Name: operation of laboratory photobioreactors with online growth measurements and customizable light regimes
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00
Duration: 5 min 21 s
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Este estudo foi apoiado pelo Conselho de Ciências Naturais e Pesquisa em Engenharia (NSERC), Fundação do Canadá para Inovação (CFI), Canada First Research Excellence Fund (CFREF), Alberta Innovates, General Sir John Monash Foundation, Government of Alberta e University of Calgary. Graças é estendido a Mark Toonen para o trabalho elétrico e William Richardson para cálculos de solubilidade.

1. Construção do estande da PBR
<ol><li>Com uma serra de corte portátil, corte cinco comprimentos de 380 mm e dois comprimentos de 200 mm de aço ranhuado em ângulo. Aperte junto com parafusos e grandes chaves de canto para fazer a base de um suporte (Figura 1A). Cole em tampas de extremidade de segurança.</li>
	<li>Conecte dois comprimentos verticais não cortados (1220 mm) de aço ranhuado angular à base. Fixar com parafusos e gussets de canto metálico (Figura 1B). Cole em tampas de extremidade de segurança.</li>
	<li>Corte quatro comprimentos planos de aço ranhutado de 65 mm. Aparafusá-los em ângulos de 90° nos suportes verticais — conecte dois a cada suporte, um de 130 mm acima da base (Figura 1C) e um de 60 mm para baixo da parte superior.</li>
	<li>Fixar suportes verticais através de sua parte superior com um comprimento horizontal de 140 mm de aço ranhurado plano (crossbeam) aparafusado na parte de trás do quadro (Figura 2A).</li>
</ol>2. Construção da câmara de luz
<ol><li>Corte um tubo branco de 153 mm de cloreto de polivinil (PVC) de diâmetro para um comprimento de 1070 mm. Corte o tubo ao meio do comprimento com uma serra de fita. Areia todas as bordas.</li>
	<li>Espaço uniforme e centro quatro canais de dissipação de calor de alumínio verticalmente, juntamente com o interior do tubo. Não conecte canais dentro de 20 mm da borda de corte do tubo. Com parafusos pequenos, proteja os canais no lugar em sua parte superior e inferior (Figura 2B).</li>
	<li>Coloque metade do tubo no suporte usando os suportes horizontais moldados na etapa 1.3.</li>
	<li>Coloque o reator para baixo e reúna as metades do tubo gravando-os juntos. Centralizar a dobradiça do piano ao longo de uma linha de corte. Rastreie os orifícios da dobradiça e faça o tubo de acordo. Use uma arma de rebite e rebites de comprimento médio para fixar a dobradiça no tubo.</li>
	<li>Use um pequeno cabo de bungee (ver Tabela de Materiais) para manter o tubo fechado (Figura 1C).</li>
	<li>Consulte um eletricista para fio nas luzes LED e instale os seguintes quatro componentes: driver LED, decodificador multiplex digital (DMX), controlador de iluminação DMX e caixa de comutação (ver Tabela de Materiais). Fixar todos os componentes na parte traseira do PBR de acordo com a Figura 2A.</li>
</ol>3. Construção das plataformas de garrafas
<ol><li>Corte as formas da plataforma (Figura 3A) de plástico duro, por exemplo, polietileno de alta densidade (HDPE) (ver Tabela de Materiais), utilizando a fresagem de controle numérico do computador (CNC). Faça três de cada forma. NOTA: Recomenda-se cortar camadas de cima e de baixo.</li>
	<li>Grave a camada inferior e superior juntas. Marque e faça cinco pequenos furos, 6 mm de diâmetro, através de ambas as formas (Figura 3A). Usando uma broca maior, expanda cuidadosamente a superfície desses orifícios para que as cabeças de parafuso possam ser rebaixadas (Figura 3B).</li>
	<li>Para cada uma das três plataformas, parafuso duas pequenas chaves de canto para a parte de trás do tubo. NOTA: A distância entre a parte superior do aparelho deve ser de 350 mm.</li>
	<li>Centralizar cada camada inferior em cima de suas chaves. Marque a localização dos furos debaixo do aparelho. Faça dois furos de 6 mm de diâmetro. Usando uma broca maior, expanda cuidadosamente a superfície dos orifícios para que os parafusos possam ser rebaixados.</li>
	<li>Bolt camadas inferiores para suas chaves (Figura 3B-C).</li>
	<li>Corte quinze peças de tubos rígidos de 12 mm de comprimento e 6,35 mm de diâmetro externo (OD). Sanduíche cinco pedaços do tubo rígido entre cada camada superior e inferior. Fixar camadas e tubos junto com parafusos estreitos longos de acordo com a Figura 3B-D.</li>
	<li>Faça um grande furo no tubo de PVC atrás de cada plataforma. Insira cada micro agitador magnético em sua plataforma. Rosqueie o cabo elétrico de cada agitador através desses orifícios recém-cortados (Figura 3C-E). Conecte cada agitador à sua respectiva unidade de controle, bem como a uma tomada de energia.</li>
	<li>Coloque uma garrafa de 1 L em cada plataforma. Adicione parafusos oculares no tubo traseiro ao nível do pescoço da garrafa. Enrole um pequeno cabo de bungee em torno de cada pescoço de garrafa para adicionar estabilidade (Figura 4A). NOTA: Ao longo do protocolo, plataformas de codificação de cores, garrafas, agitadores magnéticos e todos os cabos e sensores associados serão úteis.</li>
</ol>4. Construção das portas de amostragem líquida (opcional)
<ol><li>Corte três comprimentos de 60 mm de tubo rígido de 6,35 mm OD. Usando uma broca de 5 mm, faça furos em cada rolha de borracha. Empurre os comprimentos rígidos do tubo através da rolha.</li>
	<li>Corte três comprimentos de 60 mm de tubo rígido de 3,18 mm OD. Conecte-os com um redutor reto ao tubo saliente na parte inferior de cada rolha.</li>
	<li>Insira uma válvula de torneira de mão única (por exemplo, porta 1 = Luer fêmea, porta 2 = deslizamento masculino Luer) no tubo de saliência em cada superfície de rolha (Figura 4A).</li>
	<li>Corte três comprimentos de 30 mm de tubos flexíveis de 3,18 mm de OD. Insira encaixes Luer (por exemplo, Luer masculino para mangueira barb e luer fêmea para a mangueira barb) em cada extremidade.</li>
	<li>Conecte as peças feitas na etapa 4.4 às válvulas de torneira na superfície de cada rolha de borracha (Figura 4A). NOTA: Muitas combinações de torneiras e encaixes Luer podem produzir o mesmo resultado. O design deve permitir que o líquido seja retirado ou inserido através de uma seringa.</li>
</ol>5. Ligar sensores de gás volutrico
<ol><li>Prepare os sensores de gás de acordo com as instruções do fabricante. NOTA: Isso envolve principalmente o enchimento de sensores de gás com líquido de embalagem (Figura 4B).</li>
	<li>Para fazer as linhas de gás, corte três comprimentos de 1000 mm de tubos flexíveis de 3,18 mm de OD.</li>
	<li>Faça três furos de 4 mm de diâmetro no tubo de PVC traseiro. Posicione os orifícios ao lado da dobradiça na altura do pescoço da garrafa. Rosqueie linhas de gás através desses orifícios (Figura 4A).</li>
	<li>Ao final da linha de gás dentro do tubo de PVC, adicione um encaixe Luer (por exemplo, barb de mangueira ao macho Luer) e conecte uma válvula de torneira de mão única (por exemplo, porta 1 = Luer fêmea, porta 2 = Luer masculino). NOTA: A válvula só é necessária quando as portas de amostragem líquida também são instaladas.</li>
	<li>Junte-se à outra extremidade da linha de gás à porta de entrada do sensor de gás usando um redutor reto. Segure esta conexão com uma gravata zip.</li>
	<li>Conecte todos os sensores de gás ao módulo de entrada digital (DIM) com cabos de tomada e o DIM a um computador próximo.</li>
	<li>Instale o software de aquisição de dados (ver Tabela de Materiais) em um sistema operacional Windows e conecte o dongle da chave de licenciamento. Adicione arquivos de calibração do sensor ao diretório de calibração do software.</li>
</ol>6. Programação do regime de luz
<ol><li>Usando o interruptor de liga/desliga traseiro, ligue o PBR e conecte o controlador de iluminação DMX a um computador através de um cabo micro-USB.</li>
	<li>Baixe Ferramentas de atualização da loja (SUT) e o software de controle led (ver Tabela de Materiais). Registre o controlador de iluminação DMX on-line.</li>
	<li>Abra o software de controle LED e selecione Clique aqui para trabalhar com a interface USB-DMX: SUSHI-RB-RJ.</li>
	<li>Na guia Configuração na caixa ScanLibrary , selecione a pasta Genérico e o Canal Único. Alterar as configurações do ScanLibrary para o universo DMX 1, o número de acessórios para 4 e o número do índice para 1. No canto superior direito, altere a caixa de entrega para listar. Por fim, clique em Patch (Figura Suplementar 1). NOTA: No universo DMX, uma caixa testa o controle de cada tira LED deslizando os botões dimmer ou digitando um valor numérico na caixa de texto.</li>
	<li>Faça uma curva padrão que relaciona a configuração da luz digital no software de controle de iluminação com a intensidade de luz experimentada no centro do tubo de PVC (Figura 5). Meça a intensidade da luz interna com uma pequena sonda esférica (ver Tabela de Materiais) suspensa no centro do tubo de PVC.</li>
	<li>Avance para a guia Editor . Para construir um programa de luz personalizado, crie uma nova cena e comece a adicionar Passos. Consulte a Tabela Suplementar 1 para um exemplo 16:8 h programa diurno. Coloque a cena em loop. NOTA: Os passos dividem as cenas em blocos de tempo, cada um dos quais pode ser definido para diferentes intensidades de luz. Os passos variam de 1 s a 43 min. Aqui, 30 min passos são mais convenientes. Várias cenas podem ser carregadas em um dispositivo controlador de iluminação DMX.</li>
	<li>Crie uma cena de ajudante adicional que seja imediatamente reconhecível, por exemplo, dois dos quatro LEDs ligados. NOTA: As cenas podem ser ciclodas manualmente usando o botão na lateral do controlador de iluminação DMX. Se o programa de luz desejado começar durante a noite, será impossível distinguir se o programa de luz já começou. A cena do ajudante serve como um indicador de que o controlador de iluminação DMX está funcionando corretamente.</li>
	<li>Guarde as cenas e avance para a guia Stand Alone . Escreva a memória do controlador de iluminação DMX e desconecte o dispositivo do computador.</li>
	<li>Conecte o controlador de iluminação DMX à sua fonte de alimentação usando um micro-USB.</li>
	<li>Antes de iniciar um experimento, teste o programa de luz registrando a intensidade da luz interna para uma duração de 24 horas. Se a temperatura líquida estiver de interesse, registre-a simultaneamente com uma sonda de temperatura submersa (Figura 6).</li>
</ol>7. Iniciar um experimento
<ol><li>Esterilizar mídia, garrafas, barras de mexida, rolhas de borracha, portas de amostragem, tampas de parafuso de abertura roscadas e tubos. NOTA: Todos os componentes usados neste design são autoclaváveis, exceto as válvulas e os encaixes Luer — existem alternativas autoclaváveis de outros fabricantes.</li>
	<li>Abra o software de aquisição de dados e preencha a página de configuração (Figura Complementar 2). Atribua arquivos de calibração aos seus respectivos sensores.</li>
	<li>Em Nome de arquivo de diretório selecione a pasta de número de porta DIM correspondente. Clique em Pasta Atual e repita para todas as portas.</li>
	<li>Clique em OK para passar para a página de registro.</li>
	<li>Encha as garrafas ao volume desejado com meio de cultivo (Tabelas Suplementares 2,3). NOTA: Cada uma dessas garrafas terá um máximo de ~1,1 L com um pequeno espaço para a cabeça (~80 mL, incluindo a linha de gás).</li>
	<li>Centrifugar a cultura de estoque em três tubos equilibrados de 50 mL por 15 min a 4500 x g para produzir três pelotas. Adicione uma pelota a cada garrafa – lave em pelotas com uma pipeta sorológica e meio fresco. NOTA: A densidade cultural do dia 0 também é conhecida como concentração inicial de biomassa (IBC). Para medir o IBC em gAFDW. L-1, um tubo adicional de 50 mL pode ser centrifuado na etapa 7.6. A pelota resultante pode então ser seca e queimada15,19. A etapa 7.6 provavelmente exigirá modificações com base nos objetivos individuais dos usuários e seus experimentos.</li>
	<li>Jogue um agitador magnético, 25 x 8 mm, em cada garrafa.</li>
	<li>Sele cada abertura de garrafa com uma rolha de borracha e tampa de parafuso de abertura roscada (Figura 4A). Se forem instaladas portas de amostragem opcionais, feche as válvulas.</li>
	<li>Localize a extremidade de cada linha de gás dentro do tubo de PVC (construído na etapa 5.4) e conecte uma agulha à porta Luer masculina da válvula.</li>
	<li>Conecte cada garrafa ao seu sensor de gás perfurando cada rolha de borracha com a agulha correspondente.</li>
	<li>Inicie cada sensor de gás individualmente verificando a caixa de marca no lado esquerdo da tela, clicando em Iniciar e inserindo um nome de arquivo. Clique em OK e repita para todos os sensores (Figura Suplementar 3). NOTA: Durante o registro, não saia da janela de aquisição de dados. Defina as configurações de energia e sono do computador para nunca e adie as atualizações do computador durante a duração do experimento.</li>
	<li>Ligue o PBR e certifique-se de que o controlador de iluminação DMX esteja conectado a uma fonte de alimentação. A primeira cena programada começará automaticamente. Consulte a etapa 6.7 para confirmar se o controlador de iluminação DMX está funcionando corretamente.</li>
</ol>8. Amostragem de garrafas (opcional)
<ol><li>Prepare mais 500 mL do meio fresco antes de iniciar o experimento (Tabela Suplementar 2). NOTA: Se um programa de luz de 24h com ciclo diurno de 16:8h foi iniciado às 9h, então os horários de amostragem antes do anoitecer e do amanhecer cairiam às 8h e às 16h (Tabela Suplementar 1). Aqui, amanhecer e crepúsculo referem-se a 30 min passos que transitam luzes de ON para OFF e vice-versa.</li>
	<li>Feche a válvula na linha de gás.</li>
	<li>Conecte uma seringa (10 mL) à válvula de porta de amostragem (Figura 4A).</li>
	<li>Abra a válvula de porta de amostragem e retire 8 mL de cultura. NOTA: Recomenda-se entre 5 a 10 mL. Remover líquido gera um vácuo no headspace, tornando os volumes >10 mL difíceis de extrair.</li>
	<li>Feche a válvula de porta de amostragem e desconecte a seringa.</li>
	<li>Conecte uma seringa contendo 8 mL de meio fresco (da etapa 8.1) à válvula de porta de amostragem.</li>
	<li>Abra a válvula da porta de amostragem e injete meio fresco. NOTA: Substituir o volume da cultura amostrada por um meio fresco serve para manter um volume e pressão igual do espaço da cabeça e lavar a linha da porta de amostragem.</li>
	<li>Feche a válvula de porta de amostragem antes de desconectar a seringa.</li>
	<li>Repetir as etapas 8.2-8.8 a cada tempo de amostragem.</li>
</ol>9. Terminando um experimento
<ol><li>Verifique todas as caixas de marcação de porta ativas na janela de aquisição de dados e clique em Parar.</li>
	<li>Para exportar dados, selecione Arquivo e Dados Offline. Selecione todos os arquivos de log relevantes. Exporte os dados para o software de planilha e salve.</li>
	<li>Para cada garrafa, converta o volume total de oxigênio medido em mL em mols usando a lei do gás ideal. Prever o peso da biomassa cultivada (gAFDW) se 1,05 toupeira de O2 for gerada para cada mol de biomassa produzida. Tome o peso molar da biomassa como 24,6 g mol-1.</li>
	<li>Faça a curadoria manual dos dados da taxa de fluxo. Use unidades de mL/h e uma média móvel de 3 pontos.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Benemann, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Opportunities and challenges in algae biofuels production. A position paper in line with Algae World. , (2008).</li><li>Laurens, L. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+technology+review+-+algae+bioenergy.+An+IEA+bioenergy+inter-task+strategic+project.">State of technology review - algae bioenergy. An IEA bioenergy inter-task strategic project.</a> IEA Bioenergy. , (2017).</li><li>Robertson, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+dawn+for+industrial+photosynthesis.">A new dawn for industrial photosynthesis.</a> Photosynthesis Research. 107, 269-277 (2011).</li><li>Troschl, C., Meixner, K., Drosg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+PHA+production-review+of+recent+advances+and+a+summary+of+three+years'+working+experience+running+a+pilot+plant.">Cyanobacterial PHA production-review of recent advances and a summary of three years' working experience running a pilot plant.</a> Bioengineering. 4 (2), (2017).</li><li>Rizwan, M., Mujtaba, G., Memon, S. A., Lee, K., Rashid, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+potential+of+microalgae+for+new+biotechnology+applications+and+beyond:+a+review.">Exploring the potential of microalgae for new biotechnology applications and beyond: a review.</a> Renewable and Sustainable Energy Reviews. 92, 394-404 (2018).</li><li>Niesa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Phormidium+lacuna+strains+from+the+North+Sea+and+the+Mediterranean+Sea+for+biotechnological+applications.">Characterization of Phormidium lacuna strains from the North Sea and the Mediterranean Sea for biotechnological applications.</a> Process Biochemistry. 59, 194-206 (2017).</li><li>Laurens, L. M. L., Chen-Glasser, M., McMillan, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perspective+on+renewable+bioenergy+from+photosynthetic+algae+as+feedstock+for+biofuels+and+bioproducts.">A perspective on renewable bioenergy from photosynthetic algae as feedstock for biofuels and bioproducts.</a> Algal Research. 24, 261-264 (2017).</li><li>Barreiro-Vescovo, S., Barbera, E., Bertucco, A., Sforza, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+microalgae+cultivation+in+a+biogas+production+process+from+organic+municipal+solid+waste:+From+laboratory+to+pilot+scale.">Integration of microalgae cultivation in a biogas production process from organic municipal solid waste: From laboratory to pilot scale.</a> ChemEngineering. 4 (2), 26 (2020).</li><li>Zurano, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Year-long+assessment+of+a+pilot-scale+thin-layer+reactor+for+microalgae+wastewater+treatment.+Variation+in+the+microalgae-bacteria+consortium+and+the+impact+of+environmental+conditions.">Year-long assessment of a pilot-scale thin-layer reactor for microalgae wastewater treatment. Variation in the microalgae-bacteria consortium and the impact of environmental conditions.</a> Algal Research. 50, (2020).</li><li>Depr&#225;, M. C., Severo, I. A., Dias, R. R., Zepka, L. Q., Jacob-Lopes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobioreactor+design+for+microalgae+culture.">Photobioreactor design for microalgae culture.</a> Microalgae. , 35-61 (2021).</li><li>Osburn, F. S., Wagner, N. D., Scott, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+stoichiometry+and+growth+dynamics+of+a+diazotrophic+cyanobacteria+in+nitrogen+sufficient+and+deficient+conditions.">Biological stoichiometry and growth dynamics of a diazotrophic cyanobacteria in nitrogen sufficient and deficient conditions.</a> Harmful Algae. 103, (2021).</li><li>Eustance, E., Badvipour, S., Wray, J. T., Sommerfeld, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomass+productivity+of+two+Scenedesmus+strains+cultivated+semi-continuously+in+outdoor+raceway+ponds+and+flat-panel+photobioreactors.">Biomass productivity of two Scenedesmus strains cultivated semi-continuously in outdoor raceway ponds and flat-panel photobioreactors.</a> Journal of Applied Phycology. 28 (3), 1471-1483 (2016).</li><li>Qiang, H., Richmond, A., Zarmi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+effects+of+light+intensity,+light-path+and+culture+density+on+output+rate+of+spirulina+platensis+(cyanobacteria).">Combined effects of light intensity, light-path and culture density on output rate of spirulina platensis (cyanobacteria).</a> European Journal of Phycology. 33 (2), 165-171 (1998).</li><li>Ooms, M. D., Dinh, C. T., Sargent, E. H., Sinton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+management+for+augmented+photosynthesis.">Photon management for augmented photosynthesis.</a> Nature Communications. 7, 1-13 (2016).</li><li>Moheimani, N. R., Borowitzka, M. A., Isdepsky, A., Sing, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+methods+for+measuring+growth+of+algae+and+their+composition.">Standard methods for measuring growth of algae and their composition.</a> Algae for biofuels and energy. , 265-284 (2013).</li><li>Griffiths, M. J., Garcin, C., van Hille, R. P., Harrison, S. T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+by+pigment+in+the+estimation+of+microalgal+biomass+concentration+by+optical+density.">Interference by pigment in the estimation of microalgal biomass concentration by optical density.</a> Journal of Microbiological Methods. 85 (2), 119-123 (2011).</li><li>Schumann, R., H&#228;ubner, N., Klausch, S., Karsten, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophyll+extraction+methods+for+the+quantification+of+green+microalgae+colonizing+building+facades.">Chlorophyll extraction methods for the quantification of green microalgae colonizing building facades.</a> International Biodeterioration and Biodegradation. 55 (3), 213-222 (2005).</li><li>Pinckney, J. L., Richardson, T. L., Millie, D. F., Paerl, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+photopigment+biomarkers+for+quantifying+microalgal+community+composition+and+in+situ+growth+rates.">Application of photopigment biomarkers for quantifying microalgal community composition and in situ growth rates.</a> Organic Geochemistry. 32 (4), 585-595 (2001).</li><li>Van Wychen, S., Laurens, L. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+total+solids+and+ash+in+algal+biomass:+laboratory+analytical+procedure+(LAP).">Determination of total solids and ash in algal biomass: laboratory analytical procedure (LAP).</a> National Renewable Energy Laboratory. , (2015).</li><li>Davis, R., Laurens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Algal+biomass+production+via+open+pond+algae+farm+cultivation:+2019+state+of+technology+and+future+research.">Algal biomass production via open pond algae farm cultivation: 2019 state of technology and future research.</a> National Renewable Energy Laboratory. , (2020).</li><li>Borovkov, A. B., Gudvilovich, I. N., Avsiyan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-up+of+Dunaliella+salina+cultivation:+from+strain+selection+to+open+ponds.">Scale-up of Dunaliella salina cultivation: from strain selection to open ponds.</a> Journal of Applied Phycology. 32 (3), 1545-1558 (2020).</li><li>Davies, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+associated+with+the+large-scale+outdoor+cultivation+of+the+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+PCC+7002.">Microbiota associated with the large-scale outdoor cultivation of the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002.</a> Algal Research. 58, (2021).</li><li>Ataeian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+capture+and+conversion+of+CO2+from+air+by+growing+a+cyanobacterial+consortium+at+pH+up+to+11.2.">Direct capture and conversion of CO2 from air by growing a cyanobacterial consortium at pH up to 11.2.</a> Biotechnology and Bioengineering. 116 (7), 1604-1611 (2019).</li><li>Fu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+photosynthesis+and+oxygen+generation+of+microalgae-embedded+silk+fibroin+hydrogels.">Sustained photosynthesis and oxygen generation of microalgae-embedded silk fibroin hydrogels.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. , (2021).</li><li>Rearte, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthetic+performance+of+Chlorella+vulgaris+R117+mass+culture+is+moderated+by+diurnal+oxygen+gradients+in+an+outdoor+thin+layer+cascade.">Photosynthetic performance of Chlorella vulgaris R117 mass culture is moderated by diurnal oxygen gradients in an outdoor thin layer cascade.</a> Algal Research. 54, (2021).</li><li>Poughon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limnospira+indica+PCC8005+growth+in+photobioreactor:+model+and+simulation+of+the+ISS+and+ground+experiments.">Limnospira indica PCC8005 growth in photobioreactor: model and simulation of the ISS and ground experiments.</a> Life Sciences in Space Research. 25, 53-65 (2020).</li><li>Yen, U. C., Huang, T. C., Yen, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+the+circadian+photosynthetic+rhythm+in+cyanobacteria+with+a+dissolved-oxygen+meter.">Observation of the circadian photosynthetic rhythm in cyanobacteria with a dissolved-oxygen meter.</a> Plant Science. 166 (4), 949-952 (2004).</li><li>Vermaas, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthesis+and+respiration+in+cyanobacteria.">Photosynthesis and respiration in cyanobacteria.</a> eLS. , (2001).</li><li>Ritter, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MilliGascounter Type MGC-1 Operation Instructions V 3.4. , (2017).</li><li>Sousa, C., De Winter, L., Janssen, M., Vermu&#235;, M. H., Wijffels, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+the+microalgae+Neochloris+oleoabundans+at+high+partial+oxygen+pressures+and+sub-saturating+light+intensity.">Growth of the microalgae Neochloris oleoabundans at high partial oxygen pressures and sub-saturating light intensity.</a> Bioresource Technology. 104, 565-570 (2012).</li><li>Latifi, A., Ruiz, M., Zhang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+in+cyanobacteria.">Oxidative stress in cyanobacteria.</a> FEMS microbiology reviews. 33 (2), 258-278 (2009).</li><li>Morillas-Espa&#241;a, A., Lafarga, T., G&#243;mez-Serrano, C., Aci&#233;n-Fern&#225;ndez, F. G., Gonz&#225;lez-L&#243;pez, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Year-long+production+of+Scenedesmus+almeriensis+in+pilot-scale+raceway+and+thin-layer+cascade+photobioreactors.">Year-long production of Scenedesmus almeriensis in pilot-scale raceway and thin-layer cascade photobioreactors.</a> Algal Research. 51, (2020).</li><li>Melis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solar+energy+conversion+efficiencies+in+photosynthesis:+minimizing+the+chlorophyll+antennae+to+maximize+efficiency.">Solar energy conversion efficiencies in photosynthesis: minimizing the chlorophyll antennae to maximize efficiency.</a> Plant Science. 177 (4), 272-280 (2009).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Dentro deste protocolo, o foco nas etapas a seguir aumenta a probabilidade de gerar dados reprodutíveis e de alta qualidade. Ao construir o suporte do reator (passo 1), a base deve ser resistente com suportes verticais bem alinhados. O aço ranhuado tem bordas afiadas, por isso a adição de tampas de segurança é essencial. As superfícies da plataforma da garrafa precisam ser completamente planas, o agitador magnético e as cabeças de parafuso devem sentar-se abaixo da superfície da camada superior (passos 3.2-3.6). De acordo com a instrução do fabricante, o líquido de embalagem do sensor de gás deve ser preenchido ao "parafuso de rastreamento para nível líquido" para medições precisas de oxigênio. Este nível líquido deve ser verificado regularmente, pois a evaporação do líquido de embalagem pode fazer um curto-circuito na célula de medição. Todas as três linhas de gás feitas na etapa 5.2 devem ter o mesmo comprimento; este enures que replica têm volumes de espaço para a cabeça idênticos. Antes de iniciar um experimento, é aconselhável testar o regime de luz programado registrando intensidade de luz durante um período de 24 horas (etapa 6.11). Se o aumento da temperatura líquida for preocupante, este teste também deve incluir uma garrafa selada com uma sonda de temperatura interna (passo 6.11). Ao fazer o registro, não saia da janela do software de aquisição de dados; isso vai acabar com o registro. Se colher amostras de cultura, tenha cuidado para não liberar gás headspace abrindo válvulas na sequência errada (passos 8.2-8.8). Ao revisar dados experimentais, é informado que o software de aquisição de dados gera automaticamente uma média móvel da taxa de fluxo. Isso infla o valor das leituras de uma ou duas taxas de fluxo geradas durante a noite. Faça a curadoria de registros de sensores de gás manualmente para corrigir isso.
O revés mais comum com este método é o potencial de curto-circuito no sensor de gás se o nível de embalagem líquida diminuir. Há duas maneiras de isso ocorrer. Em primeiro lugar, a evaporação pode reduzir lentamente o nível líquido. No entanto, isso é improvável emum experimento de curto prazo (<7 dias). Em segundo lugar, altas taxas de respiração podem puxar oxigênio para a solução e gerar um espaço de cabeça sob pressão. Quando a energia da luz não está disponível, as microalgas usam a respiração aeróbica para fornecer a energia necessária para manutenção e reparo celular28. Assim, em culturas densas durante horas não iluminadas, o consumo de oxigênio e a consequente sub-pressão podem ser substanciais. Isso suga o líquido dos sensores de gás para a linha de gás. A distância que o líquido de embalagem percorre é proporcional à quantidade de respiração noturna. Se o líquido de embalagem entrar nas garrafas, isso gera uma mancha de óleo na superfície líquida.
Se forem esperadas altas taxas de respiração noturna, podem ser feitas modificações no protocolo. A maneira mais simples de evitar a sub-pressão é deixar os faróis da garrafa abertos durante a noite. Isso também tem a vantagem de aliviar os níveis do DO, diminuindo a pressão parcial do headspace de O2. Acredita-se que altas concentrações de DO sejam prejudiciais ao crescimento, pois o O2 pode impedir a atividade de Rubisco e pode desencadear estresse oxidativo30,31. Não é incomum que as suspensões culturais atinjam 4x de supersaturação mesmo quando em contato com a atmosfera25,32. Para abrir o espaço da cabeça, desconecte a linha de gás da agulha que abrange a rolha de borracha. As horas noturnas podem servir como uma janela para retoque o líquido de embalagem de sensores de gás ou manipular experimentos contínuos com pouco impacto na coleta de dados. Por exemplo, pode-se alterar a densidade da cultura, atualizar nutrientes, adicionar uma emenda ou introduzir um patógeno. As garrafas devem ser reeladas, e a linha do sensor de gás reconectada antes que as luzes se acendam. As medidas de oxigênio coletadas a partir de experimentos com espaços noturnos fechados versus abertos diferem.
Quando as garrafas permanecem seladas, o consumo noturno de oxigênio reduz o número de mols de O2 no headspace. Isso faz com que o líquido de embalagem suba a linha do sensor de gás para manter a pressão do espaço da cabeça. Quando as luzes se acendem, a produção de oxigênio recomeça. O líquido de embalagem deve ser empurrado de volta para o sensor de gás antes do início das leituras da taxa de fluxo. Esta defasagem é, portanto, proporcional ao grau de respiração noturna. Desta forma, quando o headspace permanece fechado, as leituras de O2 representam a produção líquida O2 (produção fotossintética - consumo respiratório). Por outro lado, quando o espaço para a cabeça é aberto à noite, o gás atmosférico substitui o espaço de cabeça O2 consumido, e nenhum líquido de embalagem entra na linha de gás. O resultado é que o consumo de O2 respiratório não é contabilizado nos dados de produção de O2 . Isso pode reduzir a precisão das estimativas de crescimento da biomassa AFDW. No entanto, não deve impactar a utilidade do uso da produção diurna O2 como métrica para comparar o crescimento entre os tratamentos.
Todos os PBRs laboratoriais são afetados pela mesma limitação; luzes artificiais não podem replicar o espectro solar. Microalgas usam comprimentos de onda de luz entre 400 e 700 nm para fotossíntese. Esta região é referida como radiação fotossintética ativa (PAR)33. A luz solar e a luz artificial variam em sua contribuição relativa de comprimentos de onda dentro desta faixa. Isso, ao lado de temperaturas favoráveis e uma oferta constante de luz, significa que os dados de crescimento laboratorial muitas vezes não podem ser adequadamente extrapolados para condições externas. Esses PBRs podem, no entanto, abordar uma das limitações do fornecimento de luz de PBR laboratorial. A intensidade da luz solar é altamente variável ao longo do dia, com a cobertura de nuvens gerando flutuações transitórias no PAR incidente. O software de controle de iluminação e o controlador de iluminação DMX podem fornecer intensidades de luz de 0 a 2400 μmolfótons m-2 s-1 e além. Regimes leves podem ser divididos em incrementos individuais tão curtos quanto 1 s. A intensidade de luz tunable permite que o usuário imite padrões de luz ao ar livre mais de perto do que as configurações padrão de PBR. Aqui, intervalos simulados de 30 min de madrugada e crepúsculo desaparecem ciclos diurnos e noturnos juntos (Tabela Suplementar 1).
Embora a densidade afdw tenha se tornado a medida padrão de crescimento, este método pode exigir volumes de cultura substanciais, um período de processamento de 2 a 3 dias, e gera um ponto de dados por vez. Além disso, se as condições se tornarem desfavoráveis e as células morrerem, a densidade de AFDW não discrimina entre células ativamente fotossintestares e aquelas que estão se decompondo. Quantificar a taxa de produção de oxigênio fotossintético serve como um proxy de crescimento alternativo. Este projeto PBR pode registrar a produção de oxigênio continuamente com pouca intervenção do usuário enquanto conserva o volume da cultura. A resolução dos dados poderia ser melhorada selecionando um sensor de gás com menor volume de célula de medição, por exemplo, 1 mL. Além disso, se as culturas forem bem misturadas, os usuários podem decidir instalar um espectrômetro para leituras contínuas de densidade óptica. Se o controle de temperatura do meio for desejado, um resfriador recirculador pode ser adicionado. Esses PBRs são uma adição valiosa a um laboratório que busca expandir sua capacidade de pesquisa microángua sem investimento financeiro pesado. Eles são particularmente adequados para aqueles que trabalham com alta alcalinidade, espécies de pH altas como Spirulina. Estes PBRs oferecem flexibilidade de regime leve e são válidos para comparações rápidas, replicadas e de crescimento laboratorial.

Microalgas e cianobactérias, coletivamente chamadas de microalgas para a simplicidade, são defendidas por seu potencial em biotecnologia sustentável. Eles são candidatos atraentes devido ao seu rápido crescimento, capacidade de serem cultivados em terras não aráveis, e pelo uso da luz solar para impulsionar a conversão de dióxido de carbono em biomassa 1,2,3. A biomassa microalgal pode ser convertida em produtos como bioenergia na forma de óleo ou gás, corantes alimentares e suplementos nutricionais, e materiais como biopolímeros 1,4,5,6,7. Além disso, podem ser usados para tratar águas residuais ou remediar corpos d'água, consumindo nutrientes em excesso 8,9. Diante disso, a pesquisa microalgal é generalizada e estabelecida. O campo cresce à medida que a sociedade reconsidera a intensidade de carbono e a sustentabilidade ambiental das abordagens atuais de fabricação e geração de energia.
Três requisitos fundamentais de estudos microánguicos baseados em laboratório são um vaso cultural, fonte de luz e método para quantificar o crescimento. O termo fotobioreator (PBR) descreve uma configuração na qual os vasos culturais são iluminados10. Comumente, estudos de microalgas visam comparar o crescimento entre dois ou mais tratamentos, por exemplo, diferentes mídias de crescimento, regimes leves ou espécies 11,12,13. Para relevância estatística, cada condição, por exemplo, tratamento e controle, deve ser replicada. Se o controle e o tratamento forem executados simultaneamente, isso significa que muitos PBRs devem ser monitorados e amostrados durante a duração de um experimento. O desafio com a operação de vários PBRs é duas vezes. Em primeiro lugar, fornecer uma intensidade de luz uniforme a cada PBR é essencial para a reprodutibilidade, mas pode ser difícil. A quantidade de incidente de luz na superfície do vaso é influenciada por sua distância da fonte de luz, sombreamento de vasos adjacentes e flutuações de luz de fundo14. Em segundo lugar, deve ser selecionado um método para quantificar com precisão o crescimento.
O crescimento é comumente medido pela contagem de células, densidade óptica (OD), teor de clorofila A, densidade de peso seco (DW) e densidade de peso seco livre de cinzas (AFDW)15. Contagem de células, teor de clorofila A e métodos gravimétricos são processos manuais que produzem pontos de dados discretos. OD pode ser medido continuamente e não invasivamente com um espectrofotômetro, desde que seja bem calibrado contra outro método, como a densidade AFDW15. No entanto, as medidas de OD e o teor de Clorofila A podem não ser confiáveis, pois os resultados variam em diferentes condições culturais, por exemplo, entre espécies e ao longo do ciclode crescimento 15,16. Para clorofila A, o método de extração também pode impactar o rendimento do pigmento17. Clorofila O conteúdo é particularmente útil no acompanhamento do crescimento de microalgas dentro de comunidades microbianas que também contêm organismos não fotossintéticos17,18. Ao escolher um método para determinar o crescimento, é essencial considerar a morfologia da suspensão. Quando os organismos se aglomeram e não são bem misturados, a OD e a contagem de células não são possíveis15. Um único método não é adequado para todas as aplicações experimentais — os pesquisadores devem decidir quais métodos são práticos e relevantes para seus objetivos experimentais.
O AFDW é um método confiável que permite comparações de crescimento entre várias condições culturais, notadamente, entre espécies e meios culturais 15,19,20. Para calcular afdw, uma amostra de cultura microálga é primeiro concentrada, seja por filtração ou centrifugação, e seca. Nesta fase, a DW pode ser determinada. Normalmente, a amostra DW contém pelo menos 8-10% de material inorgânico de cinzas, como sais e material particulado15. A DW acompanha as tendências de crescimento, mas pode ser distorcida se a contribuição dos inorgânicos variar. Para determinar a densidade de AFDW, a biomassa seca é queimada a altas temperaturas; isso vaporiza a porção orgânica ou útil, deixando as cinzas (inorgânicas) para trás19. Para calcular o AFDW, o peso da fração de cinzas é subtraído do da fração DW. Normalmente, em suspensões microánguas, o AFDW varia de 0,1 a 3 g/L 12,21,22. Pequenos volumes de suspensões diluídos produzem pouca biomassa seca, <10 mgs. Após a combustão, as cinzas podem pesar apenas 1 mg. Portanto, dependendo da densidade cultural, este método requer volumes entre 5-100 mL e escalas analíticas precisas de 0,1 mg 12,15,19,22. Os PBRs de laboratório são tipicamente pequenos, um par de litros no máximo, portanto, cada amostra líquida esgota o volume cultural. Além disso, o método AFDW é manual e leva de 2 a 3 dias. Para experimentos replicados e repetitivos, é preferível um processo automatizado e contínuo.
Para microalgas que usam bicarbonato como fonte de carbono, duas métricas adicionais de crescimento podem ser medidas continuamente. A fotossíntese consome bicarbonato e produz oxigênio. O consumo de bicarbonato aumenta o pH médio23. Uma sonda pH imersa pode medir essa mudança. A produção de oxigênio fotossintético aumenta a concentração de oxigênio dissolvido (DO) do meio até que o meio esteja saturado. Além da saturação, o oxigênio existe como bolhas. A produção de oxigênio é medida por muitas técnicas diferentes: sondas medem a concentração do DO, dispositivos manométricos avaliam a pressão do espaço na cabeça, a cromatografia gasosa mede a composição do headspace e sensores volumétricos registram saída de gás 24,25,26,27. Quando o oxigênio é usado como um proxy de crescimento, os vasos de cultura devem ser totalmente selados ou permitir apenas o fluxo de gás. Para medições de pH e oxigênio, o carbono deve ser fornecido sob a forma de bicarbonato, não por co2 sparging. O escoamento de CO2 diminui o pHmédio 23 e, como gás, pode perturbar as medições de oxigênio. Uma vantagem do pH e do oxigênio sobre a densidade óptica é que o método não é comprometido se microalgas formarem aglomerados. Embora indiretos, tanto o pH quanto o oxigênio são eficazes na comparação do crescimento entre os tratamentos.
Os PBRs em uso hoje variam em complexidade. Os laboratórios podem usar frascos simples de bancada, protótipos personalizados ou produtos disponíveis comercialmente. Para grupos de pesquisa que buscam atualizar a partir de frascos, o custo de PBRs comerciais ou habilidade técnica e fabricação de peças necessárias para construir muitos protótipos pode ser uma barreira. Este manuscrito tem como objetivo descrever o projeto passo a passo, a construção e a operação de PBRs de laboratório que fazem a ponte dessa lacuna. Estes PBRs têm um regime de luz personalizável e monitoram o crescimento continuamente registrando a produção volumostrica de oxigênio. Este projeto abriga três vasos culturais para replicação triplicada e pode ser construído com habilidade moderada e materiais de fácil acesso. Este PBR é uma adição valiosa a um laboratório que busca expandir sua capacidade de pesquisa microálgica sem investir em produtos muito técnicos ou caros. Ao optar por adquirir ou construir um PBR, os pesquisadores devem considerar a adequação de um projeto às suas condições culturais, posição financeira e questões de pesquisa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aluminum channels 
			Imperial: 0.90&#8221; x 39.37&#8221; 
			Metric: 2.3 cm x 100 cm 
			Quantity: 4</td>
			<td>LED World</td>
			<td>AC-AR1-1M</td>
			<td>Required as a heat sink</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bungee cords, small 
			Quantity: 5</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>To secure bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer - desktop/laptop 
			Quantity: 1</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Logger, HOBO U30 USB Weather Station 
			Quantity: 1</td>
			<td>HOBO, Hoskin</td>
			<td>U30-NRC-VIA-10-S100-000</td>
			<td>Records light sensor information</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital interface module, Rigamo, 4-channel 
			Quantity: 1</td>
			<td>Ritter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is to transmit gas sensor data to the computer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMX decoder, 12~24 VDC, DMX-CV-4X5A 
			Quantity: 1</td>
			<td>LITECH, LED World</td>
			<td>LT-840-6A</td>
			<td>Transmit messages which alter the light pattern</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMX lighting controller, SUSHI-RB-RJ 
			Quantity: 1</td>
			<td>Arcolis, Nicolaudie America Inc.</td>
			<td>SUSHI-RB-RJ DMX</td>
			<td>Encodes the lighting program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas sensor packing liquid (Silox) 
			Quantity: 1 L</td>
			<td>Ritter</td>
			<td>https://www.ritter.de/en/data-sheets/silox</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas sensor, volumetric 
			Quantity: 3</td>
			<td>Ritter</td>
			<td>MGC-1 V3.4 PMMA (https://www.ritter.de/downloads/mgc-milligascounter-en)</td>
			<td>Measures oxygen production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottles, round 1 L with GL45 neck 
			Quantity: 3</td>
			<td>Corning, Capitol Scientific</td>
			<td>1395-1L</td>
			<td>Culture vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardware - end caps for slotted steel 
			Quantity: 10</td>
			<td>Paulin, Home Depot</td>
			<td>142-612</td>
			<td>To cover sharp edges of slotted steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardware - eye hooks 
			Quantity: 6</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>To secure bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardware - metal corner braces (large) 
			Imperial: 4&#34; x 4&#34; 
			Metric: 10 cm x 10 cm 
			Quantity: 8</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Larger brackets to construct metal stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardware - metal corner braces (small) 
			Imperial: 2 1/2&#34; x 2 1/2&#34; 
			Metric: 6.4 cm x 6.4 cm 
			Quantity: 6</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Small brackets to connect bottle platforms to PVC pipe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardware - metal corner gussets 
			Imperial: 3&#34; x 3&#34; 
			Metric: 7.6 cm x 7.6 cm 
			Quantity: 6</td>
			<td>Paulin, Home Depot</td>
			<td>142-616</td>
			<td>Flat brackets to construct metal stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardware - piano hinge 
			Imperial: 36&#34; 
			Metric: 91 cm 
			Quantity: 1</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Connects two halves of PVC pipe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardware - rivets 
			Quantity: 40</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>To attach piano hinge to PVC tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardware - set of bolts, nuts, washers 
			Quantity: 60</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Long thin bolts are required to secure bottle platforms around magentic stirrers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardware - set of bolts, nuts, washers 
			Quantity: 30</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Larger shorter bolts are required to build the metal stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED driver, constant voltage, 96W 24VDC UL Listed IP65 Driver Class 2 regulated power supply 
			Quantity: 1</td>
			<td>Magnitude Lighting, LED World</td>
			<td>CVN96L24DC</td>
			<td>Regulates power to the lights</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED lights, Cinco Bright LED Flex Strip 
			Quantity: 4 m roll</td>
			<td>EvenBright, LED World</td>
			<td>FA128M57-4M-24V-X</td>
			<td>Roll is trimmed into 4 x 1 m lengths and secured inside the PVC tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light meter, handheld with submersible sperical probe 
			Quantity: 1</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>LA-250A</td>
			<td>Calibrate the reactors light intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light sensors Photosynthetic Light (PAR) Smart Sensor 
			Quantity: 2</td>
			<td>HOBO, Hoskin</td>
			<td>S-LIA-M003</td>
			<td>Only one is required however two would be good practice in case one malfunctioned</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrers (MIXdrive 1 XS) with external control units and power supply (MIXcontrol eco) 
			Quantity: 3</td>
			<td>2Mag, 2MAG USA</td>
			<td>MF 40300</td>
			<td>Stirrers sit sandwiched in bottle platforms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal plate 
			Imperial: 24&#34; x 8&#34; 
			Metric: 61 cm x 20.3 cm 
			Quantity: 1</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>This is a surface on which to secure electronics, it is attached to the back of the reactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipe, white PVC 
			Imperial: 6&#34; diameter x 42&#34; high 
			Metric: 15.2 cm x 106.7 cm 
			Quantity: 1</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Cut lengthwise in two halves, used to house lights and bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic (HDPE) sheets 
			Imperial: 4&#34; x 4&#34; x 1/4&#34; 
			Metric: 10 cm x 10 cm x 1 cm 
			Quantity: 6</td>
			<td>Inventables</td>
			<td>30291-01</td>
			<td>For bottle platforms which house magentic stirrers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber stoppers - GL45 size 
			Quantity: 3</td>
			<td>Duran, VWR</td>
			<td>76289-760</td>
			<td>Seals culture vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw caps - with aperture and GL45 neck 
			Quantity: 3</td>
			<td>Corning, Capitol Scientific</td>
			<td>1395-45HTSC</td>
			<td>Generates seal of culture vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted angle steel lengths 
			Imperial: 1-1/2&#34; X 48&#34; x 0.074&#34; 
			Metric: 3.8 cm x 122 cm x 0.19 cm 
			Quantity: 6</td>
			<td>Paulin, Home Depot</td>
			<td>142-202</td>
			<td>Makes up the body of the metal stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted flat steel lenghts 
			Imperial: 1-3/8&#34; x 48&#34; x 0.074&#34; 
			Metric: 3.5 cm x 122 cm x 0.19 cm 
			Quantity: 3</td>
			<td>Paulin, Home Depot</td>
			<td>142-222</td>
			<td>Makes up the body of the metal stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software - Easy Stand Alone (ESA)</td>
			<td></td>
			<td>https://www.dmxsoft.com/#apps</td>
			<td>AKA LED control software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software - Rigamo v3.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AKA data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software - Storage Upgrade Tools (SUT)</td>
			<td></td>
			<td>https://store.dmxsoft.com//</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bar 
			Imperial: 1&#34; x 5/16&#34; 
			Metric: 2.5 cm x 0.8 cm 
			Quantity: 3</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-513-59</td>
			<td>Stirs culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switch box 
			Quantity: 1</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Turns power on/off to reactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL 
			Quantity: Multiple</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Optional if you wish to extract culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube adaptor fittings, plastic - Stopcock 1-way 
			Quantity: 6</td>
			<td>Masterflex, Cole Palmer</td>
			<td>RK-12023-33</td>
			<td>Close/open culture vessel line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube adaptor fittings, plastic - variety of male and female luer lock fittings 
			Imperial: to fit 1/16&#34; and 1/8&#34; ID tubing 
			Metric: to fit 1.59 mm and 3.18 mm tubing 
			Quantity: Multiple packets</td>
			<td>Masterflex, Cole Palmer</td>
			<td>RK-30800-16; RK-30800-18; RK-45518-26; RK-45501-00; RK-45501-04</td>
			<td>Many different combinations can achieve the same end result, best to order a variety of fittings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube adaptor fittings, plastic - variety of straight connectors 
			Imperial: to fit 1/16&#34; and 1/8&#34; ID tubing 
			Metric: to fit 1.59 mm and 3.18 mm tubing 
			Quantity: Multiple packets</td>
			<td>Masterflex, Cole Palmer</td>
			<td>RK-40616-04</td>
			<td>Many different combinations can achieve the same end result, best to order a variety of fittings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, flexible, transparent 
			Imperial: ID=1/16&#34;, OD=1/8&#34; 
			Metric: ID = 1.59 mm, 0D = 3.18 mm 
			Quantity: 4 m</td>
			<td>Masterflex, Cole Palmer</td>
			<td>RK-06422-02</td>
			<td>Line from culture vessel to gas sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, flexible, transparent 
			Imperial: ID=1/8&#34;, OD=1/4&#34; 
			Metric: ID = 3.18 mm, 0D = 6.35 mm 
			Quantity: 2 m</td>
			<td>Masterflex, Cole Palmer</td>
			<td>RK-06422-05</td>
			<td>Gas sensor standard tubing size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, rigid, transparent 
			Imperial: ID=1/16&#34;, OD=1/8&#34; 
			Metric: ID = 1.59 mm, 0D = 3.18 mm 
			Quantiy: 1 m</td>
			<td>Masterflex, Cole Palmer</td>
			<td>RK-06605-27</td>
			<td>Spans rubber stopper allowing gas to exit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, rigid, transparent 
			Imperial: ID=1/8&#34;, OD=1/4&#34; 
			Metric: ID = 3.18 mm, 0D = 6.35 mm 
			Quantity: 1 m</td>
			<td>Masterflex, Cole Palmer</td>
			<td>RK-06605-30</td>
			<td>Spans rubber stopper allowing gas to exit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zip ties, small 
			Quantity: 1 packet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Secure tube fittings</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

operation of laboratory photobioreactors with online growth measurements and customizable light regimes

O estudo laboratorial das microalgas pode ser experimentalmente desafiador. Além dos requisitos de cultivo de microrganismos não fotossintéticos, fototróficos também requerem iluminação. Rotineiramente, os pesquisadores buscam fornecer suprimentos de luz personalizados, ou seja, variar a intensidade da luz e o tempo sobre o qual é entregue. Essa flexibilidade é difícil com as luzes padrão do bancada. Geralmente, estudos de cultivo também requerem comparações de crescimento entre tratamentos experimentais. Frequentemente, o crescimento é avaliado ao longo de uma duração prolongada, por exemplo, várias vezes por dia durante um teste de uma semana. As medições manuais podem ser demoradas e falta de resolução de dados. Portanto, fotobioreatores (PBRs) com monitoramento automático de crescimento e fornecimento de luz personalizável são úteis para experimentos replicados com múltiplos tratamentos. A obra atual apresenta o projeto, construção e operação de PBRs laboratoriais. Os materiais são de origem fácil e relativamente baratos. O projeto pode ser duplicado com habilidade moderada. Cada estrutura tem uma pegada de ~40 cm2 e hospeda três garrafas de vidro 1 L para replicação triplicada. As garrafas repousam sobre plataformas que contêm agitadores magnéticos e são dispostas verticalmente dentro de um tubo de cloreto de polivinil de 1 m de altura e 15 cm de diâmetro (PVC). O interior da tubulação é forrado com diodos emissores de luz (LEDs). Estes LEDs produzem intensidades contínuas de luz de 0-2400 fótons μmol m-2 s-1 de radiação fotossintética ativa (PAR). Os usuários projetam um programa de iluminação personalizado. A intensidade da luz pode ser ajustada a cada segundo ou mantida constante por durações mais longas. O oxigênio produzido a partir da fotossíntese sai de cada garrafa através de um sensor gás volutrico unidirecionário. O software é usado para gravar dados de sensores de gás. A quantidade de oxigênio produzida pode estar correlacionada com o crescimento da biomassa. Se forem necessárias amostras de biomassa, uma seringa pode ser usada para extrair cultura. O método é adequado para microalgas cultivadas com bicarbonato como fonte de carbono. Esses PBRs são valiosos para um laboratório que requer experimentos replicados, flexibilidade de regime leve e dados contínuos de crescimento de alta resolução.

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Operation of Laboratory Photobioreactors with Online Growth Measurements and Customizable Light Regimes

Esta publicação descreve o desenho de fotobioreatores laboratoriais (PBRs) com regimes de luz personalizáveis. O crescimento de cianobactérias ou microalgas, usando bicarbonato como fonte de carbono, é monitorado continuamente pela medição da produção volumétrica de oxigênio. Esses PBRs facilitam comparações rápidas e replicadas de crescimento laboratorial com pouca intervenção do usuário durante os experimentos.

Operação de Fotobioreatores laboratoriais com Medições de Crescimento Online e Regimes de Luz Personalizáveis

The laboratory study of microalgae can be experimentally challenging. In addition to the cultivation requirements of non-photosynthetic microorganisms, ...

Este protocolo permite experimentos replicados de microalgas com pouca entrada do usuário. Ele foi projetado para pesquisadores que procuram atualizar de frascos monitorados manualmente para os frascos de bancada sem comprar reatores biológicos de fotos comerciais técnicos e caros. Este bio reator fotográfico permite a razão de luz e flexibilidade, monitoramento contínuo do crescimento e replicação triplicada.Para começar, abra o software de aquisição de dados. Preencha a página de configuração e atribua arquivos de calibração aos seus respectivos sensores. No nome do arquivo do diretório, selecione a pasta correspondente do número da porta do módulo de entrada digital.Clique na pasta atual e repita para todas as portas. Em seguida, clique em ok para passar para a página de registro. Em seguida, encha as garrafas de vidro para o volume desejado com o meio de cultivo e centrifugar a cultura do estoque em três tubos de 50 mililitros equilibrados para produzir três pelotas.Adicione uma pelota a cada garrafa usando uma pipeta sorológica e meio fresco. Em seguida, solte um agitador magnético de 25 por oito milímetros em cada garrafa antes de selar a abertura da garrafa com uma rolha de borracha e tampa de parafuso de abertura roscada. Se forem instaladas as portas de amostragem opcionais, feche as válvulas.Depois de localizar a extremidade de cada linha de gás dentro do tubo de PVC, conecte uma agulha à porta de isca de correio da válvula. Conecte cada garrafa ao seu sensor de gás perfurando cada rolha de borracha com a agulha correspondente. Em seguida, inicie cada sensor de gás individualmente verificando a caixa de marca no lado esquerdo da tela, clicando em iniciar e digitando um nome de arquivo.Clique bem e repita para todos os sensores. Em seguida, ligue o bio reator fotográfico e certifique-se de que o controlador de iluminação multiplex digital esteja conectado a uma fonte de alimentação. Usando o botão no controlador multiplex digital, alternar entre a cena do ajudante e a cena de luz personalizada para garantir que o dispositivo esteja funcionando corretamente.Para a amostragem de garrafas, prepare mais 500 mililitros do meio fresco antes de iniciar o experimento. Para coletar a amostra, feche a válvula na linha de gás e conecte uma seringa de 10 mililitros à válvula de porta de amostragem. Depois de conectar a seringa, abra a válvula de porta de amostragem e retire oito mililitros de cultura.Em seguida, feche a válvula de porta de amostragem e desconecte a seringa. Em seguida, conecte-se à seringa contendo oito mililitros de meio fresco à válvula de porta de amostragem. Em seguida, abra a válvula e injete o meio fresco.Por fim, feche a válvula de porta de amostragem e desconecte a seringa. Para exportar os dados, selecione arquivo e dados offline. Depois de selecionar todos os arquivos de log relevantes, exporte os dados para o software de planilha e salve.Um experimento bem sucedido é caracterizado por um padrão diurno intimamente replicado da produção de oxigênio. A taxa de fluxo de oxigênio age como um proxy para a taxa de crescimento de uma cultura. Durante as horas iluminadas, a produção de gás aumenta constantemente e durante horas não iluminadas, a produção de gás pára.O volume total de oxigênio produzido ao longo de quatro dias variou de 316 mililitros em tratamento De 902 mililitros em tratamento C.In 300 micro toupeiras por metro quadrado por segundo regime de luz, a temperatura aumentou em um máximo de 1,4 graus Celsius durante o dia. As temperaturas da cultura voltaram à linha de base durante a noite. Apesar de diferir em suas concentrações iniciais de biomassa, os tratamentos B e C geraram a mesma quantidade de biomassa total causando turnos idênticos em pH médio.Os dados da taxa de fluxo de oxigênio on-line revelaram que cada tratamento apresentava taxas de crescimento diária variadas, o que também se refletiu nas medições de pH duas vezes por dia. No primeiro dia, a taxa de crescimento do tratamento B foi menor do que a do tratamento C.Enquanto no terceiro dia, as taxas de crescimento do tratamento B superaram as do tratamento C.Os dados da taxa de fluxo de oxigênio indicaram que o maior crescimento ocorreu no terceiro dia de tratamento B.As estimativas de crescimento baseadas no oxigênio total medido devem subestimar ligeiramente o crescimento da biomassa, válido para cinco dos sete exemplos. Dois exemplos superestimaram o crescimento.Isso pode ter sido influenciado por experimentos sendo determinados no final da noite. A respiração noturna substancial aumenta o consumo de oxigênio, gera um vácuo de espaço na cabeça da garrafa, sugando o pacote com líquido de sensores de gás. Se a respiração pode ser alta, abrimos o espaço da cabeça durante a noite.

Research

JoVE Journal

Biology

Presynaptically Silent Synapses Studied with Light Microscopy

Sinapses pré-sináptico Silencioso Estudou com Microscopia de Luz

Synaptic plasticity likely underlies the nervous system's ability to learn and remember and may also represent an adaptability that prevents otherwise ...

Biologia

Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors

Assépticas Técnicas de Laboratório: transferências de volume com pipetas sorológicas e micropipetas

Microorganisms are everywhere - in the air, soil, and human body as well as on inanimate surfaces like laboratory benches and computer keyboards. The ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

A Câmara customizáveis ​​para a migração celular de medição

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Análise do Gap Junction-dependente Transferência de miARN com 3D-FRAP Microscopia

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

Cystometric and External Urethral Sphincter Measurements in Awake Rats with Implanted Catheter and Electrodes Allowing for Repeated Measurements

Medições de esfíncter uretral Cystometric e externo em ratos acordados com cateter implantado e eletrodos permitindo medições repetidas

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Análise do comportamento de crescimento de Arabidopsis thaliana em diferentes qualidades de luz

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

A Simple Approach to Perform TEER Measurements Using a Self-Made Volt-Amperemeter with Programmable Output Frequency

Uma aproximação simples para executar medidas de TEER usando um volt-AMPEREMETER self-made com freqüência programável da saída

Transepithelial/endothelial electrical resistance (TEER) has been used since the 1980s to determine confluency and permeability of in vitro barrier model ...

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

Análise quantitativa da taxa de crescimento de nidulans aspergillus usando microscopia ao vivo e software de código aberto

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Aplicação do movimento passivo da cabeça para gerar acelerações definidas nas cabeças dos roedores

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...