Name: tissue preparation techniques for contrast-enhanced micro computed tomography imaging of large mammalian cardiac models with chronic disease
Uploaded: 2022-02-08T14:00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Preparation Techniques for Contrast-Enhanced Micro Computed Tomography Imaging of Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease at JoVE.com

Denne undersøgelse modtog finansiel støtte fra den franske regering som en del af programmet "Investments of the Future", der forvaltes af National Research Agency (ANR), Grant reference ANR-10-IAHU-04 og Leducq Foundation (RHYTHM-netværket) samt Grant reference ANR-17-CE14-0029-01 [UNMASC], finansiering fra det europæiske forskningsrum i hjerte-kar-sygdomme (ERA-CVD), tilskudsreference H2020-HCO-2015_680969 [MultiFib] og finansiering fra den franske region Nouvelle Aquitaine, tilskudsreferencer 2016 - 1R 30113 0000 7550/2016-1R 30113 0000 7553 og ANR-19-ECVD-0006-01.

Alle forsøg blev udført i efter retningslinjerne i Europa-Parlamentets direktiv 2010/63/EU om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål. Dyreprotokoller blev godkendt af den lokale etiske komité (CEEA50) ved universitetet i Bordeaux. Hjerter blev hentet fra tre store pattedyrsmodeller, herunder (i) Sunde store hvide grise (N = 2, 2 måneder gamle); (ii) Får (N = 1, 2 år) med induceret myokardieinfarkt13 og (iii) Får (N = 1, 7 år) med induceret atrieflimren30.
1. Forberedelse af opløsning:
<ol><li>Kardioplegisk opløsning: Forbered 3 liter destilleret vand og tilsæt natriumchlorid (110 mM), kaliumchlorid (16 mM), Natriumbicarbonat (10 mM), D-(+)-Glucose (9 mM), calciumchloridopløsning (1,2 mM) og magnesiumchloridopløsning (16 mM). Til sidst tilsættes 500 μL/l heparinnatrium. Bevar denne opløsning ved 4 °C.</li>
	<li>Fosfatbufret saltvand - EDTA-opløsning (PBS-EDTA).<ol>
<li>Først tilsættes ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) til 1 liter destilleret vand til en endelig koncentration på 10 mM. Forøg og oprethold en opløsning pH på 12 ved anvendelse af natriumhydroxidopløsning (1 M) til opløsning af EDTA.</li>
		<li>Når EDTA er fuldt opløst, sænkes pH til 7,4 ved hjælp af saltsyre. Tilsæt en foliepose med fosfatbufret saltvand for at opnå en opløsning ved 0,01 M (natriumchlorid, 0,138 M; kaliumchlorid, 0,0027 M) og pH 7,4. Bevar denne opløsning ved stuetemperatur (RT).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ethanol - phosphomlybdinsyre (PMA) kontrastmiddelopløsning: Forbered 1 liter absolut ethanol og tilsæt PMA for at opnå en opløsning ved 1% af koncentrationen. Bevar denne løsning hos RT.</li>
</ol>2. Vævskilde
<ol><li>Afliv dyret og ekstrakt hjertet i henhold til lokale etiske retningslinjer. Sænk hurtigt hjertet i kold kardioplegisk opløsning og massér forsigtigt ventriklerne til indledende skylning.</li>
	<li>Sørg for at skære aorta under aortabuen og klemme to sider af arterievæggen ved hjælp af nåleholdere.</li>
	<li>Suspender hjertet af nåleholderne, indsæt en aortikanula i aortaroten, pas på ikke at komme i kontakt med eller stikke ud gennem aortaklapperne. Pak en 0 gauge sutur rundt om aortabuen på kanylens niveau og bind kanylen fast på plads.</li>
	<li>Brug 50 ml sprøjter til at injicere 200 ml kold (4 °C) kardioplegisk opløsning. Fjern overskydende blod, der samler sig i hulrummene ved at vippe hjertet på dets bageste side for at dræne via lungevenerne.</li>
	<li>Sænk det skyllede hjerte og opbevar det i kold kardioplegisk opløsning opbevaret på is, indtil det er klar til dissektion.</li>
</ol>3. Vævsforberedelse:
<ol><li>Forbered et 1 L reservoir understøttet 80 cm over en dissektionsskål. Par et termoplastisk rør 80 cm i længden og 3,2 mm indvendig diameter og 4,8 mm udvendig diameter til en afløbsport i reservoiret.</li>
	<li>Fastgør en trevejshane til drænrøret, og koble yderligere termoplastrør (20 cm, 1,6 mm indvendig diameter og 3,2 mm udvendig diameter) til hver fri port på trevejshanen. Fastgør tovejshaner til gebyrenderne af slangen.</li>
	<li>Fyld reservoiret med den kardioplegiske opløsning suppleret med heparin (2500 enheder). Åbn vandhanerne for at lade den kardioplegiske opløsning dræne og fjerne alle luftbobler, og luk derefter tovejshanerne.</li>
	<li>Forbered kanyler til venstre og højre koronar ostia ved hjælp af Polytetrafluorethylen (PTFE) slange (1 mm indvendig diameter og 2 mm ydre diameter).<ol>
<li>Skær 5 cm slange og opvarm den ene ende ved at placere spidsen ved siden af en åben ild. Når 1 mm af spidsen begynder at smelte og bliver gennemskinnelig, skal du trykke spidsen mod en hård varmebestandig overflade for at forme en højderyg ved kanylespidsen for at forhindre, at kanyler glider ud af karrene.</li>
		<li>Indsæt 1 cm af den ikke-opvarmede ende af hver kanyle i de to ender af afløbsbeholderens drænrør.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fjern aorta kanylen. Under kold kardioplegisk opløsning lokaliseres venstre og højre ostia af koronararterier.</li>
	<li>Brug spids saks til forsigtigt at adskille aortaroten fra det omgivende væv over og under koronar ostia for at muliggøre gevindskæring af en 0 G silkesutur under koronarbeholderen.</li>
	<li>Åbn tovejshanerne, og indsæt kanylespidserne i koronar ostia. Med kanylespidserne, der strækker sig 1-2 cm ind i ostia og ud over suturplaceringen, skal du binde kanyler af.</li>
	<li>Skyl hjertet, mens du forsigtigt masserer ventriklerne i 15 minutter, indtil hjertet er ryddet af blod.</li>
	<li>Efter skylning skal du lukke tovejshanerne og frakoble dem fra trevejshanen. Overfør hjertet til en 1 L kemisk resistent plastbeholder indeholdende 500 ml PBS-EDTA-opløsning.</li>
	<li>Recikuler PBS-EDTA-opløsningen i den termoplastiske slange under en stinkhætte ved hjælp af en peristaltisk pumpe med to kanaler. Prim pumpeslangen, indtil slangen er fraværende af luftbobler, og perfuser derefter hver koronararterie kanyle ved recirkulation ved RT i 2 timer ved 80 ml / min.</li>
	<li>Sørg for, at stinkhætten er i drift. Stop pumpen, tøm opløsningen fra beholderen, og udskift den med formalin (10%) til fiksering i 1 time ved RT ved 80 ml/min.</li>
	<li>Udskift formalinopløsningen med PBS for at skylle fikseringsmidlet tre gange i 15 minutter hver ved 80 ml/min.</li>
</ol>4. Vævsdehydrering og tørring:
BEMÆRK: Brug den samme perfusionshastighed (80 ml/min) og lad vævet forblive på RT hele vejen igennem.
<ol><li>Udskift PBS-opløsningen med ethanol ved 20%, fortyndet i ultrarent vand, og perfus i mindst 3 timer.</li>
	<li>Perfuse hjertet ved hjælp af en række stigende ethanolkoncentrationer.<ol>
<li>Start med at erstatte 20% ethanolopløsningen med ethanol fortyndet til 30% og perfus i 2 timer.</li>
		<li>Gentag perfusion ved at øge ethanolkoncentrationen ved hver iteration gennem 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 95%, 90%, 95%, 99% og 100% i en minimumsvarighed på 1 time ved hvert trin (koncentration). BEMÆRK: Hjerteprøver kan hvile uden perfusionsstrøm natten over ved enhver ethanolfortynding, hvis der har fundet en minimumsperfusion på 15 minutter sted for den pågældende koncentration.</li>
	</ol>
</li>
	<li>VALGFRIT: Hvis du anvender kontrastmidler via perfusion, skal du perfuse hjertet med 100% ethanol suppleret med kontrastmidlet PMA, 1% i 48 timer. Skyl kontrastmidlet ved perfusion med 100% ethanol i 2 timer.</li>
	<li>For at forstærke hjertevævet inden lufttørring skal du recikulere en 50:50 blanding af ethanol og hexamethyldisilazan (HMDS) i 10 minutter. Følg dette med 100% HMDS i yderligere 2 timer. FORSIGTIG: HMDS er et meget giftigt og skadeligt stof. En stærk lugt af ammoniak frigives i kontakt med luft. Desuden er den flydende form af HMDS meget flygtig og katalyseret af jodholdige midler.</li>
	<li>Frakobl kanylerne fra slangen og suspender hjertet fra en aortasur inde i stinkhætten.</li>
	<li>Skub forsigtigt en lynlåspose over hjertet, og luk poseforseglingen over suturen for at reducere hjertets eksponering for cirkulerende luft. Lad hjertet tørre gennem fordampning i 1 uge.</li>
	<li>VALGFRIT: For diffusionsbelastende kontrastmidler skal du vaske hjertet i 100% ethanol i 15 minutter, mens du omrører. Sænk hjertet i 100% ethanol suppleret med PMA, 1%, i 48 timer under vakuum. Gentag trin 4.6.</li>
</ol>5. Mikrokt:
BEMÆRK: Et stationært røntgenmikrokt-system blev brugt til billeddannelse af svinehjerter.
<ol><li>Monter det lufttørrede hjerte på en passende prøveholder. Undgå enhver bevægelse under røntgenmikroCT-målingerne ved hjælp af en klemme, der er forankret til prøveholderen, og fastgør hjertet via den tørrede og stive aorta.</li>
	<li>Juster omhyggeligt midten af hjerteprøven langs dens længdeakse med midten af billeddannelsesfeltet for 0 ° og 90 ° rotationsvinkler. For at opnå dette i alle retninger skal du suspendere hjertet i luften via en aortikalemme fastgjort til prøvestøtten.</li>
	<li>Når du har åbnet softwaren og startet røntgenmikrokt-systemet, skal du anvende røntgenfilteret aluminium, 1 mm, røntgenkildespænding til 60 kV og strøm til 120 μA. Indstil billeddimensioner til 2016 x 1344 pixels og pixelstørrelse til 20 μm.</li>
	<li>Træk prøveholderen ud af synsfeltet, og kalibrer baggrundsbilledet og røntgeneksponeringstiden ved at opnå en fladfeltkorrektion. Sørg for, at den gennemsnitlige baggrunds røntgentransmission er større end 80%.</li>
	<li>Scout røntgentransmissionsbilleder langs længden af støtten for at bestemme det samlede billeddannelsesfelt i hjertets længdeakse. Til scanning skal du bruge et rotationstrin på 0,18°, et rammegennemsnit på 5 og en prøverotation på 180°. Vælg forskydningsscanningstilstanden for at afbilde den fulde bredde af eksempelunderstøttelsen. BEMÆRK: De anskaffelsesparametre, der er angivet i dette afsnit, er valgt for at optimere billedkvaliteten af ensemblets hjertekomposition.</li>
	<li>Efter scanning skal du bruge softwaren til tomografisk rekonstruktion af et isotropt tredimensionelt billedvolumen. Til anvendelse af NRecon-software skal du bruge erhvervelsesrelateret artefaktkorrektion, herunder strålehærdende effekter på 10% og reduktion af ringartefakt på 8.</li>
	<li>For at optimere datalagringsbegrænsninger skal du anvende det mindste rektangulære område af interesse, der omfatter hjertespecifikke billedvoxeller. Eksporter billederne i et 8-bit bitmapformat som en billedstak.</li>
	<li>Visualiser den rekonstruerede datastak ved hjælp af DataViewer-softwaren. Orienter prøven digitalt inden for billedgrænserne for at justere prøvens lange og korte akser med de tre hovedakser i billedvolumenet.</li>
	<li>Beskær billedvolumen i alle tre akser for at fjerne billedets ydre baggrundslag for maksimalt at reducere den samlede billedstørrelse.</li>
</ol>

En detaljeret protokol for store vævspræparater er fastsat ved hjælp af hele hjerter fra store pattedyr til efterfølgende strukturel billeddannelse i høj opløsning. En lufttørringsmetode fjernede påvirkninger af baggrundsrøntgendæmpning og maksimalt optimerende væv: baggrundskontrast29. Ved hjælp af denne fremgangsmåde blev der opnået en isotrop opløsning i området 20 μm til volumetrisk billeddannelse på tværs af prøver op til 7,2 cm i diameter. MikroCT af blødt væv er imidlertid typisk afhængig af anvendelse af ikke-specifikke kontrastmidler til at forbedre røntgenabsorptionen og følsomheden af mikrokt-systemer34. Selvom røntgenkontrastmidler forbedrer den samlede røntgendæmpning og forbedring af blødt vævsbilleddannelse, er adskillelse af vævsbestanddele baseret på biokemisk sammensætning fortsat udfordrende. Det blev imidlertid observeret, at ved hjælp af lufttørrede hjerter i kombination med et almindeligt røntgenkontrastmiddel i laboratorieindstillingen, PMA, selektivt farvede ekstracellulære komponenter. Bindevæv forbundet med sundt myokardie og patologisk strukturel ombygning i kroniske sygdomme blev forbedret.
Processen med lufttørring af biologisk væv kræver en intervention for at modstå deformationen af prøven. Prøveforberedelse til elektronmikroskopi har lignende krav. Typisk anvendes en kritisk punkttørringsmetode, der bruger en balance mellem vævsnedsænkningsmedium, temperatur og tryk for at eliminere overfladespænding af vævets væskeindhold, hvilket forårsager deformation på molekylært niveau ved fordampning35. Denne fremgangsmåde kræver ensartet udskiftning af prøvens vandindhold med flydende kuldioxid, som er mere pålidelig i små og let diffusible prøver. Alternativt kan vævets strukturelle integritet forbedres, og lufttørring, dvs. fordampningsfasen, kan påføres over en længere periode for at reducere den samlede deformation. Molekylet HMDS gennemgår silylering for at danne et silikonebaseret stillads for at forstærke og stabilisere den molekylære organisation af vævsprøven36. Fordampningen forlænges yderligere ved at begrænse cirkulerende luftstrømme fra miljøet, også for at undgå inhomogen fordampning, især mellem prøveoverfladen og de intramurale lag.
Talrige kontrastmidler er tidligere blevet brugt til microCT-billeddannelse af blødt væv. De mest almindelige er jod, phosphotungstic acid (PTA) og PMA. Jod har især været anvendt på grund af en højere diffusionshastighed 34,37,38. Ikke desto mindre virker jod som katalysator for silylering af HMDS-reagens36. Den katalyserede reaktion er aggressiv og eksoterm med stor risiko for destruktion af prøven og sikkerhedsrisiko, hvis resterende HMDS forbliver på grund af ufuldstændig udtørring af prøven. Både PTA og PMA opløst i ethanol kan sikkert anvendes sammen med HMDS. PTA og PMA har vist sig at give større opløsningsevne af fine strukturer i ikke-mineraliserede intervertebrale skiver sammenlignet med jodfarvning38. I mikroCT-billeddannelse af pattedyrsprøver er PTA og PMA blevet anvendt til farvning af museembryoner39, muse-kardiovaskulært system37, kaninmuskel og hjerne40 og svineårer41. PTA har en højere molekylmasse og densitet i opløsning end PMA. Dette skyldes til dels en højere atommasse af wolfram (atomnummer er 74 g / mol), det vigtigste dæmpende element i PTA. Til sammenligning har det tungeste grundstof i PMA, molybdæn, et atomnummer på 42 g/mol. Både atommasse og prøvetæthed ligger til grund for røntgendæmpning ud over prøvetykkelsen42. Ved at øge røntgenstiens længde ved at øge prøvestørrelserne bliver røntgendæmpning mere følsom over for øget prøvetæthed. Derfor blev PMA-kontrastmidlet med lavere densitet valgt for at reducere risikoen for overdæmpning og for at optimere det dynamiske område af billedkontrast for hjerter af menneskelignende skala. Yderligere beviser har vist, at diffusionsbelastning af PMA giver mere homogen farvning end for det større molekyle PTA i hjertevæv43.
Metoden til levering af kontrastmiddel påvirker ensartetheden af kontrastmiddelfordelingen i hjertevæv (figur 3). Perfusion af kontrastmidler i det ethanol-dehydrerede hjerte viste ujævne baggrundsfarvningsniveauer af PMA på grund af variabel vaskulær resistens. I det lufttørrede hjerte understreges muskellaminær struktur af prøveudtørringsprocessen, hvilket øger muskellaminær adskillelse. Dette forbedrede i sidste ende vævets samlede permeabilitet til diffusionsbaseret kontrastmiddelbelastning. Følgelig lettede lufttørring væv: luftkontrast på det laminære og intralaminære niveau (figur 4). Desuden kan diffusionsbelastning lettes yderligere ved påføring under vakuum. Det er endvidere blevet påvist, at vævskrympning af ikke-tørrede prøver er afhængig af koncentration af kontrastmiddel40. Tidligere morfologisk stabilisering af prøven ved lufttørring hæmmer imidlertid vævskrympningseffekter29.
Mikrokt-billeder i høj opløsning af hele organer producerer i sagens natur store datamængder. Karakteren af tomografiske billeddannelsesteknikker muliggør visualisering og billedhåndtering på skive-for-skive-basis, hvilket letter computerens behandling og hukommelsesbyrde. For at visualisere tredimensionelle billedstakke, for eksempel for at gengive prøvevolumener i tredimensionelle repræsentationer, er de anbefalede minimumscomputerspecifikationer imidlertid 128 GB RAM og en processorhastighed på 3 GHz. Solid state-harddiske forbedrede også dataoverførslen betydeligt.
Fremkomsten af mikrokt-billeddannelse på hjerteområdet giver mange fordele for translationelle undersøgelser og klinisk validering. Fordelene ved dens tredimensionelle og mikrometriske billeddannelse har allerede vist anvendelser til bestemmelse af den trombotiske byrde hos ST-elevation myokardieiskæmipatienter44,45. Kortlægning af potentielle kilder til arytmi hos patienter med strukturelle hjertesygdomme er i høj grad afhængig af at bestemme fordelingen af fibrotisk arvæv og lokalisere sammenvævningsspor af overlevende myokardie. Andenlinjetilgange til diagnosticering af ventrikulære arytmier anvender magnetisk resonansbilleddannelse46. Det kan robust lokalisere tæt fibrose, men er begrænset til morfologisk karakterisering med lav opløsning og giver begrænset indsigt i mikrostrukturel ombygning og diffuse fordelinger af fibrotiske læsioner47. Højopløselig undersøgelse af arfordeling og karakterisering har et stort potentiale for at forbedre vores forståelse af hjertestrukturel ombygning og risikoen for at udvikle hjertesvigt. Især vil grundforskningsundersøgelser eller post mortem-undersøgelser drage fordel af bekræftende strukturelle billeder til elektrisk kortlægning af hjertearytmi.
Afslutningsvis kan hjerter forstærket med HMDS-behandling og lufttørring efterfølgende farves med et røntgenkontrastmiddel for at forbedre røntgendæmpningen af ekstracellulære komponenter. Specifikt forekommer PMA-akkumulering i sundt myokardie ved epitelet, valvulært væv og rum i det ventrikulære ledningssystem beklædt med bindevæv resulterede i forbedret røntgendæmpning. Desuden var forbedret kontrast i strukturelt sygt myokardie yderligere selektiv for fibrose.

Strukturelle hjertesygdomme tegner sig for størstedelen af hjerterelateret dødelighed på verdensplan1. Ombygning af hjertestruktur påvirker myokardiemiljøet og det interstitielle rum. Da både hjerteelektisk og mekanisk funktion afhænger af myocytorganisationen, kan forstyrrelse føre til uacceptabel hjertearytmi, nedsat blodpumpende handlinger og hjertesvigt 2,3,4,5,6,7,8,9. Udviklingen af helbredende terapier til strukturelle hjertesygdomme opvejes langt af sygdomsprævalensen 2,5. Som sådan dukker et stigende antal prækliniske modeller af strukturelle hjertesygdomme op for bedre at forstå de anatommorfologiske profiler og den resulterende patogenese af hjertearytmier 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23. Observeret på tværs af struktursygdomsspektret er opreguleringen af interstitiel fibrose og, mere almindeligt i iskæmi-relaterede tilfælde, myokardieudskiftning med fibrose og fedtvæv18. Morfologisk forståelse af patologiske ekstracellulære komponenter kan muliggøre identifikation af potentielle substrater af arytmi. Fordelingen og omfanget af sygdommen giver stærke indikatorer for arytmogen risiko. Alligevel er der stadig udfordringer med at afbilde sygdomsprofiler ved at integrere makro- og mikroskalaer i det intakte hjerte.
Mikrocomputertomografi (microCT), baseret på røntgenstråler, fremstår som et kraftfuldt værktøj til at forhøre blødt biologisk vævsmikrostruktur ved hjælp af kontrastmidler. Der er opnået meget detaljerede anatomiske kort for hjerter fra små gnavere 24,25,26 og små dissekerede prøver fra store pattedyrshjerter 27,28. Billeddannelse på hele organniveauet af store pattedyrshjerter præsenterer imidlertid for store stilængder, over hvilke røntgenfotoner dæmpes ved hjælp af konventionelle vævsforberedelsesteknikker. Dette indebærer kontrastbelastning af vævet og nedsænkning af prøven i et kontrastmiddelopløsningsmiddel under erhvervelsen. Forøgelse af stikprøvestørrelsen og opløsningen pålægger en forlængelse af den samlede anskaffelsestid. Derfor bliver vævsstabilitet afgørende for brugbar billedrekonstruktion, hvilket betyder, at vævsdeformation som følge af tørring skal forhindres. Anvendelsen af en nedsænkningsvæske har imidlertid ulemper: (i) den samlede baggrundssignalintensitet bliver ikke ubetydelig og (ii) fremmer fortynding af vævsbundne kontrastmolekyler. Begge disse faktorer bidrager til at sænke billedkontrasten.
Denne undersøgelse beskriver en ny vævsbehandlingsrørledning for at lindre baggrundsfotondæmpning og optimere det dynamiske område, der ydes af kontrastforbedringsmidler. Det foreslås at anvende en vævslufttørringsmetode med kemisk vævsforstærkning for at begrænse vævsdeformation29. Derfor kan vævsprøver forblive stabile i luften ved lange erhvervelser og udelade baggrundsbidrag fra nedsænkningsvæsker. Denne metodepipeline giver: (i) en omfattende vævsbehandlings- og billeddannelsesprotokol optimeret ved hjælp af hele svinehjerter; ii) en evaluering af kontrastkoncentrations- og belastningsteknikker og iii) anvendelse af denne pipeline i to forskellige kroniske sygdomsmodeller for atrieflimren og myokardieinfarkt i fårehjerter. Udvikling af kroniske sygdomsmodeller er beskrevet andetsteds for hver kronisk hjertesygdomsmodel, myokardieinfarkt induceret af perkutan koronararterieembolisering13 og selvbærende atrieflimren30.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin</td>
			<td>Diapath</td>
			<td>F0043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>21114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Canulation Tubing PTFE</td>
			<td>VWR</td>
			<td>DENE3400102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Head 1L Reservoir</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>50-0496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>796881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium (5000 U/mL)</td>
			<td>Panpharma</td>
			<td>3400891287301.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440191-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, ACS reagent, 37%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>63020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphomolybdic acid hydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>417895000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Tubing, 3-Stop</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>FV-96328-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SkyScan, 1276</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>micro CT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution 50% in H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>415413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Connector Kits</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-1407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM 1089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Tygon R-3603 1.6 mm 3.2 mm 0.8 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>228-1279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Tygon R-3603 3.2 mm 4.8 mm 0.8 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>228-1283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-part single-use syringes 50 mL</td>
			<td>Norm-Ject</td>
			<td>4850001000</td>
			<td>Pyrogen-free, PVC-free</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue preparation techniques for contrast-enhanced micro computed tomography imaging of large mammalian cardiac models with chronic disease

Strukturel ombygning er en almindelig konsekvens af kroniske patologiske belastninger pålagt hjertet. Forståelse af de arkitektoniske og kompositoriske egenskaber af sygt væv er afgørende for at bestemme deres interaktioner med arytmisk adfærd. Mikroskala vævsombygning, under den kliniske opløsning, fremstår som en vigtig kilde til dødelig arytmi, med høj forekomst hos unge voksne. Der er fortsat udfordringer med at opnå høj billedkontrast ved tilstrækkelig mikroskalaopløsning til prækliniske modeller, såsom store pattedyrs hele hjerter. Desuden mangler vævssammensætningsselektiv kontrastforbedring til tredimensionel billeddannelse i høj opløsning stadig. Ikke-destruktiv billeddannelse ved hjælp af mikrocomputertomografi viser løfte om billeddannelse i høj opløsning. Målet var at lindre lidelse fra røntgen over fordæmpning i store biologiske prøver. Hjerter blev ekstraheret fra raske grise (N = 2) og får (N = 2) med enten induceret kronisk myokardieinfarkt og fibrotisk ardannelse eller induceret kronisk atrieflimren. Udskårne hjerter blev perfunderet med: en saltopløsning suppleret med et calciumion-slukningsmiddel og en vasodilator, ethanol i seriel dehydrering og hexamethyldisilizan under vakuum. Sidstnævnte forstærkede hjertestrukturen under lufttørring i 1 uge. Kollagen-dominerende væv var selektivt bundet af et røntgenkontrastforstærkende middel, phosphomolybdinsyre. Vævskonformationen var stabil i luften, hvilket tillod langvarige mikrocomputertomografiopkøb for at opnå billeder i høj opløsning (isotrope 20,7 μm). Optimal kontrastmiddelbelastning ved diffusion viste selektiv kontrastforbedring af epitellaget og sub-endokardielle Purkinje-fibre i sunde svineventrikler. Atrieflimren (AF) hjerter viste forbedret kontrastakkumulering i de bageste vægge og vedhæng af atrierne, der tilskrives større kollagenindhold. Myokardieinfarkthjerter viste øget kontrast selektivt i områder af hjertefibrose, hvilket gjorde det muligt at identificere sammenvævede overlevende myokardiemuskelfibre. Kontrastforstærkede lufttørrede vævspræparater muliggjorde mikroskala billeddannelse af det intakte store pattedyrshjerte og selektiv kontrastforbedring af underliggende sygdomsbestanddele.

Fremstillingen af store pattedyrhjerter ved hjælp af dehydrerings- og lufttørringsmetoden fjerner alt vandindhold fra prøven. Der kan påvises utilstrækkelig vandudskiftning med ethanol under HMDS-belastning (se protokol, trin 4.4). Tilstedeværelsen af vand under HMDS vil skabe bobler, der stiger op fra vævet. I tilfælde af for høje vandniveauer kan der forekomme en stigning i temperaturen på nedsænkningsvæsken. At holde nedsænkningskammeret omgivet af is under den første HMDS-belastning kan reducere de dårlige virkninger af vævsopvarmning. Efter lufttørring af hjerter i fravær af kontrastmidler vises prøven hvid i farven (se protokol, trin 4.6). Den ydre overflade blev ofte tørret og strukturelt stabil før intramurale lag. Skylning i ethanol før påfyldning af kontrastmiddel fjernede den hvide aflejring (se protokol, trin 4.7). Udskæring gennem væv ved hjælp af et skarpt blad afslører makroskopisk individuelle muskelfibre med klar adskillelse. Kontrastbelastning ved nedsænkning af hjerteprøver i kontrastmiddelmedium led af diffusionsgrænseartefakter i tykke og meget muskuløse områder af prøven. Diffusionskontrastbelastning under vakuum gav mere homogen farve i muskler (hjerteprøve nr. 1, se tabel 1 for kontrastmiddelbelastningstider). Makroskopisk viste overfladekontrastmiddelfordelingen in-homogen farvning mellem hjertemusklen og regioner, der primært bestod af ekstracellulære komponenter, især fedt og bindevæv. Lufttørrede vævsprøver, enten før eller efter påfyldning af kontrastmiddel, opretholdt stabil strukturel integritet.
Den tid, der var nødvendig for at scanne prøvens fulde bredde ved 20 μm opløsning under microCT ved hjælp af ovennævnte scanningsparametre og en eksponeringstid på 1700 ms, var 6 timer og 34 minutter. Afhængigt af prøvens størrelse i scannerens portalakse blev denne varighed ganget med antallet af positioner, der var nødvendige for at fange prøvens fulde længde. For svine- og fårehjerter i denne undersøgelse blev der brugt tre til fire positioner. NRecon-softwaren flisebelagte multipositions- og offset-scanningerne for at danne et enkelt røntgenprojektionsbillede for hvert rotationstrin i røntgenkilden og detektoren. I alt gemmes 1000 fremskrivninger som 16-bit billeder, der genererer 30-40 GB data. Rekonstruerede volumetriske billeder var 52-70 GB.
Større anatomiske landemærker, herunder ventrikulære hulrum, septum og frie vægge i ventriklerne, kunne let identificeres fra røntgentransmissionsbilleddannelse af lufttørrede svinehjerter farvet med kontrastmiddel ved diffusionsbelastning (figur 1A). Desuden blev der også observeret stærkt teksturerede områder, der indikerer mikrostrukturel organisation, såsom myokardiefiberorientering, på grund af følsom røntgendæmpning / transmission (figur 1B). Tomografiske rekonstruktioner af tredimensionelle billedvolumener viste tydelig adskillelse mellem væv og baggrund ved både epikardielle og endotelgrænser (figur 1D). Intramuralt blev der observeret lav kontrast og voxelintensitet diffusionsgradient gennem tykke transmurale områder af vævet. På trods af det var vaskulatur og myokardiefibre adskilt af spaltningsplaner stadig let identificerbare. En anden højere intensitet båndbredde af kontrast blev observeret ved det epikardie-mest lag og i punkterede sub-endokardielle regioner. Kontrastforbedring var størst på steder, hvor ekstracellulære komponenter blev akkumuleret, især epikardialt bindevæv, epikardialt fedt og bindevævskeden i Purkinje-fibernetværket. Voxel-signalintensitetsfordelinger viste høj adskillelse fra nulintensitetsbaggrunden (luft) og to dominerende populationer af væv med lav og høj kontrast (figur 1D).
For at validere kontrastforbedring af mikroCT-billedrekonstruktioner og selektiviteten til kollagenøse rum i hjerteprøverne blev histologi, lysfeltmikroskopi og fluorescerende mikroskopi anvendt (figur 2). En transmural blok af ventrikulært væv fra et lufttørret hjerte uden forudgående kontrastmiddelbelastning blev forberedt til paraffinindlejring og sektionering. Tilstødende vævsskiver monteret på mikroskopdias blev behandlet ved enten Massons trikromfarvning, ingen behandling eller 48 timers PMA (1%). Nedsænkning af diasmonterede vævssektioner eliminerede diffusionsgradienteffekter af farvningsprocessen, der blev observeret i hele hjerteprøver. Masons trikromfarvning viste kollagen-positiv farvning ved epitel- og endotellagene, perivaskulært i det subepikardievæv og en bindevævskede, der omgiver en fritløbende Purkinje-fiber, der stikker ud i venstre ventrikulære hulrum (figur 2A). Lys feltbelysning viste mørkere farve i kollagenøse strukturer efter PMA-farvning, hvilket understøtter den foretrukne akkumulering af PMA (figur 2B,C). Desuden har PMA-behandling tidligere vist sig at slukke autofluorescensen af kollagenmakromolekylære komplekser31. Fluorescerende billeder af ventrikulære vævssektioner havde PMA-induceret tab af fluorescens på kollagensteder (figur 2D vs. 2E, figur 2D ' vs. 2E 'og figur 2D '' vs. 2E ''). I både lysfelt og fluorescerende billeddannelse blev cellulære rum ikke ændret ved PMA-behandlingen, og kollagen havde en selektiv ophobning af PMA-farvning og slukning af autofluorescens.
Hjerteprøve nr. 2 blev farvet med et kontrastmiddel via perfusion inden lufttørring. Billedrekonstruktion afslørede meget ujævn farvning i myokardierummet (figur 3A). Kontrastforbedring syntes uselektiv af vævssammensætning, uden yderligere forbedring af signalintensiteten i de epikardielle eller sub-endokardielle regioner. Desuden viste væv med lav kontrast dårlig adskillelse fra baggrundsintensiteten (figur 3B).
Ventrikulær fibrose blev induceret af myokardieinfarkt og kronisk iskæmi (hjerteprøve nr. 3). Et antero-apikalt ar blev dannet ved at erstatte myocytter med fibro-fede aflejringer i vævet nedstrøms til stedet for vaskulær embolisering. Hjerteprøve nr. 3 blev fremstillet og afbildet fra en dissekeret ventrikulær kile, der dækker den forreste venstre ventrikel, septum og højre ventrikulære frie væg. Forberedelsen af denne ventrikulære kilekonfiguration er tidligere beskrevet32, og anvendelsen af kiler til hjertebilleddannelse blev gennemgået i detaljer33. Armorfologi var transmural, men heterogen (figur 4). En central tæt fibrotisk læsion var omgivet af en løs og heterogen grænsezone (figur 4A). Det ventrikulære præparat blev farvet ved diffusionsbelastning efter lufttørring og i et vakuum. Figur 4B-E viser de største signalintensiteter af rekonstruerede mikroCT-billedvolumener ved vævsgrænserne og arområderne. Kontrastmidler dårligt farvede sundt myokardie, men alligevel blev mikrostrukturel kontrast bevaret (figur 4C'). Ved grænseområdet blev arvæv blandet med overlevende myokardie (figur 4D'). Tæt fibrose forekom transmural, men struktureret, hvilket indikerer variationer i sammensætningen (figur 4E'). Vævssektioner af en transmural venstre ventrikulær region af det lufttørrede og PMA-farvede vævspræparat blev anvendt til at validere PMA-selektivitet for kollagen i patologisk væv ved at sammenligne med Massons trikromfarvning (figur 4F). PMA-farvning var selektiv for kollagen (sub-epikardium og subendokardi) og fraværende i områder med overlevende myokardi (figur 4G).
Hjerteprøve nr. 4 med induceret vedvarende atrieflimren blev lufttørret, samtidig med at den oprindelige form af atriehulen bevares. Atrielt appendage sammenbrud blev ikke observeret. De vigtigste anatomiske landemærker kunne identificeres morfologisk ud fra rekonstruerede billeder (atriel septum, pektinatmuskler, koronar sinus, lungevene ostia, vena cava og cristae terminalis). Diffusionsfarvning under vakuum resulterede i kontrastforbedring i aortaroden og atrioventrikulære ventiler og diskrete områder af arbejdsmordikardiet. Muskelfarvningsforbedring var begrænset til de atriale vedhæng og bageste vægge i både venstre og højre atrier (figur 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62909/62909fig01.jpg"> Figur 1: MicroCT-billeddannelse af et lufttørret svinehjerte behandlet med PMA-kontrastmiddel ved diffusion under vakuum. (A) Røntgenprojektionsbillede. B) En transmissionsprofil udtrukket fra den røde linje i A. C) Kortakset skive af ventriklerne fra et tomografisk rekonstrueret tredimensionelt volumen. Gule pile angiver punkterede kontrastområder, der tilskrives sub-endokardielle Purkinje-fibre. Blå pile angiver vaskulatur. D) Signalintensitetsfordeling af det rekonstruerede billedudsnit vist i C. LV: venstre ventrikel og RV: højre ventrikel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62909/62909fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62909/62909fig02.jpg"> Figur 2: Validering af PMA-selektivitet for kollagen. (A) Massons trikromfarvning af en transmural vævssektion fra ventriklerne i et lufttørret hjerte. Myokardiet er farvet i rødt, og kollagen er vist med grøn farve. Tilstødende vævssektioner (B) uden farvning eller (C) farvet med PMA (1%) blev afbildet med lys feltbelysning for at vurdere ensartetheden af farvningen. (D) Vævssektioner uden farvning eller (E) farvet af PMA blev afbildet ved fluorescerende mikroskopi. Panelerne D' (solid rød boks) og E' (stiplet rød boks) er forstørrede visninger af sub-epikardiet for ufarvede og PMA-farvede sektioner. Panelerne D'' (solid blå boks) og E'' (stiplet blå boks) er tilsvarende forstørrede visninger af subendokardiet og en fritløbende Purkinje-fiber. Pile angiver steder med kollagenindhold. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62909/62909fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62909/62909fig03.jpg"> Figur 3: Perfusionsbelastning af PMA før lufttørring og MicroCT-billeddannelse. (A) Et kortakset udsnit af et rekonstrueret billedvolumen af ventriklerne fra et svinehjerte. Blå pile angiver vaskulatur. (B) Signalintensitetsfordelingen af billedudsnittet fra panel A. LV: venstre ventrikel og RV: højre ventrikel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62909/62909fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62909/62909fig04.jpg"> Figur 4: MicroCT-billeddannelse af et fårehjerte, der lider af et kronisk myokardieinfarkt. (A) Der blev dannet et tæt ar i det apikale område (se inset-fotografi). En volumengengivelse af det apikale område fra et endokardieperspektiv blev tildelt farve baseret på billedintensitet (rød svarende til arvæv og myokardie i grønt). Ortogonale skiver af gråtoneintensiteten viser den tætte arfordeling og grænsende til overlevende myokardie. Adskillelse mellem fibrotisk væv og myokardi svarer til områder af fedtvæv. B) Et fotografi af et lufttørret ventrikulært kilepræparat fra et får med apikal ardannelse efter myokardieinfarkt. Skrå skiver af det rekonstruerede mikroCT-billedvolumen krydser ventriklerne på mellemniveau mellem base og spids og proksimal til stedet for (C) vaskulær okklusion (C-rød linje i panel B), (D) peri-infarktområdet, der grænser op til tæt ar og sundt myokardie (D- blå linje i panel B) og (E) et område med tæt fibrose (E - grøn linje i panel B). (C«). Et udvidet billede af septalområdet skitseret af en rød stiplet boks i C. (D') En udvidet visning af infarktområdet i højre ventrikulære spids (blå stiplet boks i panel D). (E«) En udvidet visning af infarktområdet i venstre ventrikulære spids (grøn stiplet boks i panel E). LV: Venstre ventrikulært hulrum; RV: højre ventrikulære hulrum; MB: moderator band; Pap: papillær muskel. Gul pil angiver venstre forreste nedadgående arterie. (F) Massons trikromfarvning af en histologisk sektion skåret fra den PMA-farvede lufttørrede venstre ventrikel. Kollagen er farvet blåt og myokardiet er farvet lyserødt / violet. G) En tilsvarende vævssektion af PMA-farvningsfordelingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62909/62909fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62909/62909fig05.jpg"> Figur 5: MikroCT-billede af et fårehjerte efter kronisk induceret atrieflimren. (A) En volumengengivelse af atrierne med farve tildelt som i figur 4A. (B) Bi-atrial microCT-billedudsnit i hjertets lange akse. Kortaksede skiver blev ekstraheret på niveau med (C) atrioventrikulære ventiler (C- rød linje i panel B), (D) aortarod (D- blå linje i panel B) og (E) venstre atrielt tag (E- grøn linje ipanel B). LA: venstre atrier; RA: højre atrier; LAA: venstre atrielle vedhæng; RAA: højre atrielle vedhæng; LV: venstre ventrikel; RV: højre ventrikel; LVOT: venstre ventrikulær udstrømningskanal; RVOT: højre ventrikulære udstrømningskanal og PA: lungearterie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62909/62909fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Prøve #</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Art</td>
			<td>Svin</td>
			<td>Svin</td>
			<td>Får</td>
			<td>Får</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kropsvægt (kg)</td>
			<td>32.4</td>
			<td>31.2</td>
			<td>47.2</td>
			<td>53.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hjertevægt (g)</td>
			<td>191.2</td>
			<td>186.2</td>
			<td>202.4</td>
			<td>207.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>Patologi</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Kronisk MI</td>
			<td>Kronisk AF</td>
		</tr>
<tr>
<td>Prøve forberedelse</td>
			<td>Hele hjertet</td>
			<td>Hele hjertet</td>
			<td>Kile af forreste hjerte</td>
			<td>Hele hjertet</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tilstand af kontrastindlæsning</td>
			<td>Diffusion</td>
			<td>Perfusion</td>
			<td>Diffusion</td>
			<td>Diffusion</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eksponering for kontrastmiddel (h)</td>
			<td>48</td>
			<td>24</td>
			<td>48</td>
			<td>48</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Hjerteprøver og kontrastmiddelbehandling.

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Preparation Techniques for Contrast-Enhanced Micro Computed Tomography Imaging of Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease at JoVE.com

Tissue Preparation Techniques for Contrast-Enhanced Micro Computed Tomography Imaging of Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease

Her præsenterer vi en protokol til opnåelse af mikrocomputertomografibilleder i høj opløsning af sunde og patologiske store pattedyrs hele hjerter med kollagenselektiv kontrastforbedring.

Vævsforberedelsesteknikker til kontrastforstærket mikrocomputertomografibilleddannelse af store pattedyrs hjertemodeller med kronisk sygdom

Structural remodeling is a common consequence of chronic pathological stresses imposed on the heart. Understanding the architectural and compositional ...

Denne protokol giver mikrostrukturel indsigt i strukturelle patologiske sygdomme på hele organskalaen ved hjælp af mikrocomputertomografi. I denne protokol implementeres en specialiseret vævsforberedelsesmetode for at optimere billeddannelse i høj opløsning af helhjerteprøver fra translationelle store pattedyrsmodeller hos mennesker med selektiv kontrastforbedring af strukturelle sygdomme. Hjertemikrostrukturen som fordelingen af fibrose og organiseringen af det spændende myokardi ligger til grund for et bredt spektrum af hjertesygdomme og sætter scenen for den livstruende arytmi.Nestor Pallares-Lupon, postdoc og ph.d.-kandidat for mit laboratorium, demonstrerer proceduren. Til at begynde med fremstilles en kardioplegisk opløsning indeholdende natriumheparin og opbevares opløsningen ved fire grader Celsius. Derefter forberedes PBS / EDTA ved først at tilsætte EDTA til en liter destilleret vand til en 10 millimolær endelig koncentration.Derefter øges og opretholdes opløsningens pH ved 12 ved anvendelse af natriumhydroxid til opløsning af EDTA. Når EDTA er fuldt opløst, sænkes pH til 7,4 ved hjælp af saltsyre. Tilsæt derefter en foliepose PBS for at opnå en 0,01 molær opløsning med pH 7,4.Opbevar den tilberedte opløsning ved stuetemperatur. Til sidst fremstilles en 1% ethanol PMA-kontrastmiddelopløsning ved at tilsætte 10 gram PMA til en liter absolut ethanol. Opbevar den tilberedte opløsning ved stuetemperatur.Forbered et 1 liters reservoir understøttet 80 centimeter over en dissektionsskål, og par et termoplastisk rør til en afløbsport i reservoiret. Fastgør et trevejshane til drænslangen, og koble yderligere termoplastrør til hver fri port på trevejshanen. Fastgør tovejshaner til de frie ender af slangen.Fyld derefter reservoiret med den kardioplegiske opløsning suppleret med heparin. Åbn vandhanerne for at lade den kardioplegiske opløsning dræne og fjerne alle luftbobler. Luk derefter tovejshanerne.Efter at have ekstraheret hjertet fra et aflivet dyr, skal du placere det i kold kardioplegisk opløsning opbevaret på is, indtil det er klar til dissektion. Forbered derefter kanyle til venstre og højre koronar osteo ved at skære fem centimeter PTFE-slange og opvarme den ene ende ved at placere spidsen ved siden af en åben ild. Når en millimeter af spidsen begynder at smelte og bliver gennemskinnelig, skal du trykke spidsen mod en hård varmebestandig overflade for at forme en højderyg ved kanylespidsen for at forhindre, at kanylen glider ud af karrene, og indsæt derefter en centimeter af den ikke-opvarmede ende af hver kanyle i de to ender af afløbsreservoirets dræningsrør.Fjern derefter aorta kanylen og lokaliser venstre og højre osteo i koronararterierne under den kolde kardioplegiske opløsning. Brug spids saks til forsigtigt at adskille aortaroten fra det omgivende væv over og under koronar osteo for at muliggøre gevindskæring af en nulmåler silkesutur under koronarbeholderen. Åbn derefter tovejshanerne og indsæt kanylespidserne i koronar osteo.Med kanylespidserne, der strækker sig en til to centimeter ind i osteoen og ud over suturplaceringen, skal du binde kanylen af. Skyl derefter hjertet, mens du forsigtigt masserer ventriklerne i 15 minutter, indtil hjertet er ryddet af blod. Efter skylning skal du lukke tovejshanerne, frakoble dem fra trevejshanen og overføre hjertet til en 1 liter kemisk resistent plastbeholder indeholdende 500 ml PBS / EDTA-opløsning.Recikuler PBS/EDTA-opløsningen i den termoplastiske slange under en stinkhætte ved hjælp af en peristaltisk pumpe med to kanaler. Prim pumpeslangen, indtil slangen er fraværende af luftbobler. Gennemgå derefter hver koronararterie kanyle ved recirkulation ved stuetemperatur i to timer ved 80 ml pr. Minut.Når du har sikret, at stinkhætten er i drift, skal du stoppe pumpen, dræne opløsningen fra beholderen og udskifte den med 10% formalin til fiksering i en time ved 80 ml pr. Minut. Gennemgå hjertet ved hjælp af en række stigende ethanolkoncentrationer, der starter med 20% ethanol i mindst tre timer. Udskift derefter 20% ethanol med 30% ethanol og perfus i to timer.Fortsæt perfusionen ved at øge ethanolkoncentrationen ved hver iteration med mindst perfusion på en time ved hver koncentration. For at forstærke hjertevævet før lufttørring skal du recikulere en lige blanding af ethanol og HMDS i 10 minutter efterfulgt af 100% HMDS i yderligere to timer. Stop perfusionspumpen, frakobl derefter kanylen fra slangen og suspender hjertet fra en aortakutur inde i stinkhætten.Skub forsigtigt en lynlåspose over hjertet, og luk poseforseglingen over suturen for at reducere hjertets eksponering for den cirkulerende luft. Lad hjertet tørre gennem fordampning i en uge. Fjern posen for diffusionsbelastningskontrastmidler.Vask hjertet i 100% ethanol i 15 minutter med omrøring, før det nedsænkes i 100% ethanol suppleret med 1% PMA i 48 timer under vakuum, dæk derefter hjertet med en lynlåspose som vist tidligere og lad det tørre. Monter det lufttørrede hjerte på en passende prøveholder. For at forhindre enhver bevægelse under røntgenmikro-CT-målingerne skal du bruge en klemme, der er forankret til prøveholderen, og fastgør hjertet via den tørrede og stive aorta.Monter prøveholderen i mikro-CT-scanneren. Åbn derefter softwaren og start røntgenmikro-CT-systemet. Indstil derefter røntgenfilteret aluminium til en millimeter.Røntgenkildespænding til 60 kilovolt og strøm til 120 mikroampere. Indstil desuden billeddimensioner til 2.016 gange 1.344 pixels og pixelstørrelse til 20 mikrometer. Scout røntgentransmissionsbilleder langs længden af støtten for at bestemme det samlede billeddannelsesfelt i hjertets langsgående adgang.Til scanning skal du bruge et rotationstrin på 0,18 grader, en ramme i gennemsnit på fem og en prøverotation på 180 grader ved at fravælge muligheden for en 360 graders erhvervelse. Vælg forskydningsscanningstilstanden for at afbilde hele bredden af eksempelunderstøttelsen. Efter scanning skal du bruge softwaren til tomografisk rekonstruktion af et isotropt tredimensionelt billedvolumen.I den endelige recon-software skal du bruge erhvervelsesrelateret artefaktkorrektion, herunder strålehærdningseffekter på 10% og reduktion af ringartefakt på otte. Brug derefter Data Viewer-software til at visualisere den rekonstruerede datastak. Orienter prøven digitalt inden for billedgrænserne for at justere prøvernes lange og korte akse med de tre principper en akse i billedvolumenet.Til sidst skal du beskære billedvolumen i alle tre akser for at fjerne billedets ydre baggrundslag og maksimalt reducere den samlede billedstørrelse. Røntgentransmissionsbilleddannelse af lufttørrede svinehjerter viser store anatomiske landemærker, herunder ventrikulære hulrum og muskelvæggen. Tomografiske rekonstruktioner af tredimensionelle billedvolumener viste tydelig adskillelse mellem væv og baggrund ved epikardie- og endokardielle grænser.Masons trikromfarvning viste kollagen positiv farvning ved epitel- og endotellagene paravaskulært i det sub-epikardielle væv. Lys feltbelysning viste mørkere farve i kollagenøse strukturer efter PMA-farvning, hvilket understøtter den foretrukne akkumulering af PMA. PMA-farvede fluorescerende billeder af ventrikulære vævssektioner havde PMA-induceret tab af fluorescens på steder af kollagen.Hvor en hjerteprøve farves med et kontrastmiddel via perfusion inden lufttørring, afslørede billedrekonstruktion meget ujævn farvning i myokardierummet. Desuden viste væv med lav kontrast dårlig adskillelse fra baggrundsintensiteten. Micro CT-billeddannelse af en fårdel, der lider af kronisk myokardieinfarkt, afslørede en central tæt fibrotisk læsion omgivet af en løs og heterogen grænsezone.De største signalintensiteter af rekonstruerede billedvolumener ved vævsgrænserne og arområderne er vist her. Kontrastmidler farvede dårligt det sunde myokardie, men alligevel blev mikrostrukturel kontrast bevaret. Ved grænseområdet blev arvæv afbrudt af overlevende myokardie.Tæt fibrose optrådte transmuralt, men struktureret, hvilket indikerer variationer i sammensætningen. Transmural venstre ventrikulær region af PMA farvet vævspræparat viste selektiv farvning for kollagen og ingen farvning i områder af overlevende myokardie. Længere perfusionstider ved hjælp af ethanol anbefales for at sikre fuldstændig udveksling af hjertets vandindhold med ethanol.Interaktioner mellem HMDS og vandet producerer varme, hvilket kan beskadige prøven. En stærk fordel ved denne procedure er evnen til at validere mikro CT-billeddannelse ved hjælp af histologi. Lufttørrede prøver kan indlejres direkte i paraffin til sektionering af farvning og mikroskopisk billeddannelse.

Research

JoVE Journal

Medicine

Contrast Enhanced Vessel Imaging using MicroCT

Microscopic computed tomography (microCT) offers high-resolution volumetric imaging of the anatomy of living small animals. However, the contrast between ...

Segmentation and Measurement of Fat Volumes in Murine Obesity Models Using X-ray Computed Tomography

Segmentering og måling af tykke bind i murine Fedme-modeller vha. X-ray Computed Tomography

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are ...

Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging

Retrograd perfusion og påfyldning af Mouse koronar kar som forberedelse til Micro Computed Tomography Imaging

Visualization of the vasculature is becoming increasingly important for understanding many different disease states. While several techniques exist for ...

Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

Osmotisk Drug Delivery til Iskæmisk bagbensknogler og perfusion af kar med Microfil for Micro-computertomografi Imaging

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Vurdering af virksomhedens rentabilitet for Human Fat Injektion i nøgne mus med Micro-Computed Tomography

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

Kombineret Nær-infrarød Fluorescent Imaging og Micro-computertomografi for Direkte Visualisering Cerebral tromboemboli

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

Cardiac Magnetic Resonance for the Evaluation of Suspected Cardiac Thrombus: Conventional and Emerging Techniques

Hjerte magnetisk resonans til vurdering af mistanke om kardiel Trombus: konventionelle og nye teknikker

We present the conventional cardiac magnetic resonance (CMR) protocol for evaluating a suspected thrombus and highlight emerging techniques.&#160;The ...

DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis

DUCT: Dobbelt harpiksstøbning efterfulgt af mikro-computertomografi til 3D-leveranalyse

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the ...

Sample Preparation for Computed Tomography-based Three-dimensional Visualization of Murine Hind-limb Vessels

Prøveforberedelse til computertomografibaseret tredimensionel visualisering af Murine Hind-limb Vessels

Blood vessels are complex networks with tree-like structures, and vascular networks are essential for maintaining both circulation and maintaining organ ...

Four-Dimensional Computed Tomography-Guided Valve Sizing for Transcatheter Pulmonary Valve Replacement

Firedimensionel computertomografistyret ventilstørrelse til udskiftning af transkateter lungeventil

The measurements of the right ventricle (RV) and pulmonary artery (PA), for selecting the optimal prosthesis size for transcatheter pulmonary valve ...