Name: measuring mitochondrial substrate flux in recombinant perfringolysin o-permeabilized cells
Uploaded: 2021-08-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells at JoVE.com

Авторы благодарят сотрудников кафедры физиологии медицинского факультета в Градце Кралове и кафедры патофизиологии третьего медицинского факультета за помощь в подготовке химических веществ и образцов. Эта работа была поддержана грантовыми программами Карлова университета PROGRES Q40/02, грантом Министерства здравоохранения Чехии NU21-01-00259, грантом Чешского научного фонда 18-10144 и проектом INOMED CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046, финансируемым Министерством образования, молодежи и спорта Чешской Республики и Европейским союзом.

1. За день до анализа
<ol><li>Подготовка реагентов и субстратов.<ol>
<li>Раствор для митохондриального анализа (MAS): Подготовьте исходные растворы всех реагентов, как описано в таблице 1. Разогрейте запасы маннитола и сахарозы до 37 °C, чтобы полностью раствориться. Смешайте реагенты дл?...

<ol>
	<li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion.">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li><li>Murphy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function,+biology,+and+role+in+disease:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).</li><li>Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+key+role+of+anaplerosis+and+cataplerosis+for+citric+acid+cycle+function.">The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).</li><li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics 3. , (2002).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Sta&#328;kov&#225;, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+mitochondrial+substrate+flux+in+a+mouse+model+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101 (2020).</li><li>Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+measurement+of+respiratory+activity+in+permeabilized+cells+using+extracellular+flux+analysis.">Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).</li><li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinediones+are+acute,+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier.">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).</li><li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode.">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li><li>Elkalaf, M., T&#367;ma, P., Weiszenstein, M., Pol&#225;k, J., Trnka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+probe+Methyltriphenylphosphonium+(TPMP)+inhibits+the+Krebs+cycle+enzyme+2-Oxoglutarate+dehydrogenase.">Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase.</a> PLoS One. 11 (8), 0161413 (2016).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), 21746 (2011).</li></ol>

Данный протокол является модификацией ранее опубликованных исследований7,8,9,10 и руководства пользователя продукта. В отличие от протокола производителя, вместо 3x MAS используется 2x MAS, так как 2×x MAS легче растворяется ?...

Микропластичная респирометрия произвела революцию в митохондриальных исследованиях, позволив изучать клеточное дыхание небольшого размера выборки1. Клеточное дыхание обычно рассматривается как показатель митохондриальной функции или «дисфункции», несмотря на то, что диапазон функций митохондрий простирается за пределы производства энергии2. В аэробных условиях митохондрии извлекают энергию, хранящуюся в различных субстратах, разрушая и превращая эти субстраты в метаболические промежуточные продукты, которые могут подпитывать цикл лимонной кислоты3 (рисунок 1). Непрерывный поток субстратов необходим для потока цикла лимонной кислоты для генерации высокоэнергетических «доноров электронов», которые доставляют электроны в цепочку переноса электронов, которая генерирует протонный градиент через внутреннюю митохондриальную мембрану, позволяя АТФ-синтазе фосфорилировать АДФ к АТФ4. Поэтому экспериментальная конструкция для анализа митохондриального дыхания должна включать природу образца (интактные клетки, пермеабилизированные клетки или изолированные митохондрии) и митохондриальные субстраты.
Клетки хранят запас местных субстратов5,а митохондрии окисляют несколько типов субстратов одновременно6,что усложняет интерпретацию результатов, полученных в результате экспериментов, проведенных на интактных клетках. Распространенным подходом к исследованию способности митохондрий окислять выбранный субстрат является выделение митохондрий или пермеабилизация исследуемых клеток5. Хотя изолированные митохондрии идеально подходят для количественных исследований, процесс выделения трудоемкий. Он сталкивается с техническими трудностями, такими как необходимость большого размера выборки, чистота выхода и воспроизводимость метода5. Пермеабилизированные клетки предлагают решение для недостатков митохондриальной изоляции; однако обычные пермеабилизирующие агенты моющей природы не являются специфическими и могут повредить митохондриальные мембраны5.
Рекомбинантный перфринголизин O (rPFO) предлагали в качестве селективного проницателя плазматической мембраны7,и он успешно применялся в комбинации с внеклеточным анализатором флюса в нескольких исследованиях7,8,9,10. Мы модифицировали протокол с использованием rPFO для скрининга потока митохондриальной субстраты с помощью анализатора внеклеточного потока XFe96. В этом протоколе сравниваются четыре различных пути окисления субстрата в двух клеточных фенотипах, имея достаточные реплики и надлежащий контроль для каждого тестируемого материала.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adinosine 5&#8242; -diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A5285</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8674</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A3803</td>
			<td>store at 2 - 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C2920</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D8418</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>63559</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>03777</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H7523</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(-)Malic acid disodium salt</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M9138</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid sodium salt hydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G5889</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnissium chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M2670</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>O4876</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl-DL-carnitine chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4509</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>484016</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5655</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>R8875</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Wave Desktop Software</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td></td>
			<td>Download from www.agilent.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P2256</td>
			<td>store at 2 - 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S2378</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S7903</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>W3500</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF calibrant</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Plasma membrane permeabilizer</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>102504-100</td>
			<td>Recombinant perfringolysin O (rPFO) - Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring mitochondrial substrate flux in recombinant perfringolysin o-permeabilized cells

Поток митохондриального субстрата является отличительной характеристикой каждого типа клеток, и изменения в его компонентах, таких как транспортеры, каналы или ферменты, участвуют в патогенезе нескольких заболеваний. Поток митохондриального субстрата может быть изучен с использованием интактных клеток, пермеабилизированных клеток или изолированных митохондрий. Исследование интактных клеток сталкивается с несколькими проблемами из-за одновременного окисления различных субстратов. Кроме того, несколько типов клеток содержат внутренние хранилища различных субстратов, что затрудняет интерпретацию результатов. Такие методы, как изоляция митохондрий или использование пермеабилизирующих агентов, нелегко воспроизвести. Выделение чистых митохондрий с интактными мембранами в достаточном количестве из небольших образцов проблематично. Использование неселективных пермеабилизаторов вызывает различные степени неизбежного повреждения митохондриальной мембраны. Рекомбинантный перфринголизин O (rPFO) был предложен в качестве более подходящего пермеабилизатора, благодаря его способности избирательно проникать плазматической мембраной, не влияя на целостность митохондрий. При использовании в сочетании с микропластинчатой респирометрией он позволяет тестировать поток нескольких митохондриальных субстратов с достаточным количеством реплик в рамках одного эксперимента при использовании минимального количества клеток. В этой работе протокол описывает метод сравнения потока митохондриального субстрата двух разных клеточных фенотипов или генотипов и может быть настроен для тестирования различных митохондриальных субстратов или ингибиторов.

Начните с нормализации результатов до второго измерения исходного дыхания, чтобы показать значения в процентах коэффициента потребления кислорода (OCR%). Результаты анализа показаны на рисунках 5, 6, 7 и 8. ...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells at JoVE.com

Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells

В этой работе мы описываем модифицированный протокол для тестирования потока митохондриального дыхательного субстрата с использованием рекомбинантного перфринголизина O в сочетании с микропластинчатой респирометрией. С помощью этого протокола мы показываем, как метформин влияет на митохондриальное дыхание двух разных линий опухолевых клеток.

Измерение потока митохондриального субстрата в рекомбинантных перфринголизиновых O-пермеабилизированных клетках

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or ...

Потому что он тестирует поток субстрата митохондрий, который может быть затронут различными патологиями или методами лечения. Например, сегодня мы будем использовать его, чтобы выявить реакцию раковых клеток на лечение метформином. Он требует минимального количества клеток, имея при этом достаточные реплики и соответствующий контроль для каждого отдельного материала.Анализатор предназначен только для исследовательского использования. Этот метод может выявлять ошибки в митохондриальном метаболизме и может быть использован для оценки лекарств воинов, влияющих на митохондрии. Продемонстрировать процедуру будет Каролина Ванецкова, студентка бакалавриата и техник-исследователь из моей лаборатории.Для начала посева клеток А549 при плотности 20 000 клеток на лунку в колоннах, от двух до 11 микропластинки культуры клеток морского конька XF 96. Оставляя колонны один и 12 пустыми в качестве фоновых колодцев. Заполните пустой Колодец равным объемом клеточной питательной среды, затем инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия в увлажненном инкубаторе с 5% углекислым газом для прикрепления клеток.Через три-четыре часа добавить 100 микролитров клеточной питательной среды в лунки. Обработайте экспериментальную группу колоннами с семи до 11 одним миллимоляром Метформином, а контрольную группу равным объемом стерильной дистиллированной воды, затем верните пластину в инкубатор. Для гидратации датчиков пипетка 200 микролитров стерильной воды на скважину в подсобную плиту.Затем осторожно верните картридж датчика, погружая датчик в воду. Инкубируйте картридж в инкубаторе без углекислого газа при температуре 37 градусов Цельсия до следующего дня. Включите анализатор и блок управления.Запустите программное обеспечение для управления прибором и сбора данных и разработайте протокол анализа, как описано в текстовой рукописи. В соответствии с групповыми определениями создайте четыре стратегии впрыска, где порт A отличается в зависимости от инжектируемой субстрата, и назовите стратегии после субстратов или аббревиатур. Назначьте Олигомицин в порт B, FCCP в порт C и смесь Rotenone Antimycin A в порт D. Создайте и назовите восемь групп, под картой пластин, назначьте группы соответствующим скважинам.Затем сохраните протокол как готовый к использованию шаблон. Оставьте анализатор включенным, чтобы температура стабилизировалась в течение ночи. На следующий день выбросьте воду с полезной пластины и добавьте 200 микролитров предварительно нагретого калибранта на скважину в полезную пластину.Верните картридж в инкубатор без углекислого газа до момента анализа. Поддерживайте источник влажности внутри инкубатора и выключите или уменьшите скорость вращения вентилятора до минимума, чтобы избежать быстрого испарения калибранта. Готовят пять миллилитров рабочего раствора субстратов и ингибиторов предварительно нагретым дважды митохондриальным пробирным раствором, 5% BSA и стерильной водой, как описано в тексте рукописи.Затем загрузите порты инжектора субстратом и ингибиторами, как описано в налоговой рукописи. Для калибровки на вкладке анализа запуска нажмите на начальный запуск, чтобы начать анализ. Вставьте заряженный картридж цензора и дождитесь завершения калибровки.Приготовьте 20 миллилитров пробирной среды, смешивая два раза митохондриальный пробирный раствор, стерильную воду и 5% BSA в 50-миллилитровой трубке. Добавьте два микролитра 10 микромолярного рекомбинантного перфринголизина O, чтобы получить концентрацию одного наномоляра. И повторно приостановить смесь с щадящим пипетированием, избегая тряски и вихря.Инкубируйте трубку при температуре 37 градусов Цельсия до использования. Используйте многоканальную пипетку для промывки клеток и пустых колодцев два раза, используя предварительно подогретый раствор PBS без кальция и магния. Отбросьте PBS и добавьте 180 микролитров предварительно подогретой пробирной среды для проницаемости клеток.Сразу после пермеабилизации замените полезную пластину калиброванного картриджа датчика на пластину ячейки, содержащую пермеабилизированные ячейки, и начните измерение. Группа лечения имела более высокий уровень сукцинат-индуцированного дыхания. Реакция клеток A549 на лечение метформином была выше, чем Hep G2. Для дыхания, индуцированного пируват-малатом, клетки A549 показали повышенную индукцию по сравнению с клетками Hep G2 от пяти до 15 минут.Аналогичные результаты были получены для дыхания, индуцированного глутамат малатом, и дыхания, индуцированного пальмитоилкарнитин малатом. Для достижения правильной концентрации субстрата и ингибиторов. Нужный том должен быть загружен в нужный порт.При выявлении изменения метаболического пути определенного субстрата необходимо будет оценить функцию ферментов и транспортеров, участвующих в этом пути.

Research

JoVE Journal

Biology

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

Способ получения рекомбинантного белка mCD1d в клетках насекомых.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Зондирование для митохондриального комплекса активность в эмбриональных стволовых клеток человека

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Измерение глутатион-индуцированной кормления ответ в Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

Высокое разрешение респирометрии для оценки митохондриальной функции в проницаемыми и неповрежденных клеток

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Одновременное измерение митохондриальной кальция и митохондриальной мембраны Потенциал в живых клетках с помощью флуоресцентной микроскопии

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Оценка аутофагического потока путем измерения локализации LC3, p62 и LAMP1 с использованием мультиспектральной визуальной проточной цитометрии

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Графический пользовательский интерфейс для отслеживания концентрации белка в программном сопровождении в динамических клеточных выпячиваниях

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Кратковременная экспрессия и клеточная локализация рекомбинантных белков в культивируемых клетках насекомых

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Измерение энергии метаболизма в описаны ткани сетчатки, с помощью анализа внеклеточного Flux

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...