Name: tissue preparation techniques for contrast-enhanced micro computed tomography imaging of large mammalian cardiac models with chronic disease
Uploaded: 2022-02-08T14:00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Preparation Techniques for Contrast-Enhanced Micro Computed Tomography Imaging of Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease at JoVE.com

Это исследование получило финансовую поддержку от правительства Франции в рамках программы «Инвестиции будущего», управляемой Национальным исследовательским агентством (ANR), грантовой ссылкой ANR-10-IAHU-04 и Фондом Leducq (сеть RHYTHM), а также грантовую ссылку ANR-17-CE14-0029-01 [UNMASC], финансирование от Европейского исследовательского центра в области сердечно-сосудистых заболеваний (ERA-CVD), ссылку на грант H2020-HCO-2015_680969 [MultiFib] и финансирование из французского региона Новая Аквитания, рекомендации гранта 2016 - 1R 30113 0000 7550/2016-1R 30113 0000 7553 и ANR-19-ECVD-0006-01.

Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами Директивы 2010/63/ЕС Европейского парламента о защите животных, используемых в научных целях. Протоколы для животных были одобрены местным этическим комитетом (CEEA50) в Университете Бордо. Сердца были получены из трех моделей крупных млекопитающих, включая (i) здоровых крупных белых свиней (N = 2, 2 месяца); (ii) Овцы (N = 1, 2 года) с индуцированным инфарктом миокарда13 и (iii) Овцы (N = 1, 7 лет) с индуцированной фибрилляцией предсердий30.
1. Приготовление раствора:
<ol><li>Кардиоплегический раствор: Приготовить 3 л дистиллированной воды и добавить хлорид натрия (110 мМ), хлорид калия (16 мМ), бикарбонат натрия (10 мМ), D-(+)-глюкозу (9 мМ), раствор хлорида кальция (1,2 мМ) и раствор хлорида магния (16 мМ). В конце добавляют 500 мкл/л гепарина натрия. Сохраняют этот раствор при 4 °C.</li>
	<li>Фосфатно-буферный физиологический раствор - раствор ЭДТА (PBS-EDTA).<ol>
<li>Сначала добавляют этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) к 1 л дистиллированной воды для конечной концентрации 10 мМ. Увеличивают и поддерживают рН раствора 12 с помощью раствора гидроксида натрия (1 М) для растворения ЭДТА.</li>
		<li>Как только ЭДТА полностью растворится, понизьте рН до 7,4 с помощью соляной кислоты. Добавьте один фольгированный мешочек с фосфатно-буферным физиологическим раствором для получения раствора при 0,01 М (хлорид натрия, 0,138 М; калия хлорид, 0,0027 М) и рН 7,4. Сохраняют этот раствор при комнатной температуре (RT).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Этанол - раствор контрастного вещества фосфомолибдовой кислоты (PMA): Готовят 1 л абсолютного этанола и добавляют PMA для получения раствора в 1% концентрации. Сохраните это решение в RT.</li>
</ol>2. Источник ткани
<ol><li>Усыплите животное и извлеките сердце в соответствии с местными этическими принципами. Быстро погружайте сердце в холодный кардиоплегический раствор и нежно массируйте желудочки для первоначального полоскания.</li>
	<li>Убедитесь, что аорта разрезается ниже дуги аорты и зажимается две стороны артериальной стенки с помощью держателей игл.</li>
	<li>Подвешивая сердце держателями игл, вставьте канюлю аорты в корень аорты, заботясь о том, чтобы не вступать в контакт или выступать через аортальные клапаны. Оберните швом 0 калибра вокруг дуги аорты на уровне канюли и прочно завяжите канюлю на месте.</li>
	<li>Используя шприцы 50 мл, вводят 200 мл холодного (4 °C) кардиоплегического раствора. Удалите избыток крови, скапливающейся в полостях, опрокинув сердце на заднюю сторону, чтобы слиться через легочные вены.</li>
	<li>Погрузить промытое сердце и держать в холодном кардиоплегическом растворе, хранящемся на льду до готовности к рассечению.</li>
</ol>3. Тканевая подготовка:
<ol><li>Приготовьте резервуар объемом 1 л, поддерживаемый на 80 см выше тарелки для рассечения. Соедините термопластичную трубку длиной 80 см и внутренним диаметром 3,2 мм и внешним диаметром 4,8 мм с дренажным отверстием резервуара.</li>
	<li>Прикрепите трехсторонний кран к дренажной трубке и соедините дополнительные термопластичные трубки (20 см, внутренний диаметр 1,6 мм и внешний диаметр 3,2 мм) с каждым свободным портом на трехстороннем кране. Закрепите двухходовые краны на платных концах трубки.</li>
	<li>Заполните резервуар кардиоплегическим раствором, дополненным гепарином (2500 ЕД). Откройте краны, чтобы позволить кардиоплегическому раствору стечь и удалить все пузырьки воздуха, затем закройте двухсторонние краны.</li>
	<li>Подготовьте канюли для левой и правой коронарной остии с использованием трубки из политетрафторэтилена (PTFE) (внутренний диаметр 1 мм и наружный диаметр 2 мм).<ol>
<li>Отрежьте 5 см трубки и нагрейте один конец, поместив наконечник рядом с голым пламенем. Как только 1 мм наконечника начнет плавиться и станет полупрозрачным, прижмите наконечник к твердой термостойкой поверхности, чтобы сформировать гребень на кончике канюли, чтобы предотвратить выскальзывание канюль из сосудов.</li>
		<li>Вставьте 1 см ненагретого конца каждой канюли в два конца дренажной трубки дренажного резервуара.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Удалить канюлю аорты. Под холодным кардиоплегическим раствором локализуют левую и правую остии коронарных артерий.</li>
	<li>Используя заостренные ножницы, тщательно отделите корень аорты от окружающих тканей выше и ниже коронарной остии, чтобы обеспечить резьбу шелкового шва 0 г под коронарным сосудом.</li>
	<li>Откройте двухсторонние краны и вставьте кончики канюль в коронарную остию. Кончиками канюль, простирающимися на 1-2 см в остию и за пределы размещения шва, завяжите канюли.</li>
	<li>Промывайте сердце, нежно массируя желудочки в течение 15 минут, пока сердце не очистится от крови.</li>
	<li>После полоскания закройте двухсторонние краны и отсоедините их от трехстороннего крана. Переложите сердце в пластиковый химически стойкий контейнер объемом 1 л, содержащий 500 мл раствора PBS-EDTA.</li>
	<li>Рециркулируют раствор PBS-EDTA в термопластичной трубке под вытяжной вытяжкой с помощью перистальтического насоса с двумя каналами. Загрунтуйте насосную трубку до тех пор, пока в трубке не отсутствуют пузырьки воздуха, затем перфьюируйте каждую канюлю коронарной артерии путем рециркуляции при РТ в течение 2 ч при 80 мл/мин.</li>
	<li>Убедитесь, что вытяжной шкаф работоспособен. Остановите насос, слейте раствор из емкости и замените его формалином (10%) для фиксации на 1 ч при РТ при 80 мл/мин.</li>
	<li>Замените раствор формалина PBS, чтобы промыть фиксатор три раза в течение 15 мин каждый при 80 мл/мин.</li>
</ol>4. Обезвоживание и сушка тканей:
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ту же скорость перфузии (80 мл / мин) и дайте ткани оставаться на RT на протяжении всего времени.
<ol><li>Заменить раствор PBS этанолом на 20%, разбавленным в сверхчистой воде, и перфузить в течение минимум 3 ч.</li>
	<li>Перфузируйте сердце, используя серию увеличивающихся концентраций этанола.<ol>
<li>Начинают с замены 20% раствора этанола на этанол, разбавленный до 30% и перфузируют в течение 2 ч.</li>
		<li>Повторите перфузию путем увеличения концентрации этанола на каждой итерации через 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 95%, 90%, 95%, 99% и 100% в течение минимальной продолжительности 1 ч на каждой стадии (концентрация). ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы сердца могут отдыхать без перфузионного потока в течение ночи при любом разбавлении этанола, если для этой концентрации произошла минимальная перфузия в течение 15 минут.</li>
	</ol>
</li>
	<li>НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: При применении контрастных веществ посредством перфузии перфузии нанесите на сердце 100% этанол, дополненный контрастным веществом PMA, 1% в течение 48 ч. Промыть контрастное вещество перфузией 100% этанолом в течение 2 ч.</li>
	<li>Чтобы укрепить сердечную ткань перед высыханием на воздухе, рециркулируйте смесь этанола и гексаметилдисилазана (HMDS) 50:50 в течение 10 минут. Следуйте этому 100% HMDS в течение еще 2 ч. ВНИМАНИЕ: HMDS является высокотоксичным и вредным веществом. Сильный запах аммиака выделяется при контакте с воздухом. Кроме того, жидкая форма HMDS является высоколетучей и катализируется йодсодержащими агентами.</li>
	<li>Отсоедините канюли от трубки и подвешивайте сердце от аортального шва внутри вытяжного капюшона.</li>
	<li>Осторожно проведите пакетом-молнией над сердцем и закройте уплотнитель пакета поверх шва, чтобы уменьшить воздействие циркулирующего воздуха на сердце. Дайте сердцу высохнуть путем испарения в течение 1 недели.</li>
	<li>ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Для диффузионно-нагружающих контрастных веществ промывайте сердце 100% этанолом в течение 15 минут во время перемешивания. Погрузите сердце в 100% этанол, дополненный ПМА, 1%, в течение 48 ч под вакуумом. Повторите шаг 4.6.</li>
</ol>5. МикроКТ:
ПРИМЕЧАНИЕ: Настольная рентгеновская система микроКТ использовалась для визуализации сердец свиней.
<ol><li>Установите высушенное на воздухе сердце на соответствующий держатель для образцов. Предотвратите любое движение во время рентгеновских измерений микроКТ с помощью зажима, закрепленного на держателе образца, и закрепите сердце через высушенную и жесткую аорту.</li>
	<li>Тщательно выровняйте центр образца сердца вдоль его продольной оси с центром поля зрения изображения для углов поворота 0° и 90°. Чтобы достичь этого во всех направлениях, подвешивайте сердце в воздухе с помощью аортального зажима, закрепленного на опоре образца.</li>
	<li>После открытия программного обеспечения и запуска системы X-ray microCT примените рентгеновский фильтр алюминий, 1 мм, напряжение источника рентгеновского излучения до 60 кВ и ток до 120 мкА. Установите размеры изображения на 2016 x 1344 пикселей и размер пикселя на 20 мкм.</li>
	<li>Вытащите держатель образца из поля зрения и откалибруйте фоновое изображение и время экспозиции рентгеновского излучения, получив коррекцию плоского поля. Убедитесь, что средняя фоновая рентгеновская передача превышает 80%.</li>
	<li>Разведчик рентгеновских снимков пропускания по длине опоры для определения общего поля визуализации в продольной оси сердца. Для сканирования используйте шаг поворота 0,18°, среднее значение кадра 5 и поворот образца на 180°. Выберите режим сканирования со смещением, чтобы получить изображение полной ширины поддержки образца. ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры получения, указанные в этом разделе, были выбраны для оптимизации качества изображения ансамблевой композиции сердца.</li>
	<li>После сканирования используйте программное обеспечение для томографической реконструкции изотропного трехмерного объема изображения. Для применения программного обеспечения NRecon используйте коррекцию артефактов, связанную с приобретением, включая эффекты упрочнения луча на 10% и уменьшение кольцевых артефактов 8.</li>
	<li>Чтобы оптимизировать ограничения хранения данных, примените минимальную интересующую прямоугольную область, которая включает в себя вокселы изображений для конкретного сердца. Экспортируйте изображения в 8-битном растровом формате в виде стека изображений.</li>
	<li>Визуализируйте реконструированный стек данных с помощью программного обеспечения DataViewer. Цифровая ориентация образца в границах изображения, чтобы выровнять длинную и короткую оси образца с тремя основными осями объема изображения.</li>
	<li>Обрежьте объем изображения по всем трем осям, чтобы удалить внешние фоновые слои изображения, чтобы максимально уменьшить общий размер изображения.</li>
</ol>

Никакой

Подробный протокол для крупных тканевых препаратов изложен с использованием целых сердец крупных млекопитающих для последующей структурной визуализации с высоким разрешением. Подход воздушной сушки устранил влияние фонового затухания рентгеновского излучения и максимально оптимизировал ткани: фоновый контраст29. Используя этот подход, было достигнуто изотропное разрешение в диапазоне 20 мкм для объемной визуализации образцов диаметром до 7,2 см. МикроКТ мягких тканей, однако, обычно полагается на использование неспецифических контрастных веществ для улучшения поглощения рентгеновских лучей и чувствительности системмикроКТ 34. Хотя рентгеноконтрастные вещества улучшают общее ослабление рентгеновского излучения и улучшение визуализации мягких тканей, разделение компонентов тканей на основе биохимического состава остается сложной задачей. Однако было замечено, что при использовании высушенных на воздухе сердец в сочетании с обычным рентгеноконтрастным веществом в лабораторных условиях ПМА избирательно окрашивают внеклеточные компоненты. Соединительная ткань, связанная со здоровым миокардом и патологическим структурным ремоделированием при хронических заболеваниях, была усилена.
Процесс воздушной сушки биологической ткани требует вмешательства, чтобы противостоять деформации образца. Пробоподготовка для электронной микроскопии имеет аналогичные требования. Как правило, используется метод сушки с критической точкой, который использует баланс тканевой иммерсионной среды, температуры и давления для устранения поверхностного натяжения жидкого содержимого ткани, что вызывает деформацию на молекулярном уровне при испарении35. Такой подход требует равномерной замены содержания воды в образце жидким углекислым газом, который более надежен в небольших и легко диффузируемых образцах. Альтернативно, структурная целостность ткани может быть улучшена и воздушная сушка, т.е. фаза испарения может быть применена в течение более длительного периода для уменьшения общей деформации. Молекула HMDS подвергается силилированию с образованием каркаса на основе силикона для укрепления и стабилизации молекулярной организации образцаткани 36. Испарение дополнительно продлевается за счет ограничения циркулирующих воздушных потоков из окружающей среды, а также во избежание неоднородного испарения, особенно между поверхностью образца и внутренними слоями.
Многочисленные контрастные вещества ранее использовались для микроКТ-визуализации мягких тканей. Наиболее распространенными являются йод, фосфовольфрамовая кислота (PTA) и PMA. Йод, в частности, был использован из-за более высокой скорости диффузии 34,37,38. Тем не менее, йод действует как катализатор силилирования реагента HMDS36. Катализируемая реакция является агрессивной и экзотермической, с высоким риском разрушения образца и риском безопасности, если остаточная HMDS остается из-за неполного высыхания образца. Как PTA, так и PMA, растворенные в этаноле, можно безопасно использовать в сочетании с HMDS. Было показано, что PTA и PMA обеспечивают большую разрешающую способность тонких структур в неминерализованных межпозвоночных дисках по сравнению с окрашиванием йодом38. В микроКТ-визуализации образцов млекопитающих PTA и PMA использовались для окрашивания эмбрионов мыши39, сердечно-сосудистой системы мыши37, мышцы и мозга кролика40 и свиных вен41. PTA имеет более высокую молекулярную массу и плотность в растворе, чем PMA. Отчасти это связано с более высокой атомной массой вольфрама (атомный номер 74 г/моль), основного ослабляющего элемента в ПТА. Для сравнения, самый тяжелый элемент в PMA, молибден, имеет атомный номер 42 г/ моль. Как атомная масса, так и плотность образца лежат в основе затухания рентгеновского излучения, в дополнение к толщине образца42. Увеличивая длину рентгеновского пути за счет увеличения размеров выборки, затухание рентгеновского излучения становится более чувствительным к увеличению плотности образца. Поэтому контрастное вещество PMA более низкой плотности было выбрано для снижения риска чрезмерного затухания и оптимизации динамического диапазона контрастности изображения для сердец человеческого масштаба. Дополнительные данные показали, что диффузионная нагрузка PMA дает более однородное окрашивание, чем для более крупной молекулы PTA в сердечной ткани43.
Способ доставки контрастного вещества влияет на равномерность распределения контрастного вещества в сердечной ткани (рисунок 3). Перфузия контрастных веществ в обезвоженном этанолом сердце показала пятнистые фоновые уровни окрашивания PMA из-за переменного сосудистого сопротивления. В высушенном воздухом сердце мышечная ламинарная структура подчеркивается процессом высыхания образца, увеличивая ламинарное разделение мышц. Это в конечном итоге улучшило общую проницаемость ткани для диффузионной нагрузки контрастных веществ. Следовательно, воздушная сушка облегчает ткани: воздушный контраст на ламинарном и внутриламинарном уровнях (рисунок 4). Кроме того, диффузионное нагружение может быть дополнительно облегчено применением под вакуумом. Далее было показано, что усадка тканей невысушенных образцов зависит от концентрации контрастного вещества40. Однако предшествующая морфологическая стабилизация образца путем воздушной сушки ингибирует эффекты усадкитканей 29.
МикроКТ-изображения целых органов с высоким разрешением по своей сути создают большие объемы данных. Характер методов томографической визуализации позволяет визуализировать и обрабатывать изображения посрезов, что облегчает компьютерную обработку и нагрузку на память. Однако для визуализации стеков трехмерных изображений, например, для рендеринга томов образцов в трехмерных представлениях, рекомендуемыми минимальными характеристиками компьютера являются 128 ГБ ОЗУ и скорость процессора 3 ГГц. Твердотельные жесткие диски также значительно улучшили передачу данных.
Появление микроКТ-визуализации в сердечной области дает многочисленные преимущества для трансляционных исследований и клинической валидации. Преимущества его трехмерной и микрометрической визуализации уже показали применения при определении тромботической нагрузки на ST-повышение уровня ишемии миокардау больных 44,45. Картирование потенциальных источников аритмии у пациентов со структурными заболеваниями сердца во многом зависит от определения распределения фиброзной рубцовой ткани и локализации переплетения следов выжившего миокарда. Подходы второй линии для диагностики желудочковых аритмий используют магнитно-резонансную томографию46. Он может надежно локализовать плотный фиброз, но ограничен морфологической характеристикой низкого разрешения и дает ограниченное представление о микроструктурном ремоделировании и диффузном распределении фиброзных поражений47. Исследование распределения и характеристики рубцов с высоким разрешением имеет огромный потенциал для улучшения нашего понимания структурного ремоделирования сердца и риска развития сердечной недостаточности. В частности, фундаментальные исследования или посмертные исследования выиграют от подтверждающих структурных изображений для электрического картирования сердечной аритмии.
В заключение, сердца, усиленные обработкой HMDS и сушкой на воздухе, могут быть впоследствии окрашены рентгеновским контрастным веществом для усиления рентгеновского ослабления внеклеточных компонентов. В частности, в здоровом миокарде накопление ПМА происходит в эпителии, клапанной ткани и компартментах желудочковой проводящей системы, обшитой соединительной тканью, что приводит к усиленному ослаблению рентгеновского затухания. Кроме того, в структурно больном миокарде усиленный контраст был дополнительно селективным для фиброза.

Структурные заболевания сердца составляют большую часть смертности, связанной с сердцем, во всем мире1. Ремоделирование структуры сердца влияет на среду миокарда и интерстициальное пространство. Поскольку как электрическая, так и механическая функция сердца зависит от организации миоцитов, нарушение может привести к невыносимой сердечной аритмии, нарушению перекачивания крови исердечной недостаточности 2,3,4,5,6,7,8,9. Развитие лечебной терапии структурных заболеваний сердца намного перевешивает распространенность заболевания 2,5. Таким образом, появляется все большее число доклинических моделей структурных сердечных заболеваний, чтобы лучше понять анатомо-морфологические профили и результирующий патогенез сердечных аритмий 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22,23. По всему спектру структурных заболеваний наблюдается повышение регуляции интерстициального фиброза и, чаще в случаях, связанных с ишемией, замещение миокарда фиброзом и жировойтканью 18. Морфологическое понимание патологических внеклеточных компонентов может позволить выявить потенциальные субстраты аритмии. Распространение и степень заболевания обеспечивают сильные показатели аритмогенного риска. Тем не менее, остаются проблемы для всестороннего изображения профилей заболеваний путем интеграции макро- и микромасштабов в интактном сердце.
Микрокомпьютерная томография (микроКТ), основанная на рентгеновских лучах, становится мощным инструментом для исследования микроструктуры мягких биологических тканей с использованием контрастных веществ. Получены высокодетализированные анатомические карты для сердец мелких грызунов 24,25,26 и небольших рассеченных образцов из сердец крупных млекопитающих 27,28. Тем не менее, визуализация на уровне всего органа крупных сердец млекопитающих представляет чрезмерную длину пути, по которой рентгеновские фотоны ослабляются с использованием обычных методов подготовки тканей. Это включает в себя контрастную загрузку ткани и погружение образца в растворитель контрастного вещества во время приобретения. Увеличение размера выборки и разрешения приводит к увеличению общего времени сбора. Поэтому стабильность тканей становится решающей для реконструкции полезного изображения, а это означает, что деформация ткани в результате высыхания должна быть предотвращена. Использование погружной жидкости, однако, имеет недостатки: (i) общая интенсивность фонового сигнала становится незначимой и (ii) способствует разбавлению связанных с тканью контрастных молекул. Оба эти фактора способствуют снижению контрастности изображения.
В этом исследовании подробно описывается новый конвейер обработки тканей для облегчения фонового ослабления фотонов и оптимизации динамического диапазона, обеспечиваемого контрастными агентами. Предлагается использовать подход воздушной сушки тканей с химическим подкреплением тканей для ограничения деформациитканей 29. Поэтому образцы тканей могут оставаться стабильными в воздухе для длительных приобретений и опускать фоновые вклады от погружных жидкостей. Этот методологический конвейер обеспечивает: i) комплексный протокол обработки и визуализации тканей, оптимизированный с использованием целых свиных сердец; (ii) оценка методов концентрации контраста и нагрузки и (iii) применение этого конвейера в двух различных моделях хронических заболеваний фибрилляции предсердий и инфаркта миокарда в сердцах овец. Разработка моделей хронических заболеваний была описана в другом месте для каждой модели хронического сердечного заболевания, инфаркта миокарда, индуцированного чрескожной эмболизацией коронарной артерии13 и самоподдерживающейся фибрилляции предсердий30.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin</td>
			<td>Diapath</td>
			<td>F0043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride solution</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>21114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Canulation Tubing PTFE</td>
			<td>VWR</td>
			<td>DENE3400102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Head 1L Reservoir</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>50-0496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>796881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium (5000 U/mL)</td>
			<td>Panpharma</td>
			<td>3400891287301.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>440191-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, ACS reagent, 37%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>63020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphomolybdic acid hydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>417895000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Tubing, 3-Stop</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>FV-96328-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SkyScan, 1276</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>micro CT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution 50% in H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>415413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Connector Kits</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-1407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM 1089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Tygon R-3603 1.6 mm 3.2 mm 0.8 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>228-1279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Tygon R-3603 3.2 mm 4.8 mm 0.8 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>228-1283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-part single-use syringes 50 mL</td>
			<td>Norm-Ject</td>
			<td>4850001000</td>
			<td>Pyrogen-free, PVC-free</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue preparation techniques for contrast-enhanced micro computed tomography imaging of large mammalian cardiac models with chronic disease

Структурное ремоделирование является распространенным следствием хронических патологических нагрузок, налагаемых на сердце. Понимание архитектурных и композиционных свойств пораженных тканей имеет решающее значение для определения их взаимодействия с аритмическим поведением. Микромасштабное ремоделирование тканей, ниже клинического разрешения, становится важным источником летальной аритмии с высокой распространенностью у молодых людей. Сохраняются проблемы с получением высокой контрастности изображения при достаточном микромасштабном разрешении для доклинических моделей, таких как целые сердца крупных млекопитающих. Кроме того, селективное контрастное усиление состава тканей для трехмерной визуализации с высоким разрешением по-прежнему отсутствует. Неразрушающая визуализация с использованием микрокомпьютерной томографии показывает перспективность для визуализации с высоким разрешением. Цель состояла в том, чтобы облегчить страдания от чрезмерного затухания рентгеновского излучения в больших биологических образцах. Сердца были извлечены из здоровых свиней (N = 2) и овец (N = 2) с либо индуцированным хроническим инфарктом миокарда и образованием фиброзных рубцов, либо с индуцированной хронической фибрилляцией предсердий. Иссеченные сердца перфузировали: солевым раствором, дополненным закалывающим агентом и ионами кальция и сосудорасширяющим средством, этанолом при серийном обезвоживании и гексаметилдисилизаном в вакууме. Последний укреплял структуру сердца во время воздушной сушки в течение 1 недели. Коллаген-доминантная ткань была избирательно связана рентгеновским контрастным агентом, фосфомолибдовой кислотой. Конформация тканей была стабильной в воздухе, что позволяло проводить длительные микрокомпьютерные томографии для получения изображений с высоким разрешением (изотропные 20,7 мкм). Оптимальная нагрузка контрастного вещества диффузией показала селективное контрастное усиление эпителиального слоя и субэндокардиальных волокон Пуркинье в здоровых желудочках свиней. Фибрилляция предсердий (ФП) сердца показала усиленное накопление контраста в задних стенках и придатках предсердий, что объясняется большим содержанием коллагена. Инфаркт миокарда сердца показал повышенный контраст избирательно в областях сердечного фиброза, что позволило идентифицировать переплетение выживших мышечных волокон миокарда. Контрастно-усиленные препараты для высушенных на воздухе тканей позволили получить микромасштабную визуализацию неповрежденного сердца крупного млекопитающего и селективное контрастное усиление основных компонентов заболевания.

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Preparation Techniques for Contrast-Enhanced Micro Computed Tomography Imaging of Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease at JoVE.com

Tissue Preparation Techniques for Contrast-Enhanced Micro Computed Tomography Imaging of Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease

Здесь мы представляем протокол получения микрокомпьютерных томографических изображений высокого разрешения здоровых и патологических целых сердец крупных млекопитающих с коллаген-селективным контрастным усилением.

Методы подготовки тканей для контрастно-усиленной микрокомпьютерной томографии моделей сердца крупных млекопитающих с хроническими заболеваниями

Structural remodeling is a common consequence of chronic pathological stresses imposed on the heart. Understanding the architectural and compositional ...

Этот протокол обеспечивает микроструктурное понимание структурных патологических заболеваний во всем масштабе органа с помощью микрокомпьютерной томографии. В этом протоколе реализован специализированный метод подготовки тканей для оптимизации визуализации с высоким разрешением образцов всего сердца из трансляционных моделей крупных млекопитающих у людей с селективным контрастным усилением структурных заболеваний. Сердечная микроструктура, такая как распределение фиброза и организация возбудимого миокарда, лежит в основе широкого спектра сердечных заболеваний и создает сцену для угрожающей жизни аритмии.Продемонстрировать процедуру будет Нестор Палларес-Лупон, постдок и аспирант моей лаборатории. Для начала приготовьте кардиоплегический раствор, содержащий гепарин натрия и храните раствор при четырех градусах Цельсия. Затем приготовьте PBS/EDTA, сначала добавив ЭДТА к одному литру дистиллированной воды для конечной концентрации 10 миллимоляров.Затем увеличивают и поддерживают рН раствора на уровне 12, используя гидроксид натрия для растворения ЭДТА. Как только ЭДТА полностью растворится, понизьте рН до 7,4 с помощью соляной кислоты. Затем добавляют один фольгированный мешочек PBS для получения молярного раствора 0,01 с рН 7,4.Хранить приготовленный раствор при комнатной температуре. Наконец, приготовьте 1%-ный раствор этанолового контрастного вещества PMA, добавив 10 грамм PMA к одному литру абсолютного этанола. Хранить приготовленный раствор при комнатной температуре.Подготовьте литровый резервуар, поддерживаемый на 80 сантиметров выше тарелки для рассечения, и соедините термопластичную трубку с дренажным отверстием резервуара. Закрепите трехсторонний кран к дренажной трубке и соедините дополнительные термопластичные трубки с каждым свободным портом на трехстороннем кране. Закрепите двухходовые краны на свободных концах трубки.Далее заполните резервуар кардиоплегическим раствором, дополненным гепарином. Откройте краны, чтобы кардиоплегический раствор слился, удалив все пузырьки воздуха. Затем закройте двухсторонние краны.После извлечения сердца из усыпленного животного поместите его в холодный кардиоплегический раствор, хранящийся на льду до готовности к рассечению. Затем подготовьте канюлю для левого и правого коронарного остео, разрезав пять сантиметров трубки из PTFE и нагрев один конец, поместив наконечник рядом с голым пламенем. Как только один миллиметр наконечника начнет плавиться и станет полупрозрачным, прижмите наконечник к жесткой термостойкой поверхности, чтобы сформировать гребень на кончике канюли, чтобы предотвратить выскальзывание канюли из сосудов, затем вставьте один сантиметр ненагретого конца каждой канюли в два конца дренажной трубки дренажного резервуара.Далее удаляют канюлю аорты и локализуют левый и правый остео коронарных артерий под холодным кардиоплегическим раствором. Используя заостренные ножницы, тщательно отделите корень аорты от окружающих тканей выше и ниже коронарного остео, чтобы обеспечить резьбу шелкового шва нулевого калибра под коронарным сосудом. Затем откройте двухсторонние краны и вставьте кончики канюли в коронарную остео.Когда кончики канюли простираются на один-два сантиметра в остео и за пределы размещения шва, свяжите канюлю. Затем промойте сердце, нежно массируя желудочки в течение 15 минут, пока сердце не очистится от крови. После промывки закройте двухходовые краны, отсоедините их от трехходового крана и перенесите сердце в литровый пластиковый химически стойкий контейнер, содержащий 500 миллилитров раствора PBS/EDTA.Рециркулируйте раствор PBS/EDTA в термопластичной трубке под вытяжным колпаком с помощью перистальтического насоса с двумя каналами. Загрунтуйте насосную трубку до тех пор, пока в трубке не отсутствуют пузырьки воздуха. Затем просмотрите каждую канюлю коронарной артерии путем рециркуляции при комнатной температуре в течение двух часов со скоростью 80 миллилитров в минуту.Убедившись, что вытяжной шкаф работоспособен, остановите насос, слейте раствор из контейнера и замените его 10%-ным формалином для фиксации в течение одного часа со скоростью 80 миллилитров в минуту. Просмотрите сердце, используя серию увеличивающихся концентраций этанола, начиная с 20% этанола в течение как минимум трех часов. Затем замените 20%-ный этанол на 30%-ный этанол и перфуйте в течение двух часов.Продолжайте перфузию, увеличивая концентрацию этанола на каждой итерации с минимальной перфузией в один час при каждой концентрации. Чтобы укрепить сердечную ткань перед высыханием на воздухе, рециркулируйте равную смесь этанола и HMDS в течение 10 минут, а затем 100% HMDS в течение еще двух часов. Остановите перфузионный насос, затем отсоедините канюлю от трубки и подвешивайте сердце от аортального шва внутри вытяжного капота.Осторожно проведите мешком-молнией по сердцу и закройте уплотнитель пакета поверх шва, чтобы уменьшить воздействие на сердце циркулирующего воздуха. Дайте сердцу высохнуть путем испарения в течение одной недели. Для диффузионной загрузки контрастных веществ снимите мешок.Промыть сердце 100% этанолом в течение 15 минут с перемешиванием, прежде чем погрузить его в 100% этанол, дополненный 1% PMA в течение 48 часов под вакуумом, затем накройте сердце мешком на молнии, как показано ранее, и дайте ему высохнуть. Установите высушенное на воздухе сердце на соответствующий держатель для образцов. Чтобы предотвратить любое движение во время рентгеновских микро-КТ-измерений, используйте зажим, закрепленный на держателе образца, и закрепите сердце через высушенную и жесткую аорту.Установите держатель образца в микро-компьютерный томограф. Затем откройте программное обеспечение и запустите рентгеновскую систему микроКТ. Затем установите рентгеновский фильтр алюминиевой на один миллиметр.Напряжение источника рентгеновского излучения до 60 киловольт и ток до 120 микроампер. Кроме того, задайте размеры изображения 2 016 на 1 344 пикселя, а размер пикселя — 20 микрометров. Разведчик рентгеновских снимков передачи по длине опоры для определения общего поля визуализации в продольном доступе сердца.Для сканирования используйте шаг поворота на 0,18 градуса, усреднение кадра на пять градусов и поворот образца на 180 градусов, отменив выбор параметра для получения на 360 градусов. Выберите режим сканирования со смещением, чтобы получить изображение всей ширины поддержки образца. После сканирования используйте программное обеспечение для томографической реконструкции изотропного трехмерного объема изображения.В конечном итоге разведывательное программное обеспечение использует коррекцию артефактов, связанную с получением, включая эффекты упрочнения пучка на 10% и уменьшение кольцевых артефактов на восемь. Затем, используя программное обеспечение Data Viewer, визуализируйте реконструированный стек данных. Цифровая ориентация образца в границах изображения, чтобы перестроить длинную и короткую ось образцов с тремя принципами оси объема изображения.Наконец, обрежьте объем изображения по всем трем осям, чтобы удалить внешние фоновые слои изображения и максимально уменьшить общий размер изображения. Рентгеновская визуализация высушенных на воздухе сердец свиней показывает основные анатомические ориентиры, включая желудочковые полости и мышечную стенку. Томографические реконструкции объемов трехмерного изображения показали отчетливое разделение между тканью и фоном на эпикардиальных и эндокардиальных границах.Трихромное окрашивание Мейсона показало коллагеновое положительное окрашивание в эпителиальном и эндотелиальном слоях параваскулярно в субэпикардиальной ткани. Яркое полевое освещение показало более темную окраску в коллагеновых структурах после окрашивания PMA, поддерживая преимущественное накопление PMA. Окрашенные PMA флуоресцентные изображения участков желудочковой ткани имели PMA-индуцированную потерю флуоресценции на участках коллагена.Если образец сердца окрашивали контрастным веществом посредством перфузии перед сушкой на воздухе, реконструкция изображения выявила очень пятнистое окрашивание в отсеке миокарда. Более того, низкая контрастность тканей показала плохое отделение от интенсивности фона. МикроКТ-томография части овцы, страдающей хроническим инфарктом миокарда, выявила центральное плотное фиброзное поражение, окруженное рыхлой и гетерогенной пограничной зоной.Здесь показаны наибольшие интенсивности сигналов реконструированных объемов изображения на границах тканей и рубцовых областях. Контрастные вещества плохо окрашивали здоровый миокард, но микроструктурный контраст сохранялся. В пограничной зоне рубцовая ткань перемежалась с выжившим миокардом.Плотный фиброз оказался трансмуральным, но текстурированным, что указывает на различия в составе. Трансмуральная область левого желудочка препарата окрашенной ткани ПМА показала селективное окрашивание на коллаген и отсутствие окрашивания в областях выжившего миокарда. Более длительное время перфузии с использованием этанола рекомендуется для обеспечения полного обмена содержания воды в сердце с этанолом.Взаимодействия между HMDS и водой производят тепло, которое может повредить образец. Сильным преимуществом этой процедуры является возможность проверки микро-компьютерной томографии с использованием гистологии. Высушенные на воздухе образцы могут быть непосредственно встроены в парафин для окрашивания сечением и микроскопирования.

Research

JoVE Journal

Medicine

Contrast Enhanced Vessel Imaging using MicroCT

Контрастность Enhanced Imaging судна использованием MicroCT

Microscopic computed tomography (microCT) offers high-resolution volumetric imaging of the anatomy of living small animals. However, the contrast between ...

Segmentation and Measurement of Fat Volumes in Murine Obesity Models Using X-ray Computed Tomography

Сегментация и измерение объемов жира в мышиной модели ожирения Использование рентгеновской компьютерной томографии

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are ...

Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging

Ретроградная перфузия и заполнение мыши коронарных артерий, как подготовка к Micro компьютерной томографии изображений

Visualization of the vasculature is becoming increasingly important for understanding many different disease states. While several techniques exist for ...

Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

Осмотическое доставки лекарств к ишемическим задних конечностей и перфузии сосудистого с Microfil для микро-компьютерной томографии

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Оценка жизнеспособности человеческого жира инъекции голым мышам с Micro-компьютерной томографии

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

Комбинированный ближней инфракрасной области флуоресцентных изображений и микро-компьютерной томографии для прямого Визуализируя церебральный тромбоэмболию

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

Cardiac Magnetic Resonance for the Evaluation of Suspected Cardiac Thrombus: Conventional and Emerging Techniques

Сердечный магнитный резонанс для оценки предполагаемого сердечного тромба: обычные и новые методы

We present the conventional cardiac magnetic resonance (CMR) protocol for evaluating a suspected thrombus and highlight emerging techniques.&#160;The ...

DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis

DUCT: Двойное литье смолы с последующей микрокомпьютерной томографией для 3D-анализа печени

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the ...

Sample Preparation for Computed Tomography-based Three-dimensional Visualization of Murine Hind-limb Vessels

Пробоподготовка для трехмерной визуализации сосудов задних конечностей на основе компьютерной томографии

Blood vessels are complex networks with tree-like structures, and vascular networks are essential for maintaining both circulation and maintaining organ ...

Four-Dimensional Computed Tomography-Guided Valve Sizing for Transcatheter Pulmonary Valve Replacement

Четырехмерная компьютерная томография с определением размеров клапана для транскатетерной замены легочного клапана

The measurements of the right ventricle (RV) and pulmonary artery (PA), for selecting the optimal prosthesis size for transcatheter pulmonary valve ...