Name: direct reprogramming of mouse fibroblasts into melanocytes
Uploaded: 2021-08-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes at JoVE.com

تم دعم هذه الدراسة جزئيا من خلال منح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82070638 و 81770621) ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة جيانغسو (BK20180281).

تمت الموافقة على هذا العمل من قبل لجنة إدارة واستخدام المختبر في جامعة جيانغسو (UJS-IACUC-AP--20190305010). تم إجراء التجارب وفقا للمعايير التي وضعتها جمعية تقييم واعتماد المنظمة الدولية لرعاية المختبرات (AAALAC International). لم تكن هناك تجارب تشمل البشر ، لذلك لم يكن هذا العمل بحاجة إلى موافقة من لجنة أخلاقي...

<ol>
	<li>Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo.">Vitiligo.</a> Lancet. 386 (9988), 74-84 (2015).</li><li>Picardo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo.">Vitiligo.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15011 (2015).</li><li>Speeckaert, R., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo:+An+update+on+pathophysiology+and+treatment+options.">Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options.</a> American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).</li><li>Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo+management:+combination+of+surgical+treatment+and+phototherapy+under+reflectance+confocal+microscopy+monitoring.">Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).</li><li>Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+therapies+for+vitiligo.">Surgical therapies for vitiligo.</a> Dermatologic Clinics. 35 (2), 193-203 (2017).</li><li>Bishnoi, A., Parsad, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+molecular+aspects+of+vitiligo+treatments.">Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments.</a> International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509 (2018).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+transcription+factor-mediated+reprogramming+to+pluripotency.">A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).</li><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-based+cell+therapy-promise+and+challenges.">Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges.</a> Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).</li><li>Xu, J., Du, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming:+strategies,+mechanisms,+and+applications.">Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li><li>Gasc&#243;n, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., G&#246;tz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neuronal+reprogramming:+achievements,+hurdles,+and+new+roads+to+success.">Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success.</a> Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).</li><li>Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cellular+reprogramming+and+inner+ear+regeneration.">Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).</li><li>Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+wound-resident+cells+generates+skin+epithelial+tissue.">In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue.</a> Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).</li><li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+to+functional+melanocytes+by+defined+factors.">Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors.</a> Nature Communications. 5, 5807 (2014).</li><li>Fehrenbach, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+tumorigenic+potential+upon+transdifferentiation+from+keratinocytic+into+melanocytic+lineage.">Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage.</a> Scientific Reports. 6, 28891 (2016).</li><li>Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+extracting+RNA+and+genomic+DNA+from+archived+human+blood+and+muscle.">A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle.</a> Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).</li><li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-transcription+PCR+(RT-PCR).">Reverse-transcription PCR (RT-PCR).</a> Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).</li><li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+staining.">Immunofluorescence staining.</a> Current Protocols in Cell Biology. 69 (1), 1-7 (2015).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+vectors+for+gene-based+therapy.">Non-viral vectors for gene-based therapy.</a> Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).</li></ol>

تعد جودة الفيروس أمرا بالغ الأهمية لنجاح إعادة البرمجة المباشرة للخلايا الصباغية في هذا البروتوكول. طريقة تعبئة وتركيز الفيروسات في هذا البروتوكول بسيطة وسهلة التكرار ولا تعتمد على أي كاشف مركز مساعد. يمكن اتباع هذا البروتوكول بنجاح في معظم المختبرات. لضمان جودة الفيروس المركز ، تحتاج ا?...

البهاق هو مرض جلدي يؤثر بشكل خطير على الصحة البدنية والعقلية للأفراد المصابين. لأسباب مختلفة ، بما في ذلك تشوهات التمثيل الغذائي ، والإجهاد التأكسدي ، وتوليد الوسطاء الالتهابيين ، وانفصال الخلايا ، واستجابة المناعة الذاتية ، يتم فقدان الخلايا الصباغية الوظيفية ، ويتم إيقاف إفراز الميلانين ، مما يؤدي إلى تطور البهاق 1,2. تحدث هذه الحالة على نطاق واسع وهي مشكلة خاصة على الوجه. العلاج الرئيسي هو الاستخدام النظامي للكورتيكوستيرويدات وأجهزة المناعة. يمكن استخدام العلاج الضوئي للأمراض الجهازية أو المحلية ، وهناك علاجات جراحية ، مثل زرع الجلد المثقب وزرع الخلايا الصباغية الذاتية3،4،5. ومع ذلك ، فإن المرضى الذين يستخدمون العلاج الدوائي والعلاج الضوئي عرضة للانتكاس ، وهذه العلاجات لها آثار علاجية سيئة على المدى الطويل. العلاج الجراحي مؤلم وفعال بشكل معتدل فقط 2,6. لذلك ، هناك حاجة إلى استراتيجية علاجية جديدة وفعالة للبهاق.
إن إعادة برمجة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) تعكس هذه الخلايا من حالتها الطرفية إلى حالة متعددة القدرات ، وهي عملية تتوسط فيها عوامل النسخ ، Oct4 و Sox2 و Klf4 و c-Myc7. ومع ذلك ، نظرا لإمكانية الإصابة بالأورام ووقت الإنتاج الطويل ، فقد قوبلت هذه التكنولوجيا بالشك عند تطبيقها على الإعدادات السريرية8. إعادة البرمجة المباشرة هي تقنية تجعل نوعا واحدا من الخلايا الطرفية يتحول إلى نوع آخر من الخلايا الطرفية9. يتم تحقيق هذه العملية من خلال عوامل النسخ المناسبة. وقد تمت بالفعل إعادة برمجة خلايا مختلفة مباشرة بنجاح، بما في ذلك الخلايا العضلية القلبية10 والخلايا العصبية 11 وخلايا الشعر القوقعية12. حتى أن بعض الباحثين أعادوا برمجة أنسجة الجلد مباشرة في الموقع ، والتي يمكن استخدامها لإصلاح الجروح13. تشمل مزايا إعادة البرمجة المباشرة تقليل أوقات الانتظار والتكاليف ، وانخفاض خطر الإصابة بالسرطان ، وتقليل المشاكل الأخلاقية ، وفهم أفضل للآلية الكامنة وراء تحديد مصير الخلية9.
على الرغم من أن طريقة إعادة البرمجة المباشرة تستخدم على نطاق واسع ، إلا أنه لا توجد حاليا طريقة محددة لإعادة البرمجة المباشرة لخلايا الجلد إلى خلايا صباغية ، خاصة بسبب عوامل النسخ العديدة التي يجب مراعاتها14,15. تم استخدام عوامل النسخ ، Mitf و Sox10 و Pax3 ، لإعادة البرمجة المباشرة لخلايا الجلد إلى الخلايا الصباغية14. في المقابل ، تم استخدام مزيج من MITF و PAX3 و SOX2 و SOX9 أيضا لإعادة البرمجة المباشرة لخلايا الجلد إلى خلايا ميلانية بشرية في دراسة أخرى15. في هذا البروتوكول ، على الرغم من استخدام طريقة فحص مختلفة ، تم الحصول على نفس النتيجة مع مزيج من Mitf و Sox10 و Pax3 لإعادة البرمجة المباشرة لخلايا الجلد إلى خلايا صباغية كما هو موضح سابقا14. يمكن أن يوفر تطوير نظام لتوليد الخلايا الصباغية من خلايا الجلد الأخرى مخططا لتحويل خلايا الجلد الأخرى لمرضى البهاق إلى خلايا صباغية. وبالتالي ، من الأهمية بمكان بناء طريقة بسيطة وفعالة لإعادة البرمجة المباشرة هذه لتوليد الخلايا الصباغية بنجاح.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-062</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;M filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHVR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene round bottom tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%/100% ethanol</td>
			<td>LANBAO</td>
			<td>210106</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2786</td>
			<td>Stock concentration 40 mg/mL 
			Final concentration 24 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21137</td>
			<td>Dilution of 1:500 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics(Pen/Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRP1/TYRP1 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABC592</td>
			<td>Host/Isotype: Mouse IgG2a 
			Species reactivity: Mouse/Human 
			Dilution of 1:200 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRP2/DCT Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab74073</td>
			<td>Host/Isotype: Rabbit IgG 
			Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>Stock concentration 10 mM 
			Final concentration 3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td>Stock concentration 0.3 mg/mL 
			Final concentration 20 pM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-165-144</td>
			<td>Dilution of 1:500 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (High glucose)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C 
			Heat-inactivated before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2)</td>
			<td>Hanheng Biological Technology Co., Ltd.</td>
			<td>pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab220365</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EDN3</td>
			<td>American-Peptide</td>
			<td>88-5-10A</td>
			<td>Stock concentration 100 &#956;M 
			Final concentration 0.1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/mL 
			Final concentration 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-DOPA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9628</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Transfection reagent, stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson-Fontana staining kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G2032</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral balsam</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8590</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (-)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Stock concentration 1 mM 
			Final concentration 200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td>cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 &#956;g/&#181;L 
			Final concentration 4 ng/&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13256-029</td>
			<td>Stock concentration 4 &#956;g/mL 
			Final concentration 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human insulin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>I3536</td>
			<td>Stock concentration 10 mg/mL 
			Final concentration 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human SCF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>255-SC-010</td>
			<td>Stock concentration 200 &#956;g/mL 
			Final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1330-20-7</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct reprogramming of mouse fibroblasts into melanocytes

فقدان وظيفة الخلايا الصباغية يؤدي إلى البهاق ، مما يؤثر بشكل خطير على الصحة البدنية والعقلية للأفراد المصابين. في الوقت الحاضر ، لا يوجد علاج فعال طويل الأجل للبهاق. لذلك ، من الضروري تطوير علاج مناسب وفعال للبهاق. يبدو أن تقنية الطب التجديدي لإعادة البرمجة المباشرة لخلايا الجلد إلى خلايا صباغية هي علاج جديد واعد للبهاق. وهذا ينطوي على إعادة برمجة مباشرة من خلايا الجلد المريض إلى الخلايا الصباغية الوظيفية للمساعدة في تخفيف فقدان الخلايا الصباغية في المرضى الذين يعانون من البهاق. ومع ذلك ، يجب اختبار هذه الطريقة أولا على الفئران. على الرغم من أن إعادة البرمجة المباشرة تستخدم على نطاق واسع ، إلا أنه لا يوجد بروتوكول واضح لإعادة البرمجة المباشرة في الخلايا الصباغية. علاوة على ذلك ، فإن عدد عوامل النسخ المتاحة ساحق. 
هنا ، يتم تقديم بروتوكول نظام تغليف فيروس lentivirus المركز لإنتاج عوامل النسخ المختارة لإعادة برمجة خلايا الجلد إلى الخلايا الصباغية ، بما في ذلك Sox10 و Mitf و Pax3 و Sox2 و Sox9 و Snai2. أصيبت الخلايا الليفية الجنينية الفئران (MEFs) بفيروس lentivirus المركز لجميع عوامل النسخ هذه لإعادة البرمجة المباشرة ل MEFs إلى الخلايا الصباغية المستحثة (iMels) في المختبر. علاوة على ذلك ، تم فحص عوامل النسخ هذه ، وتم تحسين النظام لإعادة البرمجة المباشرة إلى الخلايا الصباغية. تم زيادة التعبير عن العلامات المميزة للميلانين في iMels على مستوى الجين أو البروتين بشكل كبير. تشير هذه النتائج إلى أن إعادة البرمجة المباشرة للخلايا الليفية إلى الخلايا الصباغية يمكن أن تكون استراتيجية علاجية جديدة ناجحة للبهاق وتؤكد آلية تطور الخلايا الصباغية ، والتي ستوفر الأساس لمزيد من إعادة البرمجة المباشرة للخلايا الليفية إلى الخلايا الصباغية في الجسم الحي.

تتضمن هذه المقالة بروتوكولات نظام تغليف فيروس lentivirus المركز لإنتاج lentivirus من عوامل النسخ لإعادة البرمجة المباشرة للخلايا الليفية إلى الخلايا الصباغية وبروتوكولات لفحص عوامل النسخ وإعادة البرمجة المباشرة للخلايا الصباغية من MEFs.
تم تقييم نجاح إنتاج فيروس lentivirus المركز من خلا...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes at JoVE.com

Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes

هنا ، نصف نظام إعادة برمجة مباشر محسن للخلايا الصباغية ونظام تعبئة فيروسات عالي الكفاءة ومركز يضمن إعادة برمجة مباشرة سلسة.

إعادة البرمجة المباشرة للخلايا الليفية للفأر في الخلايا الصباغية

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, ...

تم الإبلاغ عن إعادة برمجة مباشرة لتوليد الخلايا الصباغية. ومع ذلك ، يتم استخدام عوامل النسخ المختلفة في دراسات مختلفة. في هذا البروتوكول ، قمنا بالتحقق من صحة وتقليل عدد عوامل النسخ مع كفاءة إعادة برمجة أعلى.أنشأنا نظام إعادة برمجة مباشر لتوليد الخلايا الصباغية باستخدام ثلاثة عوامل نسخ فقط ، Mitf و Sox10 و PAX3 ، وعدلنا نظام الثقافة لجعله أكثر استقرارا وقوة. كيفية تجديد الخلايا الصباغية الوظيفية هو سؤال مهم قد يساعد في معالجة قيود العلاج لأمراض التصبغ مثل البهاق. توفر إعادة البرمجة الصحيحة مستقبلا تتميز تقنيتنا بخصائص الراحة وقابلية التشغيل القوية والاستقرار ، والتي يسهل الترويج لها وتكرارها.لبدء إنتاج الفيروس الليفي المركز ، قم بصفيحة 1.5 مرة 10 إلى 6 خلايا HEK-293T في طبق 60 ملم ، وزرع الخلايا ذات الوسط الطبيعي عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. بعد 24 ساعة من الحضانة ، عندما تصل خلايا HEK-293T إلى 80 إلى 90٪ من الالتقاء ، استبدل الوسط ب 3.5 مل من DMEM ، ثم احتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين. بعد إزالة الخلايا من الحاضنة ، استبدل الوسط ب DMEM يحتوي على 2٪ FBS ، وأضف خليط مجمع النقل الطازج إلى الخلايا بطريقة قطرة.اخلطي الخليط السائل بلطف. عند الانتهاء من ثماني ساعات ، قم بتغيير وسط الخلية ب 3.5 مل من الوسط الطبيعي. جمع supernatant الفيروس في 24 و 48 ساعة.بعد ذلك ، امزج المواد الفائقة للفيروس التي تم جمعها في نقطتين زمنيتين مختلفتين وقم بالطرد المركزي للخليط عند 200 xg لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم مرر السوبرناتانت الذي تم جمعه من خلال مرشحات 0.45 ميكرون لجمع الترشيح في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل. ركز الفيروس الفائق المصفى عن طريق الطرد المركزي عند 6،000 xg عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.بمجرد الانتهاء من ذلك ، تأكد من أن حبيبات الفيروس مرئية في الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي. صب من supernatant ببطء. لإذابة بيليه الفيروس في الوسط الطبيعي مع واحد في 100 * حجم من supernatant الفيروس.استخدم ماصة P1000 الدقيقة للماصة لأعلى ولأسفل بلطف حتى يتم الحصول على خليط فيروسات مركز متجانس 100x. قسم الفيروس المركز إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة لتخزينها عند 80 درجة مئوية. لوحة 1 في 10 إلى خلايا HEK-293T 5th في بئر واحد من لوحة من ستة آبار.استزرع هذه الخلايا مع الوسط الطبيعي عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. بعد 24 ساعة ، أضف 0.1 إلى 0.2 ميكرولتر من فيروس الفلورسنت المركز 100x إلى كل بئر. يليه إضافة أربعة نانوغرام لكل ميكرولتر من كاشف النقل البوليمري الكاتيوني إلى كل بئر.بعد حوالي ثماني إلى اثنتي عشرة ساعة من الإصابة بالفيروس ، استبدل الوسط بالوسط العادي. في ثماني وأربعين ساعة بعد الإصابة ، اغسل الطبق ب 1 مل من PBS المعقم لإزالة الخلايا الميتة. ثم التربسين الخلايا باستخدام 250 ميكرولتر من محلول 0.05٪ من التربسين-EDTA لكل بئر من صفيحة من ستة آبار في درجة حرارة الغرفة.الطرد المركزي للصفيحة عند 200 xg لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد إزالة السوبرناتانت ، أعد تعليق حبيبة الخلية في مل واحد من PBS وأضف تعليق الخلية إلى أنبوب مستدير القاع من البوليسترين سعة خمسة مل. ثم ضع الأنبوب في مقياس التدفق الخلوي لتحليل العينة.لإعادة البرمجة المباشرة للخلايا الليفية ، قم بتغطية بئر واحد من صفيحة زراعة الخلايا المكونة من ستة آبار بمحلول 1 مل من محلول الجيلاتين بنسبة 0.1٪ في درجة حرارة الغرفة. بعد 15 إلى 30 دقيقة ، عندما يتم تغطية البئر بالكامل بالجيلاتين ، قم بشفط محلول الجيلاتين بنسبة 0.1٪. بعد ذلك ، قم بلوحة 5 مرات 10 إلى الخلايا الليفية الجنينية الرابعة للفأر ، أو MEFs ، في بئر واحد من صفيحة من ستة آبار مغلفة ب 0.1٪ من الجيلاتين ، وزرع الخلايا بين عشية وضحاها مع الوسط الطبيعي عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.بعد 24 ساعة ، عندما تصل MEFs إلى 40 إلى 50٪ من الالتقاء ، استبدل الوسط بالوسط العادي. بعد ذلك ، قم بإذابة الفيروس المتجمد المركز على الجليد. احسب حجم الفيروس المراد إضافته باستخدام المعادلة ثم أضف الفيروس المركز لعوامل النسخ الستة إلى كل بئر ، وفقا للحجم المحسوب.أضف أربعة ميكروغرام لكل مل من عامل النقل البوليمري الكاتيوني إلى البئر. اعتبره اليوم صفر من عدوى الفيروس العاهري. في اليوم الأول ، بعد 8 إلى 12 ساعة من الإصابة ، استبدل الوسط الذي يحتوي على الفيروس بالوسط الطبيعي الطازج ، مع إضافة 0.5 ميكروغرام لكل مل بورومايسين لفحص خطوط الخلايا المصابة المستقرة.في اليوم الثاني ، بعد 48 ساعة من الإصابة ، استبدل الوسط الفائق تدريجيا بوسيط إعادة البرمجة. تغيير ربع الحجم المتوسط الكلي قبل إضافة ثلاثة ميكرومولار CHIR99021. من اليوم الثالث إلى اليوم السابع ، اعتمادا على حالة الخلايا ، قم بتغيير الوسط عن طريق استبداله تدريجيا بنسبة أعلى من وسيط إعادة البرمجة للتبديل إلى وسيط إعادة البرمجة الكامل في غضون خمسة أيام.بعد ذلك ، افصل الخلايا ب 500 ميكرولتر من الإنزيم الهضمي التريبسين-EDTA بنسبة 0.05٪ لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. عندما تطفو ما يقرب من ستين في المئة من الخلايا ، توقف عن الهضم عن طريق إضافة الوسط الطبيعي ، مرتين من حجم الإنزيم الهضمي. اجمع تعليق الخلية في أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مل لجهاز الطرد المركزي عند 200 xg لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.قم بإزالة supernatant قبل إعادة تعليق بيليه الخلية باستخدام وسيط إعادة البرمجة. عند الانتهاء، قم بطبق الخلايا المعاد تعليقها في طبق معقم بقطر 60 ملم. استزرع الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطوبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.بعد ثمان وأربعين ساعة من الإصابة بفيروس lentivirus في خلايا HEK-293T ، تم تقييم نجاح إنتاج فيروس lentivirus المركز من خلال مراقبة كثافة التألق في GFP أو عن طريق قياس التدفق الخلوي. تم العثور على عيار الفيروس المركز ليكون مرتفعا عند 10 إلى 8th TU / mL. أثناء إعادة البرمجة المباشرة للخلايا الليفية ، تغير مورفولوجيا الخلية تدريجيا إلى مشبك خلوي ممدود ونوى خلية موسعة.ومع ذلك ، فإن الخلايا التي تتقدم في العمر تدريجيا بعد اليوم العشرين. أدت إزالة عوامل النسخ ، Mitf أو Pax3 أو Sox10 ، إلى إسكات التعبير عن جينات الخلايا الصباغية ، Tyr ، Tyrp1 ، و Mlana ، مما يشير إلى أكبر تأثير على تحويل الخلايا الليفية إلى الخلايا الصباغية. وبالتالي ، كان التعبير عن جينات الخلايا الصباغية الناجمة عن البرمجة المباشرة مع ثلاثة عوامل نسخ أعلى بالمقارنة مع ستة عوامل نسخ.لتحديد الخلايا الصباغية التي يسببها MEF ، أو iMels ، تم الكشف عن علامات الخلايا الصباغية ، TYRP1 و DCT باستخدام تلطيخ الفلورسنت المناعي. علاوة على ذلك ، أظهرت طرق التلطيخ الخاصة بالميلانين مثل DOPA و Masson-Fontana نتائج إيجابية. يجب توزيع الخلايا 293T بالتساوي.أيضا ، يجب أن تتم إضافة خليط النقل إلى الخلايا بلطف لمنع الخلايا من الطفو. البروتوكول مستقر وعملي ويمكن استخدامه لإعادة برمجة أنواع أخرى من الخلايا. وتتوقع أن توفر مرجعا واستراتيجية لإعادة البرمجة المباشرة في الجسم الحي في تجديد الخلايا الصباغية في الطب المستقبلي.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Developmental Biology

Unit 1

The Integumentary System

SCIENTISTS IN ACTION

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

مستقر وكفاءة التحوير الوراثي للخلايا في الكبار ماوس V-SVZ لتحليل العصبية الخلايا الجذعية الذاتية الحكم والآثار لغير المتمتعة بالحكم الذاتي

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

طرق لنقل المترجمة على وجه التحديد من الخلايا أو الحمض النووي في Postimplantation المبكر أجنة الفئران

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

اشتقاق خالية المغذية من الخلايا الصباغية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

الحركية قياس وفي الوقت الحقيقي التصور من إعادة برمجة الجسدية

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

بروتوكول التحويل المباشر من الفئران الجنينية الخلايا الليفية إلى الخلايا الجذعية الأرومة الغاذية

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

إعادة برمجة الخلايا الليفية الفأر الجنينية مع عوامل النسخ للحث على برنامج مكون للدم

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

إنشاء خلايا التكاثري رباعي الصيغة الصبغية من Nontransformed الخلايا الليفية الإنسان

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

إعادة برمجة خلايا المشروطة للأطفال الإنسان المريء طلائي للاستخدام في هندسة الأنسجة وأمراض التحقيق

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

تقييم Cardiomyocyte الأنواع الفرعية بعد إعادة برمجة بوساطة عامل النسخ من الفأر الجنينية الخلايا الليفية

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

إعادة برمجة الابتدائي السائل السلوى وغشاء الخلايا بلوريبوتينسي في ظروف خالية من كرة

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...