Name: tissue preparation techniques for contrast-enhanced micro computed tomography imaging of large mammalian cardiac models with chronic disease
Uploaded: 2022-02-08T14:00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Preparation Techniques for Contrast-Enhanced Micro Computed Tomography Imaging of Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease at JoVE.com

Denne studien fikk økonomisk støtte fra den franske regjeringen som en del av "Investments of the Future" -programmet administrert av National Research Agency (ANR), Grant-referanse ANR-10-IAHU-04, og Leducq Foundation (RHYTHM-nettverket), samt Grant-referanse ANR-17-CE14-0029-01 [UNMASC], finansiering fra Det europeiske forskningsområdet for hjerte- og karsykdommer (ERA-CVD), tilskuddsreferanse H2020-HCO-2015_680969 [MultiFib] og finansiering fra den franske regionen Nouvelle Aquitaine, tilskuddsreferanser 2016 - 1R 30113 0000 7550/2016-1R 30113 0000 7553 og ANR-19-ECVD-0006-01.

Alle eksperimenter ble utført etter retningslinjene fra Europaparlamentets direktiv 2010/63/EU om beskyttelse av dyr som brukes til vitenskapelige formål. Dyreprotokoller ble godkjent av den lokale etiske komiteen (CEEA50) ved Universitetet i Bordeaux. Hjerter ble hentet fra tre store pattedyrmodeller, inkludert (i) Sunne store hvite griser (N = 2, 2 måneder gamle); (ii) Sauer (N = 1, 2 år) med indusert hjerteinfarkt13 og (iii) Sauer (N = 1, 7 år) med indusert atrieflimmer30.
1. Løsningsforberedelse:
<ol><li>Kardiolegert oppløsning: Forbered 3 L destillert vann og tilsett natriumklorid (110 mM), kaliumklorid (16 mM), natriumbikarbonat (10 mM), D-(+)-glukose (9 mM), kalsiumkloridoppløsning (1,2 mM) og magnesiumkloridoppløsning (16 mM). På slutten, tilsett 500 μL / L heparinnatrium. Spar denne oppløsningen ved 4 °C.</li>
	<li>Fosfatbufret saltvann - EDTA-løsning (PBS-EDTA).<ol>
<li>Tilsett først etylendiamintetraketisk syre (EDTA) til 1 liter destillert vann for en endelig konsentrasjon på 10 mM. Øk og vedlikehold en løsning pH på 12 ved hjelp av natriumhydroksidoppløsning (1 M) for å oppløse EDTA.</li>
		<li>Når EDTA er fullstendig oppløst, senk pH til 7,4 ved hjelp av saltsyre. Tilsett en foliepose med fosfatbufret saltvann for å få en løsning på 0,01 M (natriumklorid, 0,138 M; kaliumklorid, 0,0027 M) og pH 7,4. Spar denne løsningen ved romtemperatur (RT).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Etanol - fosfomolybdic acid (PMA) kontrastmiddelløsning: Forbered 1 L absolutt etanol og tilsett PMA for å oppnå en løsning ved 1% konsentrasjon. Spar denne løsningen hos RT.</li>
</ol>2. Kilde til vev
<ol><li>Euthanize dyret og trekke ut hjertet i henhold til lokale etiske retningslinjer. Senk raskt hjertet ned i kald kardiolegert løsning og masser forsiktig ventriklene for første skylling.</li>
	<li>Pass på å kutte aorta under aortabuen og klem to sider av arterieveggen ved hjelp av nåleholdere.</li>
	<li>Suspendere hjertet ved nåleholderne, sett inn en aortakanyle i aortaroten, pass på at du ikke kommer i kontakt med eller stikker ut gjennom aortaventilene. Pakk en 0 gauge sutur rundt aortabuen på kanylens nivå og bind kanylen godt på plass.</li>
	<li>Bruk 50 ml sprøyter, injiser 200 ml kald (4 °C) kardiolegert oppløsning. Fjern overflødig blod pooling i hulrommene ved å tippe hjertet på sin bakre side for å drenere via lungeårene.</li>
	<li>Senk det skyllede hjertet ned og oppbevar den i kald kardiolegert oppløsning lagret på is til det er klart for disseksjon.</li>
</ol>3. Vev forberedelse:
<ol><li>Forbered et 1 L reservoar som støttes 80 cm over en disseksjonsfat. Koble et termoplastrør 80 cm i lengde og 3,2 mm innvendig diameter og 4,8 mm utvendig diameter til en dreneringsport i reservoaret.</li>
	<li>Fest en treveis kran til dreneringsslangen og koble ytterligere termoplastiske rør (20 cm, 1,6 mm innvendig diameter og 3,2 mm ekstern diameter) til hver fri port på treveiskranen. Fest toveiskraner til gebyrendene på slangen.</li>
	<li>Fyll reservoaret med den kardiolegerte oppløsningen supplert med heparin (2500 enheter). Åpne kranene slik at den kardiolegerte løsningen kan drenere og fjerne alle luftbobler, og lukk deretter toveiskranene.</li>
	<li>Forbered kanyle for venstre og høyre koronar ostia ved hjelp av Polytetrafluoretylen (PTFE) rør (1 mm indre diameter og 2 mm ytre diameter).<ol>
<li>Klipp 5 cm rør og varm den ene enden ved å plassere spissen ved siden av en åpen flamme. Når 1 mm av spissen begynner å smelte og blir gjennomsiktig, trykker du spissen mot en hard varmebestandig overflate for å forme en ås på kanylspissen for å forhindre at kanylen glir ut av karene.</li>
		<li>Sett inn 1 cm av den ikke-oppvarmede enden av hver kanyle i de to endene av dreneringsbeholderens dreneringsrør.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fjern aortakanylen. Under kald kardiooplegisk løsning, lokaliser venstre og høyre ostia av koronararterier.</li>
	<li>Bruk spiss saks, separer forsiktig aortaroten fra det omkringliggende vevet over og under koronar ostia for å muliggjøre gjenging av en 0 G silke sutur under koronarbeholderen.</li>
	<li>Åpne toveiskranene og sett kanylespissene inn i koronar ostia. Med kanylespissene som strekker seg 1-2 cm inn i ostia og utover suturplasseringen, bind av kanylen.</li>
	<li>Skyll hjertet mens du masserer ventriklene forsiktig i 15 minutter til hjertet er ryddet for blod.</li>
	<li>Etter skylling, lukk toveiskranene og koble dem fra treveiskranen. Overfør hjertet til en 1 L plast kjemisk motstandsdyktig beholder som inneholder 500 ml PBS-EDTA-løsning.</li>
	<li>Resirkuler PBS-EDTA-oppløsningen i termoplastslangen under en avtrekkshette ved hjelp av en peristaltisk pumpe med to kanaler. Prime pumperørene til slangen er fraværende av luftbobler, og forvreng deretter hver koronararteriekanyle ved resirkulering ved RT i 2 timer ved 80 ml / min.</li>
	<li>Kontroller at avtrekkshetten er i drift. Stopp pumpen, tøm oppløsningen fra beholderen og erstatt den med formalin (10%) for fiksering i 1 t ved RT ved 80 ml / min.</li>
	<li>Bytt ut formalinløsningen med PBS for å skylle fikseringsmiddelet tre ganger i 15 minutter hver på 80 ml/min.</li>
</ol>4. Vev dehydrering og tørking:
MERK: Bruk samme perfusjonshastighet (80 ml/min) og la vevet forbli ved RT gjennom hele.
<ol><li>Erstatt PBS-oppløsning med etanol ved 20%, fortynnet i ultra-rent vann og parfyme i minst 3 timer.</li>
	<li>Perfuse hjertet ved hjelp av en rekke økende etanol konsentrasjoner.<ol>
<li>Begynn med å erstatte 20% etanoloppløsning med etanol fortynnet til 30% og parfyme i 2 timer.</li>
		<li>Gjenta perfusjon ved å øke etanolkonsentrasjonen ved hver gjentakelse gjennom 40 %, 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 95 %, 90 %, 95 %, 99 % og 100 % i minimum varighet på 1 time ved hvert trinn (konsentrasjon). MERK: Hjerteprøver kan hvile uten perfusjonsstrøm over natten ved noen etanolfortynning hvis minimum perfusjon på 15 min har funnet sted for den konsentrasjonen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>VALGFRITT: Hvis du bruker kontrastmidler via perfusjon, må du parfyme hjertet med 100 % etanol supplert med kontrastmiddelet PMA, 1 % i 48 timer. Skyll kontrastmiddelet ved perfusjon med 100% etanol i 2 timer.</li>
	<li>For å forsterke hjertevevet før lufttørking, resirkulere en 50:50 blanding av etanol og heksametyldisilazan (HMDS) i 10 min. Følg dette med 100% HMDS i ytterligere 2 timer. FORSIKTIG: HMDS er et svært giftig og skadelig stoff. En sterk lukt av ammoniakk frigjøres i kontakt med luft. Videre er den flytende formen av HMDS svært flyktig og katalysert av jodholdige midler.</li>
	<li>Koble kanylen fra slangen og suspendere hjertet fra en aorta sutur inne i avtrekkshetten.</li>
	<li>Skyv forsiktig en glidelåspose over hjertet og lukk posetetningen over suturen for å redusere eksponeringen av hjertet for sirkulerende luft. La hjertet tørke gjennom fordampning i 1 uke.</li>
	<li>VALGFRITT: For diffusjonslastende kontrastmidler, vask hjertet i 100% etanol i 15 minutter mens du agiterer. Senk hjertet i 100% etanol supplert med PMA, 1%, i 48 timer under vakuum. Gjenta trinn 4.6.</li>
</ol>5. MikroCT:
MERK: Et røntgenmikroCT-system på skrivebordet ble brukt til å avbilde grishjerter.
<ol><li>Monter det lufttørkede hjertet på en passende prøveholder. Forhindre bevegelse under røntgenmikroCT-målingene ved hjelp av en klemme forankret til prøveholderen og fest hjertet via den tørkede og stive aortaen.</li>
	<li>Juster omhyggelig midten av hjerteprøven langs den langsgående aksen med midten av bildefeltet for 0° og 90° rotasjonsvinkler. For å oppnå dette i alle retninger, suspender hjertet i luften via en aortaklemme festet til prøvestøtten.</li>
	<li>Etter å ha åpnet programvaren og startet røntgenmikroCT-systemet, bruk røntgenfilteraluminium, 1 mm, røntgenkildespenning til 60 kV og strøm til 120 μA. Sett bildedimensjonene til 2016 x 1344 piksler og pikselstørrelse til 20 μm.</li>
	<li>Trekk prøveholderen ut av synsfeltet og kalibrer bakgrunnsbildet og røntgeneksponeringstiden ved å få en flat feltkorrigering. Forsikre deg om at den gjennomsnittlige røntgenoverføringen i bakgrunnen er større enn 80%.</li>
	<li>Speider røntgenoverføringsbilder langs lengden av støtten for å bestemme det totale bildefeltet i hjertets langsgående akse. For skanning bruker du et rotasjonstrinn på 0,18°, et bildegjennomsnitt på 5 og en prøverotasjon på 180°. Velg forskyvningsskanningsmodusen for å vise hele bredden på prøvestøtten. MERK: Oppkjøpsparametrene som er angitt i denne delen, er valgt for å optimalisere bildekvaliteten til ensemblets hjertesammensetning.</li>
	<li>Etter skanning, bruk programvaren for tomografisk rekonstruksjon av et isotropisk tredimensjonalt bildevolum. For bruk av NRecon programvare, bruk anskaffelsesrelatert artefakt korreksjon, inkludert stråleherding effekter av 10% og ring artefakt reduksjon av 8.</li>
	<li>Hvis du vil optimalisere datalagringsbegrensningene, bruker du det minste rektangulære interesseområdet som omfatter hjertespesifikke bildevoksler. Eksporter bildene i et 8-biters punktgrafikkformat som en bildestakk.</li>
	<li>Visualiser den rekonstruerte datastakken ved hjelp av DataViewer-programvaren. Orienter prøven digitalt innenfor bildegrensene for å justere prøvens lange og korte akser på nytt med de tre hovedaksene i bildevolumet.</li>
	<li>Beskjær bildevolumet i alle tre aksene for å fjerne ytre bakgrunnslag i bildet, for å redusere den totale bildestørrelsen maksimalt.</li>
</ol>

En detaljert protokoll for store vevspreparater er satt ut ved hjelp av hele hjerter fra store pattedyr for etterfølgende høyoppløselig strukturell avbildning. En lufttørkende tilnærming fjernet påvirkninger av røntgendemping i bakgrunnen og maksimalt optimalisering av vev: bakgrunnskontrast29. Ved hjelp av denne tilnærmingen ble det oppnådd en isotropisk oppløsning i området 20 μm for volumetrisk avbildning på tvers av prøver opp til 7,2 cm i diameter. MikroCT av bløtvev er imidlertid vanligvis avhengig av bruk av ikke-spesifikke kontrastmidler for å forbedre røntgenabsorpsjon og følsomhet for mikro-CT-systemer34. Selv om røntgenkontrastmidler forbedrer den generelle røntgendempingen og avbildningsforbedringen av bløtvev, er separasjon av vevsbestanddeler basert på biokjemisk sammensetning fortsatt utfordrende. Det ble imidlertid observert at bruk av lufttørkede hjerter i kombinasjon med et vanlig røntgenkontrastmiddel i laboratorieinnstillingen, PMA, selektivt farget ekstracellulære komponenter. Bindevev forbundet med sunt myokardium og patologisk strukturell ombygging ved kroniske sykdommer ble forbedret.
Prosessen med lufttørkende biologisk vev krever en intervensjon for å motstå deformasjonen av prøven. Prøvepreparering for elektronmikroskopi har lignende krav. Vanligvis brukes en kritisk tørkemetode, som bruker en balanse mellom vevsinnlevelsesmedium, temperatur og trykk for å eliminere overflatespenning av vevets flytende innhold, noe som forårsaker deformasjon på molekylært nivå ved fordampning35. Denne tilnærmingen krever jevn utskifting av prøvens vanninnhold med flytende karbondioksid, noe som er mer pålitelig i små og lett diffusible prøver. Alternativt kan vevets strukturelle integritet forbedres og lufttørking, det vil si at fordampningsfasen kan påføres over en lengre periode for å redusere den totale deformasjonen. Molekylet HMDS gjennomgår silylering for å danne et silikonbasert stillas for å forsterke og stabilisere den molekylære organiseringen av vevsprøven36. Fordampning forlenges ytterligere ved å begrense sirkulerende luftstrømmer fra miljøet, også for å unngå inhomogen fordampning, spesielt mellom prøveoverflaten og intramurale lag.
Tallrike kontrastmidler har tidligere blitt brukt til mikro-TIL-avbildning av bløtvev. De vanligste er jod, fosfotungstisk syre (PTA) og PMA. Jod har særlig vært ansatt på grunn av en høyere diffusjonsratepå 34,37,38. Likevel fungerer jod som en katalysator for silylering av HMDS reagens36. Den katalyserte reaksjonen er aggressiv og eksotermisk, med høy risiko for ødeleggelse av prøven og sikkerhetsrisikoen hvis gjenværende HMDS forblir på grunn av ufullstendig desiccation av prøven. Både PTA og PMA oppløst i etanol kan trygt brukes sammen med HMDS. PTA og PMA har vist seg å gi større oppløsningskraft av fine strukturer i ikke-mineraliserte mellomvirvelskiver sammenlignet med jodfarging38. Ved mikro-avbildning av pattedyrprøver har PTA og PMA blitt brukt til farging avmuseembryoer 39, mus kardiovaskulærsystem37, kaninmuskel og hjerne40, og pinnsvin41. PTA har høyere molekylmasse og tetthet i oppløsning enn PMA. Dette skyldes delvis en høyere atommasse av wolfram (atomnummer er 74 g/ mol), det viktigste dempingselementet i PTA. Til sammenligning har det tyngste elementet i PMA, molybden, et atomnummer på 42 g / mol. Både atommasse og prøvetetthet ligger til grunn for røntgendemping, i tillegg til prøvetykkelsen42. Røntgenbanelengden økes ved å øke prøvestørrelsene, og røntgendemping blir mer følsom for økt prøvetetthet. Derfor ble pma-kontrastagenten med lavere tetthet valgt for å redusere risikoen for overdemping og for å optimalisere det dynamiske spekteret av bildekontrast for hjerter i menneskelignende skala. Ytterligere bevis har vist at diffusjonsbelastning av PMA gir mer homogen farging enn for det større molekylet PTA i hjertevev43.
Metoden for levering av kontrastmiddel påvirker ensartetheten av kontrastmiddelfordeling i hjertevev (figur 3). Perfusjon av kontrastmidler i det etanol-dehydrerte hjertet viste lappete bakgrunnsfargingsnivåer av PMA på grunn av variabel vaskulær motstand. I det lufttørkede hjertet understrekes muskel laminærstrukturen av prøvetørkingsprosessen, noe som øker muskel laminær separasjon. Dette forbedret til slutt vevets generelle permeabilitet for diffusjonsbasert kontrastmiddelbelastning. Følgelig tilrettelegger lufttørking vev: luftkontrast på laminære og intralaminære nivåer (figur 4). Videre kan diffusjonslasting ytterligere lettes ved påføring under et vakuum. Det har videre vist seg at vevskrymping av ikke-tørkede prøver er avhengig av kontrastmiddelkonsentrasjon40. Imidlertid hemmer tidligere morfologisk stabilisering av prøven ved lufttørking vevskrympingseffekter29.
Mikro-CT-bilder med høy oppløsning av hele organer produserer iboende store datavolumer. Tomografiske bildeteknikker muliggjør visualisering og bildehåndtering stykke for stykke, noe som letter databehandlingen og minnebelastningen. For å visualisere tredimensjonale bildestakker, for eksempel for å gjengi prøvevolumer i tredimensjonale representasjoner, er de anbefalte minimumsspesifikasjonene for datamaskiner 128 GB RAM og en prosessorhastighet på 3 GHz. Solid-state-harddisker forbedrer også dataoverføringen betydelig.
Fremveksten av mikro-avbildning i hjertefeltet gir mange fordeler for translasjonsstudier og klinisk validering. Fordelene med sin tredimensjonale og mikrometriske avbildning har allerede vist anvendelser for å bestemme den trombotiske byrden av ST-høyde myokard iskemipasienter44,45. Kartlegging av potensielle kilder til arytmi hos strukturelle hjertesykdomspasienter er i stor grad avhengig av å bestemme fordelingen av fibrotisk arrvev og lokalisere sammenvevde spor av overlevende myokardium. Andrelinje tilnærminger for diagnostisering av ventrikulære arytmier bruker magnetisk resonansavbildning46. Den kan robust lokalisere tett fibrose, men er begrenset til lavoppløselig morfologisk karakterisering og gir begrenset innsikt i mikrostrukturell ombygging og diffuse fordelinger av fibrotiske lesjoner47. Høyoppløselig undersøkelse av arrfordeling og karakterisering har et stort potensial for å forbedre vår forståelse av hjertestrukturell ombygging og risikoen for å utvikle hjertesvikt. Spesielt vil grunnleggende forskningsstudier eller post-mortem undersøkelser dra nytte av bekreftende strukturelle bilder for elektrisk kartlegging av hjertearytmi.
Til slutt kan hjerter forsterket med HMDS-behandling og lufttørking senere farges med et røntgenkontrastmiddel for å forbedre røntgendempingen av ekstracellulære komponenter. Spesielt i sunt myokardium forekommer PMA-akkumulering ved epitelet, valvulært vev og rom i ventrikulært ledningssystem kledd av bindevev resulterte i forbedret røntgendemping. Videre, i strukturelt sykt myokardium, var forbedret kontrast ytterligere selektiv for fibrose.

Strukturell hjertesykdom står for det meste av hjerterelatert dødelighet over hele verden1. Ombygging av hjertestruktur påvirker myokardmiljøet og interstitialrommet. Siden både hjerteelektrisk og mekanisk funksjon avhenger av myocyttorganisasjon, kan forstyrrelser føre til utålelig hjertearytmi, nedsatt blodpumpende handlinger og hjertesvikt 2,3,4,5,6,7,8,9. Utviklingen av kurative terapier for strukturelle hjertesykdommer oppveies langt av sykdomsprevalensen 2,5. Som sådan dukker det opp økende antall prekliniske modeller av strukturelle hjertesykdommer for å bedre forstå de anatomo-morfologiske profilene og resulterende patogenese av hjertearytmier 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23. Observert på tvers av strukturelt sykdomsspekter er oppregulering av interstitiell fibrose og, mer vanlig i iskemirelaterte tilfeller, myokard erstatning ved fibrose og fettvev18. Morfologisk forståelse av patologiske ekstracellulære komponenter kan muliggjøre identifisering av potensielle substrater av arytmi. Fordelingen og omfanget av sykdommen gir sterke indikatorer på arytmogene risikoer. Likevel gjenstår utfordringer med omfattende bildesykdomsprofiler ved å integrere makro- og mikroskalaer i det intakte hjertet.
Mikro-beregnet tomografi (microCT), basert på røntgenstråler, fremstår som et kraftig verktøy for å forhøre bløt biologisk vev mikrostruktur ved hjelp av kontrastmidler. Svært detaljerte anatomiske kart er oppnådd for hjerter fra små gnagere 24,25,26 og små dissekerte prøver fra store pattedyrhjerter 27,28. Imidlertid presenterer avbildning på hele organnivået av store pattedyrhjerter overdreven banelengder over hvilke røntgenfotoner dempes ved hjelp av konvensjonelle vevsforberedelsesteknikker. Dette innebærer kontrastlasting av vevet og nedsenking av prøven i et kontrastmiddelløsningsmiddel under oppkjøpet. Hvis du øker utvalgsstørrelsen og oppløsningen, forlenges den totale anskaffelsestiden. Derfor blir vevsstabilitet avgjørende for brukbar bilderekonstruksjon, noe som betyr at vevsdeformasjon som følge av tørking må forhindres. Bruken av en nedsenkningsvæske har imidlertid ulemper: (i) den generelle bakgrunnssignalintensiteten blir ikke ubetydelig og (ii) fremmer fortynning av vevsbundne kontrastmolekyler. Begge disse faktorene bidrar til å redusere bildekontrasten.
Denne studien beskriver en ny vevsbehandlingsrørledning for å lindre fotondemping i bakgrunnen og optimalisere det dynamiske området som tilbys av kontrastforbedringsagenter. Det foreslås å bruke en vevslufttørking tilnærming med kjemisk vevsforsterkning for å begrense vevsdeformasjon29. Derfor kan vevsprøver forbli stabile i luften for lange oppkjøp og utelate bakgrunnsbidrag fra nedsenkningsvæsker. Denne metodikkrørledningen gir: (i) en omfattende vevsbehandlings- og bildeprotokoll optimalisert ved hjelp av hele grishjerter; (ii) en evaluering av kontrastkonsentrasjon og lasteteknikker og( iii) anvendelse av denne rørledningen i to distinkte kroniske sykdomsmodeller av atrieflimmer og hjerteinfarkt i sauehjerter. Utvikling av kroniske sykdomsmodeller har blitt beskrevet andre steder for hver kroniske hjertesykdomsmodell, hjerteinfarkt indusert av perkutan koronararterieemboli13 og selvforsynt atrieflimmer30.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin</td>
			<td>Diapath</td>
			<td>F0043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>21114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Canulation Tubing PTFE</td>
			<td>VWR</td>
			<td>DENE3400102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Head 1L Reservoir</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>50-0496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>796881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium (5000 U/mL)</td>
			<td>Panpharma</td>
			<td>3400891287301.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440191-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, ACS reagent, 37%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>63020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphomolybdic acid hydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>417895000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Tubing, 3-Stop</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>FV-96328-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SkyScan, 1276</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>micro CT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution 50% in H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>415413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Connector Kits</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-1407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM 1089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Tygon R-3603 1.6 mm 3.2 mm 0.8 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>228-1279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Tygon R-3603 3.2 mm 4.8 mm 0.8 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>228-1283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-part single-use syringes 50 mL</td>
			<td>Norm-Ject</td>
			<td>4850001000</td>
			<td>Pyrogen-free, PVC-free</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue preparation techniques for contrast-enhanced micro computed tomography imaging of large mammalian cardiac models with chronic disease

Strukturell ombygging er en vanlig konsekvens av kroniske patologiske påkjenninger pålagt hjertet. Å forstå de arkitektoniske og komposisjonelle egenskapene til sykt vev er avgjørende for å bestemme deres interaksjoner med arytmisk oppførsel. Mikroskala vevsoppussing, under den kliniske oppløsningen, fremstår som en viktig kilde til dødelig arytmi, med høy utbredelse hos unge voksne. Det gjenstår fortsatt utfordringer med å oppnå høy bildekontrast med tilstrekkelig mikroskalaoppløsning for prekliniske modeller, for eksempel store pattedyrhjerter. Videre mangler vevssammensetning-selektiv kontrastforbedring for tredimensjonal høyoppløselig avbildning fortsatt. Ikke-destruktiv avbildning ved hjelp av mikro-beregnet tomografi viser løfte om høyoppløselig avbildning. Målet var å lindre lidelser ved røntgen over demping i store biologiske prøver. Hjerter ble ekstrahert fra friske griser (N = 2), og sauer (N = 2) med enten indusert kronisk hjerteinfarkt og fibrotisk arrdannelse eller indusert kronisk atrieflimmer. Eksisjonerte hjerter ble perfundert med: en saltløsning supplert med et kalsiumion slukkemiddel og en vasodilator, etanol i seriell dehydrering og heksametyldisilizan under vakuum. Sistnevnte forsterket hjertestrukturen under lufttørking i 1 uke. Kollagen-dominerende vev var selektivt bundet av et røntgenkontrastforbedrende middel, fosfomolybdic syre. Vevskonformasjonen var stabil i luften, noe som tillot langvarige mikrocomputerte tomografianskaffelser for å oppnå høyoppløselige (isotrope 20,7 μm) bilder. Optimal kontrastmiddelbelastning ved diffusjon viste selektiv kontrastforbedring av epitellaget og sub-endokardielle Purkinje-fibre i sunne gris ventrikler. Atrieflimmerhjerter (AF) viste forbedret kontrastakkumulering i de bakre veggene og vedleggene til atriene, tilskrevet større kollageninnhold. Myokardinfarkthjerter viste økt kontrast selektivt i områder av hjertefibrose, noe som gjorde det mulig å identifisere vevende overlevende myokardmuskulaturfibre. Kontrastforbedrede lufttørkede vevspreparater gjorde det mulig å farge mikroskala avbildning av det intakte store pattedyrhjertet og selektiv kontrastforbedring av underliggende sykdomsbestanddeler.

Utarbeidelsen av store pattedyrhjerter ved hjelp av dehydrerings- og lufttørkingsmetoden fjerner alt vanninnhold fra prøven. Tegn på utilstrekkelig vannutskifting ved etanol kan observeres under HMDS-lasting (se protokoll, trinn 4.4). Tilstedeværelsen av vann under HMDS vil skape bobler som stiger fra vevet. Ved for høye vannstander kan det oppstå en økning i temperaturen på nedsenkningsvæsken. Å holde nedsenkningskammeret omgitt av is under første HMDS-lasting kan redusere de dårlige effektene av vevsoppvarming. Etter lufttørkende hjerter i fravær av kontrastmidler, vil prøven se hvit ut i fargen (se Protokoll, trinn 4.6). Den ytre overflaten ble ofte tørket og strukturelt stabil før intramurale lag. Skylling i etanol før kontrastmiddellasting fjernet det hvite avleilet (se protokoll, trinn 4.7). Kutting gjennom vev ved hjelp av et skarpt blad avslører makroskopisk individuelle muskelfibre med klar separasjon. Kontrastbelastning ved nedsenking av hjerteprøver i kontrastmiddelmedium led av diffusjonsgrenseartefakter i tykke og svært muskuløse områder av prøven. Diffusjonskontrastbelastning under vakuum ga mer homogen fargedannelse i muskel (hjerteprøve #1, se tabell 1 for innlastingstider for kontrastmiddel). Makroskopisk viste fordelingen av overflatekontrastmiddelet i homogen farging mellom hjertemuskel og regioner som hovedsakelig består av ekstracellulære komponenter, spesielt fett og bindevev. Lufttørkede vevsprøver, enten før eller etter kontrastmiddelbelastning, opprettholdt stabil strukturell integritet.
Tiden som var nødvendig for å skanne hele bredden på prøven ved 20 μm oppløsning under microCT ved hjelp av ovennevnte skanneparametere og en eksponeringstid på 1700 ms var 6 h 34 min. Avhengig av størrelsen på prøven i gantryaksen til skanneren, ble denne varigheten multiplisert med antall stillinger som trengs for å fange opp hele lengden på prøven. For gris- og sauehjerter i denne studien ble tre til fire stillinger brukt. NRecon-programvaren flisla multiposisjons- og offset-skanningene for å danne et enkelt røntgenprojeksjonsbilde for hvert rotasjonstrinn i røntgenkilden og detektoren. Totalt lagres 1000 projeksjoner som 16-biters bilder, og genererer 30-40 GB data. Rekonstruerte volumetriske bilder var 52-70 GB.
Store anatomiske landemerker, inkludert ventrikulære hulrom, septum og frie vegger på ventriklene, var lett identifiserbare fra røntgenoverføringsavbildning av lufttørkede grisehjerter farget med kontrastmiddel ved diffusjonslasting (figur 1A). Videre ble det også observert svært teksturerte områder som indikerer mikrostrukturell organisering, for eksempel myokardfiberorientering, på grunn av sensitiv røntgendemping/overføring (figur 1B). Tomografiske rekonstruksjoner av tredimensjonale bildevolumer viste tydelig separasjon mellom vev og bakgrunn ved både epikardiale og endotelmessige grenser (figur 1D). Intramuralt ble lav kontrast og voxel intensitet diffusjon gradient observert gjennom tykke transmurale områder av vevet. Til tross for det var vaskulatur og myokardfibre skilt av spaltingsfly fortsatt lett identifiserbare. En annen høyere intensitet båndbredde av kontrast ble observert på epikardiial-mest lag og i punctate sub-endokardielle regioner. Kontrastforbedringen var størst på steder der ekstracellulære komponenter ble akkumulert, spesielt epikardialt bindevev, epikardialfett og bindevevshylsen til Purkinje fibernettverket. Voxel-signalintensitetsfordelingene viste høy separasjon fra nullintensitetsbakgrunnen (luft) og to dominerende populasjoner av lavt og høyt kontrastvev (figur 1D).
For å validere kontrastforbedring av mikro-CT-bilderekonstruksjoner og selektiviteten til kollagenøse rom i hjerteprøvene, ble histologi, lysfeltmikroskopi og fluorescerende mikroskopi brukt (figur 2). En transmural blokk av ventrikulært vev fra et lufttørket hjerte uten tidligere kontrastmiddellasting ble forberedt for parafininnbygging og seksjonering. Tilstøtende vevsskiver montert på mikroskopskred ble behandlet av enten Massons trichromefarging, ingen behandling eller 48 timer PMA (1%). Nedsenking av lysbildemonterte vevsseksjoner eliminerte diffusjonsgradienteffekter av fargingsprosessen som ble observert i hele hjerteprøver. Masons trichrome farging viste kollagenpositiv farging ved epitel- og endotellagene, perivascularly i det sub-epikardiale vevet, og en bindevevshylse rundt en frittgående Purkinje fiber som stikker ut i venstre ventrikulære hulrom (figur 2A). Lysfeltbelysning viste mørkere fargelegging i kollagenøse strukturer etter PMA-farging, og støttet preferanseakkumulering av PMA (figur 2B, C). Videre har PMA-behandling tidligere vist seg å slukke autofluorescence av kollagen makromolekylære komplekser31. Fluorescensbilder av ventrikulære vevsseksjoner hadde PMA-indusert tap av fluorescens på steder av kollagen (figur 2D vs. 2E, figur 2D' vs. 2E' og figur 2D'' vs. 2E''). I både lyse felt og fluorescerende avbildning ble ikke cellulære rom endret av PMA-behandlingen, og kollagen hadde en selektiv opphopning av PMA-farging og slukking av autofluorescence.
Hjerteprøve #2 ble farget med et kontrastmiddel via perfusjon før lufttørking. Bilderekonstruksjon avdekket svært klumpete flekker i myokardrommet (figur 3A). Kontrastforbedring virket uselgivelig for vevssammensetning, uten ytterligere forbedring av signalintensiteten ved epikardielle eller sub-endokardiale regioner. Videre viste vev med lav kontrast dårlig separasjon fra bakgrunnsintensiteten (figur 3B).
Ventrikulær fibrose ble indusert av hjerteinfarkt og kronisk iskemi (Hjerteprøve #3). Et antero-apikalt arr ble dannet ved å erstatte myocytter med fibrofettavsetninger i vevet nedstrøms til stedet for vaskulær embolisering. Hjerteprøve #3 ble utarbeidet og avbildet fra en dissekert ventrikulær kile som dekker den fremre venstre ventrikelen, septumet og høyre ventrikulære frie veggen. Utarbeidelsen av denne ventrikulære kilekonfigurasjonen er beskrevet tidligere32 og anvendelsen av kiler for hjerteavbildning ble gjennomgått i detalj33. Arrmorfologi var transmural, men heterogen (figur 4). En sentral tett fibrotisk lesjon var omgitt av en løs og heterogen grensesone (figur 4A). Ventrikkelpreparatet ble farget av diffusjonslastende etterluftstørking og i et vakuum. Figur 4B-E viser de største signalintensitetene av rekonstruerte mikro-CT-bildevolumer ved vevsgrensene og arrområdene. Kontrastmidler farget dårlig sunt myokardium, men mikrostrukturell kontrast ble beholdt (figur 4C).). Ved grensesonen ble arrvev ispedd overlevende myokard (figur 4D).) Tett fibrose dukket opp transmural, men teksturert, noe som indikerer varianser i komposisjon (figur 4E).). Vevsseksjoner av en transmural venstre ventrikulær region av lufttørket og PMA-farget vevspreparat ble brukt til å validere PMA-selektivitet for kollagen i patologisk vev ved å sammenligne med Massons trichromefarging (figur 4F). PMA-farging var selektiv for kollagen (sub-epikardi og sub-endokardi) og fraværende i områder med overlevende myokardi (figur 4G).
Hjerteprøve #4 med indusert vedvarende atrieflimmer ble lufttørket mens den bevarte den opprinnelige formen på atriehulen. Atrievedleggskollaps ble ikke observert. De viktigste anatomiske landemerkene kan identifiseres morfologisk fra rekonstruerte bilder (atrie septum, pektinate muskler, koronar sinus, lunge vene ostia, vena cava og cristae terminalis). Diffusjonsfarging under vakuum resulterte i kontrastforbedring i aortaroten og atrioventrikulære ventiler og diskrete områder av det fungerende myokardiet. Muskelfargingsforbedringen var begrenset til atrievedleggene og bakre vegger i både venstre og høyre atria (figur 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62909/62909fig01.jpg"> Figur 1: Mikro-avbildning av et lufttørket grisehjerte behandlet med PMA-kontrastmiddel ved diffusjon under vakuum. (A) Røntgenprojeksjonsbilde. (B) En overføringsprofil hentet fra den røde linjen i A. (C) Kortakseskive av ventriklene fra et tomografisk rekonstruert tredimensjonalt volum. Gule piler indikerer punkterte kontrastområder som tilskrives sub-endokardielle Purkinje-fibre. Blå piler indikerer vaskulatur. (D) Signalintensitetsfordeling av den rekonstruerte bildeskiven vist i C. LV: venstre ventrikel og RV: høyre ventrikel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62909/62909fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62909/62909fig02.jpg"> Figur 2: Validering av PMA-selektivitet for kollagen. (A) Massons trichromefarging av en transmural vevsseksjon fra ventriklene i et lufttørket hjerte. Myokardiet er farget i rødt og kollagen er vist med grønn fargestoffer. Tilstøtende vevsseksjoner (B) som ikke var i samsvar med farging eller (C) farget med PMA (1 %) ble avbildet med lysfeltbelysning for å vurdere fargens ensartethet. (D) Vevsseksjoner som ikke var til stede av farging eller (E) farget av PMA, ble avbildet ved fluorescerende mikroskopi. Panelene D' (heldekkende rød boks) og E' (stiplet rød boks) er forstørrede visninger av sub-epikardiet for uoppdagede og PMA-fargede seksjoner. Panelene D'' (heldekkende blå boks) og E'' (stiplet blå boks) er tilsvarende forstørrede visninger av sub-endokardiet og en frittgående Purkinje fiber. Piler angir områder med kollageninnhold. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62909/62909fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62909/62909fig03.jpg"> Figur 3: Perfusjonslasting av PMA før lufttørking og MicroCT-avbildning. (A) En kortakseskive av et rekonstruert bildevolum av ventriklene fra et grisehjerte. Blå piler indikerer vaskulatur. (B) Signalintensitetsfordelingen til bildestykket fra panel A. LV: venstre ventrikel og RV: høyre ventrikel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62909/62909fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62909/62909fig04.jpg"> Figur 4: MikroCT-avbildning av et sauehjerte som lider av kronisk hjerteinfarkt. (A) Det ble dannet et tett arr i den apikale regionen (se innsatt fotografi). En volumgjengivelse av det apikale området fra et endokardperspektiv ble tildelt fargelegging basert på bildeintensitet (rød som tilsvarer arrvev og myokardi i grønt). Ortogonale skiver av gråtoneintensiteten viser den tette arrfordelingen og grenser til overlevende myokard. Separasjon mellom fibrotisk vev og myokardium tilsvarer regioner av fettvev. (B) Et fotografi av en lufttørket ventrikulær kilepreparat fra en sau med apikal arrdannelse etter hjerteinfarkt. Skrå skiver av det rekonstruerte mikroCT-bildevolumet krysser ventriklene på mellomnivå mellom base og apex og proksimalt til stedet for (C) vaskulær okklusjon (C- rød linje i panel B), (D) peri-infarktområdet som grenser til tett arr og sunt myokardi (D- blå linje i panel B) og (E) en region med tett fibrose (E - grønn linje i B-panelet). (F') En utvidet visning av septalområdet som er omrisset av en rød stiplet boks i C. (D') En utvidet visning av det infarkterte området i høyre ventrikulær apex (blå stiplet boks i panel D). (E') En utvidet visning av det infarkterte området i venstre ventrikulær apex (grønn stiplet boks i panel E). LV: Venstre ventrikulært hulrom; RV: høyre ventrikulært hulrom; MB: moderatorbånd; Pap: papillær muskel. Gul pil indikerer venstre fremre synkende arterie. (F) Massons trichrome farging av en histologisk seksjon kuttet fra PMA-farget lufttørket venstre ventrikel. Kollagen er farget blått og myokardiet er farget rosa/fiolett. (G) En tilsvarende vevsdel av PMA-fargingsfordelingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62909/62909fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62909/62909fig05.jpg"> Figur 5: MikroCT-bilde av et sauehjerte etter kronisk indusert atrieflimmer. (A) En volumgjengivelse av atriene med fargelegging tildelt som i figur 4A. (B) Bi-atrial mikroCT-bildeskive i hjertets lange akse. Kortakseskiver ble ekstrahert på nivået av (C) atrioventrikulære ventiler (C- rød linje i panel B), (D) aortarot (D-blå linje i panel B) og (E) venstre atrietak (E- grønn linje inpanel B). LA: venstre atria; RA: rett atria; LAA: venstre atrievedheng; RAA: høyre atrievedlegg; LV: venstre ventrikel; RV: høyre ventrikel; LVOT: venstre ventrikulær utstrømningskanal; RVOT: høyre ventrikulær utstrømningskanal og PA: lungearterie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62909/62909fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Eksempel #</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Art</td>
			<td>Gris</td>
			<td>Gris</td>
			<td>Sau</td>
			<td>Sau</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kroppsvekt (kg)</td>
			<td>32.4</td>
			<td>31.2</td>
			<td>47.2</td>
			<td>53.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hjertevekt (g)</td>
			<td>191.2</td>
			<td>186.2</td>
			<td>202.4</td>
			<td>207.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>Patologi</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Kronisk MI</td>
			<td>Kronisk AF</td>
		</tr>
<tr>
<td>Prøvepreparering</td>
			<td>Hele hjertet</td>
			<td>Hele hjertet</td>
			<td>Kile av fremre hjerte</td>
			<td>Hele hjertet</td>
		</tr>
<tr>
<td>Innlasting av kontrastmodus</td>
			<td>Diffusjon</td>
			<td>Perfusjon</td>
			<td>Diffusjon</td>
			<td>Diffusjon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eksponering for kontrastmiddel (h)</td>
			<td>48</td>
			<td>24</td>
			<td>48</td>
			<td>48</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Hjerteprøver og behandling med kontrastmiddel.

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Preparation Techniques for Contrast-Enhanced Micro Computed Tomography Imaging of Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease at JoVE.com

Tissue Preparation Techniques for Contrast-Enhanced Micro Computed Tomography Imaging of Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease

Her presenterer vi en protokoll for å oppnå mikroberegnet tomografibilder med høy oppløsning av sunne og patologiske store pattedyr hele hjerter med kollagen-selektiv kontrastforbedring.

Vevsforberedelsesteknikker for kontrastforbedret mikroberegnet tomografiavbildning av store pattedyr hjertemodeller med kronisk sykdom

Structural remodeling is a common consequence of chronic pathological stresses imposed on the heart. Understanding the architectural and compositional ...

Denne protokollen gir mikrostrukturelt innsikt i strukturelle patologiske sykdommer i hele organskalaen ved hjelp av mikrodatamaskintomografi. I denne protokollen er en spesialisert vevsforberedelsesmetode implementert for å optimalisere høyoppløselig avbildning av hele hjerteprøver fra translasjonelle store pattedyrmodeller hos mennesker med selektiv kontrastforbedring av strukturelle sykdommer. Hjertemikrostrukturen som distribusjon av fibrose og organiseringen av det spennende myokardiet ligger til grunn for et bredt spekter av hjertesykdommer og setter scenen for den livstruende arytmien.Nestor Pallares-Lupon, postdoktor og ph.d.-utdannet for laboratoriet mitt, demonstrerer prosedyren. Til å begynne med, lag en kardiolegisk løsning som inneholder natrium heparin og lagre løsningen ved fire grader Celsius. Deretter forbereder du PBS/EDTA ved først å tilsette EDTA til en liter destillert vann for en 10 millimolar sluttkonsentrasjon.Deretter øker og vedlikeholder pH i oppløsningen ved 12 ved hjelp av natriumhydroksid for å oppløse EDTA. Når EDTA er fullstendig oppløst, senk pH til 7,4 ved hjelp av saltsyre. Tilsett deretter en foliepose med PBS for å få en 0,01 molarløsning med pH 7.4.Oppbevar den tilberedte løsningen ved romtemperatur. Til slutt, forberede en 1% etanol PMA kontrastmiddel løsning ved å legge 10 gram PMA til en liter absolutt etanol. Oppbevar den tilberedte løsningen ved romtemperatur.Forbered et en liter reservoar støttet 80 centimeter over en disseksjonsfat, og koble et termoplastisk rør til en dreneringsport i reservoaret. Fest en treveis kran til dreneringsslangen og koble ytterligere termoplastiske slanger til hver gratis port på treveiskranen. Fest toveiskraner til de frie endene av slangen.Fyll deretter reservoaret med den kardiolegerte løsningen supplert med heparin. Åpne kranene slik at den kardiolegere løsningen kan dreneres og fjerne alle luftbobler. Lukk deretter toveiskranene.Etter å ha hentet ut hjertet fra et euthanized dyr, plasser det i kald kardiolegisk løsning lagret på is til klar for disseksjon. Forbered deretter kanyle til venstre og høyre koronar osteo ved å kutte fem centimeter PTFE rør og varme den ene enden ved å plassere spissen ved siden av en åpen flamme. Når en millimeter av spissen begynner å smelte og blir gjennomsiktig, trykk spissen mot en hard varmebestandig overflate for å forme en ås på kanylespissen for å forhindre at kanylen glir ut av karene, og sett deretter inn en centimeter av den ikke-oppvarmede enden av hver kanyle i de to endene av dreneringsbeholderen.Deretter fjerner du aortakanylen og lokaliserer venstre og høyre osteo av koronararteriene under den kalde kardiooplegiske løsningen. Bruk spiss saks, separer forsiktig aortaroten fra det omkringliggende vevet over og under koronar osteo for å muliggjøre gjenging av en nullmåler silke sutur under koronarbeholderen. Åpne deretter toveiskranene og sett kanylespissene inn i koronar osteo.Med kanylespissene som strekker seg en til to centimeter inn i osteoen og utover suturplasseringen, binder du kanylen. Skyll deretter hjertet mens du forsiktig masserer ventriklene i 15 minutter til hjertet er ryddet for blod. Etter skylling, lukk toveiskranene, koble dem fra treveiskranen og overfør hjertet til en en liter plastkjemisk motstandsdyktig beholder som inneholder 500 milliliter PBS / EDTA-løsning.Omkranser PBS/EDTA-oppløsningen i termoplastslangen under en avtrekkshette ved hjelp av en peristaltisk pumpe med to kanaler. Prime pumpeslangen til slangen er fraværende av luftbobler. Deretter kan du lese hver koronararteriekanyle ved resirkulering ved romtemperatur i to timer ved 80 milliliter per minutt.Etter å ha sørget for at avtrekkshetten er i drift, stopp pumpen, tøm løsningen fra beholderen og erstatt den med 10% formalin for fiksering i en time ved 80 milliliter per minutt. Les hjertet ved hjelp av en rekke økende etanolkonsentrasjoner, som starter med 20% etanol i minst tre timer. Erstatt deretter 20% etanol med 30% etanol og perfuse i to timer.Fortsett perfusjonen ved å øke etanolkonsentrasjonen ved hver iterasjon med minimum perfusjon på en time ved hver konsentrasjon. For å forsterke hjertevevet før lufttørking, resirkulere en lik blanding av etanol og HMDS i 10 minutter etterfulgt av 100% HMDS i ytterligere to timer. Stopp perfusjonspumpen, koble deretter kanylen fra slangen og suspendere hjertet fra en aorta sutur inne i avtrekkshetten.Skyv forsiktig en glidelåslåspose over hjertet og lukk posetetningen over suturen for å redusere eksponeringen av hjertet for den sirkulerende luften. La hjertet tørke gjennom fordampning i en uke. For diffusjonslastingskontrastmidler, fjern posen.Vask hjertet i 100% etanol i 15 minutter med agitasjon før du nedsenker det i 100% etanol supplert med 1% PMA i 48 timer under vakuum, dekk deretter hjertet med en glidelåslåspose som vist tidligere og la den tørke. Monter det lufttørkede hjertet på en passende prøveholder. For å forhindre bevegelse under X-ray micro CT-målingene, bruk en klemme forankret til prøveholderen og fest hjertet via den tørkede og stive aortaen.Monter prøveholderen i micro CT-skanneren. Deretter åpner du programvaren og starter røntgenmikro-CT-systemet. Sett deretter røntgenfilteret aluminium til en millimeter.Røntgenkildespenning til 60 kilovolt og strøm til 120 mikroampere. I tillegg settes bildedimensjonene til 2 016 x 1 344 piksler og pikselstørrelse til 20 mikrometer. Speid røntgenoverføringsbilder langs lengden av støtten for å bestemme det totale bildefeltet i hjertets langsgående tilgang.For skanning, bruk et rotasjonstrinn på 0,18 grader, et bildegjennomsnitt på fem og en prøverotasjon på 180 grader ved å fjerne valget for et 360 graders oppkjøp. Velg forskyvningsmodus for å bilde hele bredden på prøvestøtten. Etter skanning, bruk programvaren for tomografisk rekonstruksjon av et isotropisk tredimensjonalt bildevolum.Til slutt rekonsekveringsprogramvare, bruk anskaffelsesrelatert artefaktkorrigering, inkludert stråleherdingseffekter på 10% og ringartefaktreduksjon på åtte. Deretter visualiserer du den rekonstruerte datastakken ved hjelp av Data Viewer-programvaren. Orienter prøven digitalt innenfor bildegrensene for å justere prøvene lange og korte akse med de tre prinsippete en akse i bildevolumet.Til slutt beskjærer du bildevolumet i alle tre aksene for å fjerne ytre bakgrunnslag i bildet og maksimalt redusere den totale bildestørrelsen. Røntgenoverføringsavbildning av lufttørkede grisehjerter viser store anatomiske landemerker, inkludert ventrikulære hulrom og muskelveggen. Tomografiske rekonstruksjoner av tredimensjonale bildevolumer viste tydelig separasjon mellom vev og bakgrunn ved epikardiale og endokardielle grenser.Masons trichrome farging viste kollagen positiv farging på epitel- og endotellagene paravaskulært i det sub-epikardiale vevet. Lysfeltbelysning viste mørkere fargelegging i kollagenøse strukturer etter PMA-farging, som støtter preferanseakkumulering av PMA. PMA fargede fluorescerende bilder av ventrikulære vevsseksjoner hadde PMA indusert tap av fluorescens på steder av kollagen.Der en hjerteprøve farget med et kontrastmiddel via perfusjon før lufttørking, viste bilderekonstruksjonen svært klumpete flekker i myokardrommet. Videre viste vev med lav kontrast dårlig separasjon fra bakgrunnsintensiteten. Mikro CT-avbildning av en sauedel som lider av kronisk hjerteinfarkt, avslørte en sentral tett fibrotisk lesjon omgitt av en løs og heterogen grensesone.De største signalintensitetene av rekonstruerte bildevolumer ved vevsgrensene og arrområdene vises her. Kontrastmidler farget dårlig det sunne myokardiet, men mikrostrukturell kontrast ble beholdt. Ved grensesonen ble arrvev ispedd overlevende myokard.Tett fibrose dukket opp transmural, men teksturert som indikerer varianser i sammensetningen. Transmural venstre ventrikulær region av PMA farget vev forberedelse viste selektiv farging for kollagen og ingen farging i områder med overlevende myokardi. Lengre perfusjonstider ved bruk av etanol anbefales for å sikre fullstendig utveksling av hjertets vanninnhold med etanol.Interaksjoner mellom HMDS og vannet produserer varme, noe som kan skade prøven. En sterk fordel med denne prosedyren er evnen til å validere mikro-CT-avbildning ved hjelp av histologi. Lufttørkede prøver kan bygges direkte inn i parafin for seksjonering av farging og mikroskoping av avbildning.

Research

JoVE Journal

Medicine

Contrast Enhanced Vessel Imaging using MicroCT

Microscopic computed tomography (microCT) offers high-resolution volumetric imaging of the anatomy of living small animals. However, the contrast between ...

Segmentation and Measurement of Fat Volumes in Murine Obesity Models Using X-ray Computed Tomography

Segmentering og Måling av fett Volumene i murine Fedme modeller med X-ray Datatomografiscanning

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are ...

Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging

Retrograd perfusjon og Fylling av Mouse Coronary blodkar som forberedelse for Micro Datatomografiscanning Imaging

Visualization of the vasculature is becoming increasingly important for understanding many different disease states. While several techniques exist for ...

Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

Osmotisk Drug Delivery til iskemisk bakbena og perfusjon av blodkar med Microfil for Micro-CT Imaging

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Vurdering av Livskraftig of Human Fat Injeksjon i Nude Mus med Micro-Datatomografiscanning

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

Kombinert Nær-infrarød Fluorescent Imaging og Micro-computertomografi for Direkte Visualisering Cerebral tromboemboli

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

Cardiac Magnetic Resonance for the Evaluation of Suspected Cardiac Thrombus: Conventional and Emerging Techniques

CARDIAC magnetisk resonans for evaluering av mistenkte CARDIAC Trombe: konvensjonelle og Emerging teknikker

We present the conventional cardiac magnetic resonance (CMR) protocol for evaluating a suspected thrombus and highlight emerging techniques.&#160;The ...

DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis

KANAL: Dobbel harpiksstøping etterfulgt av mikro-beregnet tomografi for 3D leveranalyse

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the ...

Sample Preparation for Computed Tomography-based Three-dimensional Visualization of Murine Hind-limb Vessels

Prøvepreparering for beregnet tomografibasert tredimensjonal visualisering av Murine Hind-limb-kar

Blood vessels are complex networks with tree-like structures, and vascular networks are essential for maintaining both circulation and maintaining organ ...

Four-Dimensional Computed Tomography-Guided Valve Sizing for Transcatheter Pulmonary Valve Replacement

Firedimensjonal beregnet tomografistyrt ventilstørrelse for utskifting av transkateterpulmonalventil

The measurements of the right ventricle (RV) and pulmonary artery (PA), for selecting the optimal prosthesis size for transcatheter pulmonary valve ...