Name: measuring mitochondrial substrate flux in recombinant perfringolysin o-permeabilized cells
Uploaded: 2021-08-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells at JoVE.com

Författarna tackar personalen vid institutionen för fysiologi vid medicinska fakulteten i Hradec Králové och Institutionen för patofysiologi vid tredje medicinska fakulteten för hjälpen med kemikalier och proverberedning. Detta arbete stöddes av Charles Universitys stipendieprogram PROGRES Q40/02, Tjeckiska hälsoministeriets bidrag NU21-01-00259, tjeckisk vetenskapsstiftelsebidrag 18-10144 och INOMED-projektet CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 finansierat av Tjeckiens utbildnings-, ungdoms- och idrottsministerium.

1. En dag före analysen
<ol><li>Beredning av reagenser och substrat.<ol>
<li>Mitokondriell analyslösning (MAS): Förbered lagerlösningar för alla reagenser enligt beskrivningen i tabell 1. Värm lagren av mannitol och sackaros till 37 °C för att lösa upp helt. Blanda reagenserna för att förbereda 2x MAS och värm sedan blandningen till 37 °C. Justera pH-värdet med 5N KOH till 7,4 (~7 ml), tillsätt sedan vatten för att få upp volymen till 1 L. Filtersterilisera och förvara alikvoterna vi...

<ol>
	<li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion.">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li><li>Murphy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function,+biology,+and+role+in+disease:+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).</li><li>Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+key+role+of+anaplerosis+and+cataplerosis+for+citric+acid+cycle+function.">The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).</li><li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics 3. , (2002).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Sta&#328;kov&#225;, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+mitochondrial+substrate+flux+in+a+mouse+model+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101 (2020).</li><li>Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+measurement+of+respiratory+activity+in+permeabilized+cells+using+extracellular+flux+analysis.">Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).</li><li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinediones+are+acute,+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier.">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).</li><li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode.">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li><li>Elkalaf, M., T&#367;ma, P., Weiszenstein, M., Pol&#225;k, J., Trnka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+probe+Methyltriphenylphosphonium+(TPMP)+inhibits+the+Krebs+cycle+enzyme+2-Oxoglutarate+dehydrogenase.">Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase.</a> PLoS One. 11 (8), 0161413 (2016).</li><li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), 21746 (2011).</li></ol>

Detta protokoll är en ändring av tidigare publicerade studier7,8,9,10 och produktens användarhandbok. I motsats till tillverkarens protokoll används 2x MAS istället för 3x MAS, eftersom 2× MAS är lättare att lösa upp och inte bildar nederbörd efter frysning. Frysta 2x MAS alikvoter kan lagras upp till sex månader och visa konsekventa resultat. En annan skillnad är att inkludera ADP...

Mikroplatebaserad respirometri har revolutionerat mitokondriell forskning genom att möjliggöra studier av cellandning av ett litet provstorlek1. Cellulär andning anses i allmänhet vara en indikator på mitokondriell funktion eller "dysfunktion", trots att det mitokondriella utbudet av funktioner sträcker sig utöver energiproduktion2. Under aeroba förhållanden extraherar mitokondrier den energi som lagras i olika substrat genom att bryta ner och omvandla dessa substrat till metaboliska intermediärer som kan driva citronsyracykeln3 (figur 1). Det kontinuerliga flödet av substrat är avgörande för flödet av citronsyracykeln för att generera högenergi "elektrondonatorer", som levererar elektroner till elektrontransportkedjan som genererar en protongradient över det inre mitokondriella membranet, vilket gör det möjligt för ATP-syntas att fosforylera ADP till ATP4. Därför måste en experimentell design för att analysera mitokondriell andning omfatta provnaturen (intakta celler, permeabiliserade celler eller isolerade mitokondrier) och mitokondriella substrat.
Celler håller ett lager av inhemska substrat5, och mitokondrier oxiderar flera typer av substrat samtidigt6, vilket komplicerar tolkningen av resultat som erhållits från experiment som utförs på intakta celler. Ett vanligt tillvägagångssätt för att undersöka mitokondriell förmåga att oxidera ett valt substrat är att isolera mitokondrier eller permeabilisera de undersökta cellerna5. Även om isolerade mitokondrier är idealiska för kvantitativa studier, är isoleringsprocessen mödosam. Det står inför tekniska svårigheter som behovet av stor provstorlek, renhet av utbytet och reproducerbarhet av tekniken5. Permeabiliserade celler erbjuder en lösning för nackdelarna med mitokondriell isolering; Rutinmässiga permeabiliserande medel av tvättmedelskaraktär är dock inte specifika och kan skada mitokondriella membran5.
Rekombinant perfringolysin O (rPFO) erbjöds som ett selektivt plasmameabiliserande medel7, och det användes framgångsrikt i kombination med en extracellulär flödesanalysator i flera studier7,8,9,10. Vi har modifierat ett protokoll med rPFO för att screena mitokondriellt substratflöde med XFe96 extracellulär flödesanalysator. I detta protokoll jämförs fyra olika substratoxiderande vägar i två cellulära fenotyper samtidigt som de har tillräckliga replikat och rätt kontroll för varje testat material.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adinosine 5&#8242; -diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A5285</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A8674</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A3803</td>
			<td>store at 2 - 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C2920</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D8418</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>63559</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>03777</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H7523</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(-)Malic acid disodium salt</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M9138</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid sodium salt hydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G5889</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnissium chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M2670</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>O4876</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl-DL-carnitine chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4509</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>484016</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P5655</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>R8875</td>
			<td>store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Wave Desktop Software</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td></td>
			<td>Download from www.agilent.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P2256</td>
			<td>store at 2 - 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S2378</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S7903</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>W3500</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF calibrant</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF Plasma membrane permeabilizer</td>
			<td>Agilent technologies</td>
			<td>102504-100</td>
			<td>Recombinant perfringolysin O (rPFO) - Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring mitochondrial substrate flux in recombinant perfringolysin o-permeabilized cells

Mitokondriellt substratflöde är en särskiljande egenskap hos varje celltyp, och förändringar i dess komponenter som transportörer, kanaler eller enzymer är involverade i patogenesen vid flera sjukdomar. Mitokondriellt substratflöde kan studeras med intakta celler, permeabiliserade celler eller isolerade mitokondrier. Att undersöka intakta celler stöter på flera problem på grund av samtidig oxidation av olika substrat. Dessutom innehåller flera celltyper interna lager av olika substrat som komplicerar resultattolkningen. Metoder som mitokondriell isolering eller användning av permeabiliserande medel är inte lätt reproducerbara. Att isolera rena mitokondrier med intakta membran i tillräckliga mängder från små prover är problematiskt. Användning av icke-selektiva permeabilizers orsakar olika grader av oundviklig mitokondriell membranskada. Rekombinant perfringolysin O (rPFO) erbjöds som en lämpligare permeabilizer, tack vare dess förmåga att selektivt permeabilize plasma membran utan att påverka mitokondriell integritet. När det används i kombination med mikroplatta respirometry, det gör det möjligt att testa flödet av flera mitokondriella substrat med tillräckligt med replikater inom ett experiment samtidigt som man använder ett minimalt antal celler. I detta arbete beskriver protokollet en metod för att jämföra mitokondriellt substratflöde av två olika cellulära fenotyper eller genotyper och kan anpassas för att testa olika mitokondriella substrat eller hämmare.

Börja med att normalisera resultaten till den andra mätningen av baslinjeandning för att visa värden som syreförbrukningsprocent (OCR%). Resultaten av analysen visas i figurerna 5,figur 6,figur 7 och figur 8. Det är viktigt att tilldela rätt bakgrundsbrunnar för varje grupp och inaktivera bakgrundsbrunnarna i andra grupper. Figur 5...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells at JoVE.com

Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells

I detta arbete beskriver vi ett modifierat protokoll för att testa mitokondriellt luftvägarna substrat flux med rekombinant perfringolysin O i kombination med mikroplate-baserade respirometry. Med detta protokoll visar vi hur metformin påverkar mitokondriell andning av två olika tumör cellinjer.

Mätning av mitokondriellt substratflöde i rekombinanta perfringolysin O-permeabiliserade celler

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or ...

Eftersom det testar mitokondrier substratflöde som kan påverkas med olika patologier eller behandlingar. Till exempel kommer vi idag att använda den för att avslöja cancercellssvar på Metformin-behandling. Det kräver ett minimalt antal celler samtidigt som det har tillräckligt med replikat och lämplig kontroll för varje distinkt material.Analysatorn är endast för forskningsbruk. Denna teknik kan identifiera fel i mitokondriell metabolism och kan användas för att utvärdera krigare droger som påverkar mitokondrier. Karolina Vaneckova kommer att demonstrera proceduren och en grundstudent och forskningstekniker från mitt laboratorium.För att börja såD549 celler med en densitet av 20 000 celler per brunn i kolumner, två till 11 av en sjöhäst XF 96 cellkultur mikroplatta. Lämna kolumnerna ett och 12 tomma som bakgrundsbrunnar. Fyll de tomma brunnarna med en lika stor volym av cellodlingsmediet och inkubera sedan cellerna vid 37 grader Celsius i en fuktad inkubator med 5% koldioxid för cellfäste.Efter tre till fyra timmar, tillsätt 100 mikroliter av cellodlingsmedium i Brunnarna. Behandla de experimentella grupppelarna sju till elva med en millimolar Metformin och kontrollgruppen med lika stor mängd sterilt destillerat vatten och returnera sedan plattan till inkubatorn. För hydratisering av sensorerna, pipettera 200 mikroliter sterilt vatten per brunn in i verktygsplattan.Sätt sedan tillbaka sensorpatronen försiktigt medan sensorn sänks ned i vatten. Inkubera patronen i en koldioxidfri inkubator vid 37 grader Celsius till nästa dag. Slå på analysatorn och styrenheten.Starta programvaran för instrumentkontroll och datainsamling och utforma analysprotokollet enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Under gruppdefinitioner skapar du fyra injektionsstrategier där port A skiljer sig beroende på det injicerade substratet och namnger strategierna efter substrat eller förkortningar. Tilldela Oligomycin till port B, FCCP till port C och Rotenone Antimycin A blandning till port D.Create och namnge åtta grupper, under plåtkartan, tilldela grupper till motsvarande brunnar.Spara sedan protokollet som en färdig mall. Låt analysatorn slås på så att temperaturen stabiliseras över natten. Nästa dag kassera vattnet från bruksplattan och tillsätt 200 mikroliter av den förvärmda kalibern per brunn i verktygsplattan.Sätt tillbaka patronen till den koldioxidfria inkubatorn tills analysen kommer. Behåll en fuktkälla inuti inkubatorn och stäng av eller minska fläkthastigheten till ett minimum, för att undvika snabb avdunstning av kalibreringen. Förbered fem milliliter av arbetslösningen hos substrat och hämmare med förvärmd två gånger mitokondriell analyslösning, 5%BSA och sterilt vatten enligt beskrivningen i textmanuskriptet.Ladda sedan injektorportarna med substrat och hämmare enligt beskrivningen i skattemanuskriptet. För kalibrering under fliken köranalys, klicka på startkörningen för att starta analysen. Sätt i den laddade censurpatronen och vänta tills kalibreringen är klar.Förbered ett 20 ml analysmedium genom att blanda två gånger mitokondriell analyslösning, sterilt vatten och 5% BSA i ett 50 ml-rör. Tillsätt två mikroliter av 10 mikromolära rekombinanta perfringolysin O, för att uppnå en koncentration av en nanomolar. Och suspendera blandningen igen med mild pipettering, undvik att skaka och virvla.Inkubera röret vid 37 grader Celsius tills det används. Använd en flerkanalig pipett för att tvätta cellerna och de tomma tomma Brunnarna två gånger, med förvärmd kalcium- och magnesiumfri PBS-lösning. Kassera PBS och tillsätt 180 mikroliter av det förvärmda analysmediet för cellpermeabilisering.Omedelbart efter permeabilisering ersätt verktygsplattan på den kalibrerade sensorpatronen med cellplattan som innehåller permeabiliserade celler och starta mätningen. Behandlingsgruppen hade en högre frekvens av succinate inducerad andning. Svaret från A549-celler på Metforminbehandling var högre än Hep G2. För pyruvat malate inducerad andning visade A549 celler ökad induktion jämfört med Hep G2 celler mellan fem och 15 minuter.Liknande resultat erhölls för glutamat malate inducerad andning och palmitoylcarnitine malate inducerad andning. För att uppnå rätt koncentration av substrat och hämmare. Rätt volym måste lastas in i rätt port.När en förändring i en metabolisk väg för ett visst substrat identifieras kommer det att vara nödvändigt att bedöma funktionen hos de enzymer och transportörer som är involverade i den vägen.

Research

JoVE Journal

Biology

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

En metod för produktion av rekombinanta mCD1d Protein i insektsceller.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Sökning efter Mitokondriell komplex aktivitet på mänskliga embryonala stamcellslinjer

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Mätning Glutation-inducerad Foder Response i Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

Högupplöst respiration att bedöma mitokondrie funktion i Permeabilized och intakta celler

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Samtidig mätning av mitokondrie kalcium och mitokondriell membranpotential i levande celler genom fluorescensmikroskopi

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Bedömning av autophagic Flux genom mätning av LC3-, p62- och LAMP1-co-lokalisering med användning av multispektral bildflödescytometri

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

En grafisk användargränssnitt för programvaruassisterad spårning av proteinkoncentration i dynamiska cellulära protrusioner

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Transient expression och cellulär lokalisering av rekombinanta proteiner i odlade insektsceller

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Mätning av energimetabolism i explanterad retinala vävnaden med hjälp av extracellulära Flux analys

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...