levar o volume até 1 L. Estérilize o filtro e armazene as alíquotas a -20 °C até o ...

<ol>
	<li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion.">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li><li>Murphy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function,+biology,+and+role+in+disease:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).</li><li>Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+key+role+of+anaplerosis+and+cataplerosis+for+citric+acid+cycle+function.">The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).</li><li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics 3. , (2002).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Sta&#328;kov&#225;, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+mitochondrial+substrate+flux+in+a+mouse+model+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101 (2020).</li><li>Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+measurement+of+respiratory+activity+in+permeabilized+cells+using+extracellular+flux+analysis.">Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).</li><li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinediones+are+acute,+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier.">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).</li><li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode.">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li><li>Elkalaf, M., T&#367;ma, P., Weiszenstein, M., Pol&#225;k, J., Trnka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+probe+Methyltriphenylphosphonium+(TPMP)+inhibits+the+Krebs+cycle+enzyme+2-Oxoglutarate+dehydrogenase.">Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase.</a> PLoS One. 11 (8), 0161413 (2016).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), 21746 (2011).</li></ol>

Este protocolo é uma modificação dos estudos publicados anteriormente7,8,9,10 e o guia do usuário do produto. Em contraste com o protocolo do fabricante, o 2x MAS é usado em vez de 3x MAS, uma vez que 2× MAS é mais fácil de dissolver e não forma precipitações após o congelamento. Alíquotas MAS 2x congeladas podem ser armazenadas até seis meses e mostrar resultados consistentes. Ou...

A respirometria baseada em microplacar revolucionou a pesquisa mitocondrial, permitindo o estudo da respiração celular de um pequeno tamanho amostral1. A respiração celular é geralmente considerada como um indicador de função mitocondrial ou "disfunção", apesar do fato de que a gama mitocondrial de funções se estende além da produção de energia2. Em condições aeróbicas, as mitocôndrias extraem a energia armazenada em diferentes substratos, quebrando e convertendo esses substratos em intermediários metabólicos que podem alimentar o ciclo do ácido cítrico3 (Figura 1). O fluxo contínuo de substratos é essencial para o fluxo do ciclo do ácido cítrico gerar "doadores de elétrons" de alta energia, que fornecem elétrons para a cadeia de transporte de elétrons que gera um gradiente de prótons através da membrana mitocondrial interna, permitindo atp-synthase para fosforilato ADP para ATP4. Portanto, um projeto experimental para avaliar a respiração mitocondrial deve incluir a natureza amostral (células intactas, células permeabilizadas ou mitocôndrias isoladas) e substratos mitocondriais.
As células mantêm um estoque de substratos indígenas5, e mitocôndrias oxidam vários tipos de substratos simultaneamente6, o que complica a interpretação dos resultados obtidos a partir de experimentos realizados em células intactas. Uma abordagem comum para investigar a capacidade mitocondrial de oxidar um substrato selecionado é isolar mitocôndrias ou permeabiliizar as células investigadas5. Embora mitocôndrias isoladas sejam ideais para estudos quantitativos, o processo de isolamento é trabalhoso. Enfrenta dificuldades técnicas como a necessidade de grande tamanho amostral, pureza do rendimento e reprodutibilidade da técnica5. As células permeabilizadas oferecem uma solução para as desvantagens do isolamento mitocondrial; no entanto, os agentes de permeabilização de rotina da natureza detergente não são específicos e podem danificar as membranas mitocondriais5.
A perfringolysina recombinante O (rPFO) foi oferecida como um agente de permeabilizing de membrana plasmática seletiva7, e foi utilizada com sucesso em combinação com um analisador de fluxo extracelular em vários estudos7,8,9,10. Modificamos um protocolo usando rPFO para tela de flux de substrato mitocondrial usando o analisador de fluxo extracelular XFe96. Neste protocolo, quatro diferentes vias oxidantes de substratos em dois fenótipos celulares são comparadas, tendo réplicas suficientes e o controle adequado para cada material testado.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adinosine 5&#8242; -diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A5285</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8674</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A3803</td>
			<td>store at 2 - 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C2920</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D8418</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>63559</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>03777</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H7523</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(-)Malic acid disodium salt</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M9138</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid sodium salt hydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G5889</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnissium chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M2670</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>O4876</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl-DL-carnitine chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4509</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>484016</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5655</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>R8875</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Wave Desktop Software</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td></td>
			<td>Download from www.agilent.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P2256</td>
			<td>store at 2 - 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S2378</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S7903</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>W3500</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF calibrant</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Plasma membrane permeabilizer</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>102504-100</td>
			<td>Recombinant perfringolysin O (rPFO) - Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring mitochondrial substrate flux in recombinant perfringolysin o-permeabilized cells

O flux de substrato mitocondrial é uma característica distintiva de cada tipo de célula, e mudanças em seus componentes como transportadores, canais ou enzimas estão envolvidas na patogênese de várias doenças. Flux de substrato mitocondrial pode ser estudado usando células intactas, células permeabilizadas ou mitocôndrias isoladas. Investigar células intactas encontra vários problemas devido à oxidação simultânea de diferentes substratos. Além disso, vários tipos de células contêm lojas internas de diferentes substratos que complicam a interpretação dos resultados. Métodos como isolamento mitocondrial ou uso de agentes permeabilizantes não são facilmente reprodutíveis. Isolar mitocôndrias puras com membranas intactas em quantidades suficientes de pequenas amostras é problemático. O uso de permeabilizers não seletivos causa vários graus de danos inevitáveis da membrana mitocondrial. A perfringolysina recombinante O (rPFO) foi oferecida como um permeabilizer mais apropriado, graças à sua capacidade de permeabilize seletivamente a membrana plasmática sem afetar a integridade mitocondrial. Quando usado em combinação com respirometria de microplaco, permite testar o fluxo de vários substratos mitocondriais com réplicas suficientes dentro de um experimento enquanto usa um número mínimo de células. Neste trabalho, o protocolo descreve um método para comparar o flux de substrato mitocondrial de dois fenótipos ou genótipos celulares diferentes e pode ser personalizado para testar vários substratos mitocondriais ou inibidores.

Comece pela normalização dos resultados para a segunda medição da respiração da linha de base para mostrar valores como percentual de taxa de consumo de oxigênio (OCR%). Os resultados do ensaio são mostrados nas Figuras 5,Figura 6,Figura 7 e Figura 8. É importante atribuir os poços de fundo adequados para cada grupo e inativar os poços de fundo de outros gru...

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Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells

Neste trabalho, descrevemos um protocolo modificado para testar o flux de substrato respiratório mitocondrial usando perfringolysina recombinante O em combinação com respirometria à base de microplato. Com este protocolo, mostramos como a metformina afeta a respiração mitocondrial de duas linhas diferentes de células tumorais.

Medindo flux de substrato mitocondrial em células o-permeabilizadas de permeabilized recombinante

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or ...

Porque testa o flux de substrato mitocôndria que pode ser afetado com diferentes patologias ou tratamentos. Por exemplo, hoje vamos usá-lo para revelar a resposta das células cancerígenas ao tratamento com Metformina. Requer um número mínimo de células, tendo réplicas suficientes e controle adequado para cada material distinto.O analisador é apenas para uso de pesquisa. Esta técnica pode identificar erros no metabolismo mitocondrial e pode ser usada para avaliar drogas de guerreiros que afetam mitocôndrias. Demonstrando o procedimento será Karolina Vaneckova uma estudante de graduação e técnica de pesquisa do meu laboratório.Para começar as células A549 de sementes a uma densidade de 20.000 células por poço em colunas, de duas a 11 de uma micro-placa de cultura celular XF 96. Deixando as colunas um e 12 vazias como poços de fundo. Encha os poços em branco com um volume igual do meio de cultura celular, em seguida, incubar as células a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono para fixação celular.Depois de três a quatro horas, adicione 100 microliters de meio de cultura celular nos Poços. Trate as colunas de grupo experimentais de 7 a 11 com um Metformin mililitro e o grupo controle com um volume igual de água destilada estéril e, em seguida, devolva a placa à incubadora. Para hidratar os sensores, pipeta 200 microliters de água estéril por poço na placa de utilidade.Em seguida, devolva cuidadosamente o cartucho do sensor enquanto imergi o sensor na água. Incubar o cartucho em uma incubadora livre de dióxido de carbono a 37 graus Celsius até o dia seguinte. Ligue o analisador e a unidade de controle.Inicie o software de controle de instrumentos e aquisição de dados e projete o protocolo de ensaio conforme descrito no manuscrito do texto. Sob definições de grupo, crie quatro estratégias de injeção onde a porta A difere de acordo com o substrato injetado e nomeie as estratégias após os substratos ou abreviaturas. Designe oligomicina à porta B, FCCP à mistura de antimicina de porta C e Rotenone A para porta D.Criar e nomear oito grupos, sob o mapa da placa, atribuir grupos aos Poços correspondentes.Em seguida, salve o protocolo como um modelo pronto para usar. Deixe o interruptor do analisador ligado para permitir que a temperatura se estabilize durante a noite. No dia seguinte, descarte a água da placa de utilidade e adicione 200 microliters do calibrante pré-aquecido por poço na placa de utilidade.Devolva o cartucho à incubadora sem dióxido de carbono até o momento do ensaio. Mantenha uma fonte de umidade dentro da incubadora e desligue ou reduza a velocidade do ventilador ao mínimo, para evitar a rápida evaporação do calibrador. Prepare cinco mililitros da solução de trabalho dos substratos e inibidores com solução de ensaio mitocondrial pré-aquecida duas vezes, 5%BSA e água estéril como descrito no manuscrito do texto.Em seguida, carregue as portas injetoras com substrato e inibidores, conforme descrito no manuscrito fiscal. Para calibrar sob a guia de ensaio de execução, clique na execução inicial para iniciar o ensaio. Insira o cartucho de censura carregado e aguarde que a calibração seja concluída.Prepare 20 mililitros de meio de ensaio, misturando duas vezes a solução de ensaio mitocondrial, água estéril e 5%BSA em um tubo de 50 mililitros. Adicione dois microliters de 10 micromolars recombinante perfringolysin O, para atingir uma concentração de um nanomolar. E suspenda a mistura com tubulação suave, evitando tremores e vórtices.Incubar o tubo a 37 graus Celsius até usar. Use uma pipeta multicanal para lavar as células e os Poços vazios em branco duas vezes, usando solução PBS pré-aquecida de cálcio e magnésio. Descarte o PBS e adicione 180 microliters do meio de ensaio pré-aquecido para permeabilização celular.Imediatamente após a permeabilização substitua a placa de utilidade do cartucho do sensor calibrado pela placa celular contendo células permeabilizadas e inicie a medição. O grupo de tratamento apresentou maior taxa de respiração induzida por succinato. A resposta das células A549 ao tratamento de Metformina foi maior que a hep G2. Para a respiração induzida pelo piruvato malato, as células A549 apresentaram aumento da indução em comparação com as células hep G2 entre cinco a 15 minutos.Resultados semelhantes foram obtidos para respiração induzida por glutamato e respiração induzida por malato palmitoylcarnitine. Para atingir a concentração certa de substrato e inibidores. O volume certo deve ser carregado na porta direita.Quando uma mudança em uma via metabólica de um determinado substrato é identificada, será necessário avaliar a função das enzimas e transportadores envolvidos nessa via.

Research

JoVE Journal

Biology

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

Um método para produção de proteína recombinante em células de inseto mCD1d.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Biologia

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Sondagem para a Atividade Complexo mitocondrial em células estaminais embrionárias humanas

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Medindo alimentação resposta induzida por glutationa em Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

De alta resolução Respirometria para avaliar a função mitocondrial em permeabilizadas e células intactas

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Medição simultânea de mitocondrial de cálcio e mitocondrial potencial de membrana em células vivas por Microscopia fluorescente

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Avaliando o Fluxo Autofágico Medindo LC3, p62 e LAMP1 Co-localization Usando a Citometria de Fluxo de Imagem Multiespectral

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Uma interface de usuário gráfica para rastreamento assistido por software da concentração de proteínas em protrusões celulares dinâmicas

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Expressão transitória e Celular Localização de proteínas recombinantes em células de cultura de insectos

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Medição do metabolismo energético, no tecido da retina explantado, usando análise de fluxo extracelular

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...