Name: direct reprogramming of mouse fibroblasts into melanocytes
Uploaded: 2021-08-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes at JoVE.com

Denne undersøgelse blev delvist støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (82070638 and 81770621) og Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20180281).

Dette arbejde blev godkendt af Laboratory Animal Management and Use Committee ved Jiangsu University (UJS-IACUC-AP--20190305010). Forsøgene blev udført i nøje overensstemmelse med de standarder, der er fastlagt af Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International). Der var ingen eksperimenter, der involverede mennesker, så dette arbejde behøvede ikke godkendelse fra den humane forskningsetiske komité. Se materialetabellen for detaljer om reag...

<ol>
	<li>Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo.">Vitiligo.</a> Lancet. 386 (9988), 74-84 (2015).</li><li>Picardo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo.">Vitiligo.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15011 (2015).</li><li>Speeckaert, R., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo:+An+update+on+pathophysiology+and+treatment+options.">Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options.</a> American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).</li><li>Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo+management:+combination+of+surgical+treatment+and+phototherapy+under+reflectance+confocal+microscopy+monitoring.">Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).</li><li>Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+therapies+for+vitiligo.">Surgical therapies for vitiligo.</a> Dermatologic Clinics. 35 (2), 193-203 (2017).</li><li>Bishnoi, A., Parsad, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+molecular+aspects+of+vitiligo+treatments.">Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments.</a> International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509 (2018).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+transcription+factor-mediated+reprogramming+to+pluripotency.">A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).</li><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-based+cell+therapy-promise+and+challenges.">Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges.</a> Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).</li><li>Xu, J., Du, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming:+strategies,+mechanisms,+and+applications.">Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li><li>Gasc&#243;n, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., G&#246;tz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neuronal+reprogramming:+achievements,+hurdles,+and+new+roads+to+success.">Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success.</a> Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).</li><li>Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cellular+reprogramming+and+inner+ear+regeneration.">Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).</li><li>Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+wound-resident+cells+generates+skin+epithelial+tissue.">In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue.</a> Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).</li><li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+to+functional+melanocytes+by+defined+factors.">Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors.</a> Nature Communications. 5, 5807 (2014).</li><li>Fehrenbach, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+tumorigenic+potential+upon+transdifferentiation+from+keratinocytic+into+melanocytic+lineage.">Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage.</a> Scientific Reports. 6, 28891 (2016).</li><li>Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+extracting+RNA+and+genomic+DNA+from+archived+human+blood+and+muscle.">A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle.</a> Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).</li><li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-transcription+PCR+(RT-PCR).">Reverse-transcription PCR (RT-PCR).</a> Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).</li><li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+staining.">Immunofluorescence staining.</a> Current Protocols in Cell Biology. 69 (1), 1-7 (2015).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+vectors+for+gene-based+therapy.">Non-viral vectors for gene-based therapy.</a> Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).</li></ol>

Virusets kvalitet er afgørende for succesen med direkte omprogrammering til melanocytter i denne protokol. Metoden til emballering og koncentration af vira i denne protokol er enkel og nem at gentage og er ikke afhængig af noget andet hjælpekoncentreret reagens. Denne protokol kan følges med succes i de fleste laboratorier. For at sikre kvaliteten af den koncentrerede virus kræver følgende punkter særlig opmærksomhed. Den ene er cellestatus for HEK-293T. Selvom HEK-293T-celler er udødeliggjorte celler, skal cell...

Vitiligo er en hudsygdom, der alvorligt påvirker de berørte personers fysiske og mentale sundhed. Af forskellige årsager, herunder metaboliske abnormiteter, oxidativ stress, generering af inflammatoriske mediatorer, celleafløsning og autoimmun respons, går de funktionelle melanocytter tabt, og udskillelsen af melanin stoppes, hvilket fører til udvikling af vitiligo 1,2. Denne tilstand forekommer bredt og er særlig problematisk i ansigtet. Den vigtigste behandling er den systemiske anvendelse af kortikosteroider og immunmodulatorer. Fototerapi kan bruges til systemiske eller lokale sygdomme, og der er kirurgiske behandlinger, såsom perforeret hudtransplantation og autolog melanocyttransplantation 3,4,5. Patienter, der bruger lægemiddelterapi og fototerapi, er imidlertid tilbøjelige til tilbagefald, og disse behandlinger har dårlige langsigtede terapeutiske virkninger. Kirurgisk behandling er traumatisk og kun moderat effektiv 2,6. Derfor er der behov for en ny og effektiv terapeutisk strategi for vitiligo.
Omprogrammeringen af inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) vender disse celler fra deres terminale tilstand til en pluripotent tilstand, en proces medieret af transkriptionsfaktorerne, Oct4, Sox2, Klf4 og c-Myc7. På grund af muligheden for tumorigenicitet og den lange produktionstid er denne teknologi imidlertid blevet mødt med skepsis, når den anvendes på kliniske indstillinger8. Direkte omprogrammering er en teknologi, der får en type terminalcelle til at omdanne til en anden type terminalcelle9. Denne proces opnås ved hjælp af egnede transkriptionsfaktorer. Forskellige celler er allerede blevet direkte omprogrammeret med succes, herunder kardiomyocytter10, neuroner11 og cochlear hårceller12. Nogle forskere har endda omprogrammeret hudvæv direkte in situ, som kan bruges til sårreparation13. Fordelene ved direkte omprogrammering omfatter reducerede ventetider og omkostninger, lavere risiko for kræft, færre etiske problemer og en bedre forståelse af den mekanisme, der ligger til grund for bestemmelse af celleskæbne9.
Selv om den direkte omprogrammeringsmetode anvendes i vid udstrækning, er der i øjeblikket ingen bestemt metode til direkte omprogrammering af hudceller til melanocytter, især på grund af de mange transkriptionsfaktorer, der skal betragtes som14,15. Transkriptionsfaktorerne, Mitf, Sox10 og Pax3, er blevet brugt til direkte omprogrammering af hudceller til melanocytter14. I modsætning hertil er kombinationen af MITF, PAX3, SOX2 og SOX9 også blevet brugt til direkte omprogrammering af hudceller til humane melanocytter i en anden undersøgelse15. I denne protokol blev det samme resultat opnået med kombinationen af Mitf, Sox10 og Pax3 til direkte omprogrammering af hudceller til melanocytter som beskrevet tidligere14. Udvikling af et system til at generere melanocytter fra andre hudceller kan give en ordning for omdannelse af andre hudceller af vitiligo-patienter til melanocytter. Derfor er det afgørende at konstruere en enkel og effektiv metode til denne direkte omprogrammering for at generere melanocytter med succes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-062</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;M filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHVR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene round bottom tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%/100% ethanol</td>
			<td>LANBAO</td>
			<td>210106</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2786</td>
			<td>Stock concentration 40 mg/mL 
			Final concentration 24 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21137</td>
			<td>Dilution of 1:500 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics(Pen/Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRP1/TYRP1 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABC592</td>
			<td>Host/Isotype: Mouse IgG2a 
			Species reactivity: Mouse/Human 
			Dilution of 1:200 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRP2/DCT Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab74073</td>
			<td>Host/Isotype: Rabbit IgG 
			Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>Stock concentration 10 mM 
			Final concentration 3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td>Stock concentration 0.3 mg/mL 
			Final concentration 20 pM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-165-144</td>
			<td>Dilution of 1:500 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (High glucose)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C 
			Heat-inactivated before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2)</td>
			<td>Hanheng Biological Technology Co., Ltd.</td>
			<td>pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab220365</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EDN3</td>
			<td>American-Peptide</td>
			<td>88-5-10A</td>
			<td>Stock concentration 100 &#956;M 
			Final concentration 0.1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/mL 
			Final concentration 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-DOPA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9628</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Transfection reagent, stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson-Fontana staining kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G2032</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral balsam</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8590</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (-)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Stock concentration 1 mM 
			Final concentration 200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td>cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 &#956;g/&#181;L 
			Final concentration 4 ng/&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13256-029</td>
			<td>Stock concentration 4 &#956;g/mL 
			Final concentration 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human insulin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>I3536</td>
			<td>Stock concentration 10 mg/mL 
			Final concentration 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human SCF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>255-SC-010</td>
			<td>Stock concentration 200 &#956;g/mL 
			Final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1330-20-7</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct reprogramming of mouse fibroblasts into melanocytes

Tabet af funktion af melanocytter fører til vitiligo, som alvorligt påvirker de berørte individers fysiske og mentale sundhed. I øjeblikket er der ingen effektiv langsigtet behandling for vitiligo. Derfor er det bydende nødvendigt at udvikle en bekvem og effektiv behandling af vitiligo. Regenerativ medicin teknologi til direkte omprogrammering af hudceller til melanocytter synes at være en lovende ny behandling af vitiligo. Dette indebærer direkte omprogrammering af patientens hudceller til funktionelle melanocytter for at hjælpe med at forbedre tabet af melanocytter hos patienter med vitiligo. Denne metode skal dog først testes på mus. Selvom direkte omprogrammering er meget udbredt, er der ingen klar protokol til direkte omprogrammering til melanocytter. Desuden er antallet af tilgængelige transkriptionsfaktorer overvældende. 
Her præsenteres en koncentreret lentivirusemballagesystemprotokol til fremstilling af transkriptionsfaktorer valgt til omprogrammering af hudceller til melanocytter, herunder Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 og Snai2. Museembryonale fibroblaster (MEF'er) blev inficeret med det koncentrerede lentivirus for alle disse transkriptionsfaktorer til direkte omprogrammering af MEF'erne til inducerede melanocytter (iMels) in vitro. Desuden blev disse transkriptionsfaktorer screenet, og systemet blev optimeret til direkte omprogrammering til melanocytter. Ekspressionen af de karakteristiske markører for melanin i iMels på gen- eller proteinniveau blev signifikant forøget. Disse resultater tyder på, at direkte omprogrammering af fibroblaster til melanocytter kan være en vellykket ny terapeutisk strategi for vitiligo og bekræfte mekanismen for melanocytudvikling, hvilket vil danne grundlag for yderligere direkte omprogrammering af fibroblaster til melanocytter in vivo.

Denne artikel indeholder protokollerne for et koncentreret lentivirusemballagesystem til fremstilling af lentivirus af transkriptionsfaktorer til direkte omprogrammering af fibroblaster til melanocytter og protokoller til screening for transkriptionsfaktorer og direkte omprogrammering af melanocytter fra MEF'er.
Succesen med koncentreret lentivirusproduktion blev evalueret ved at observere fluorescensintensiteten af GFP (figur 1A) eller ved flowcytometri (<strong ...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes at JoVE.com

Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes

Her beskriver vi et optimeret direkte omprogrammeringssystem til melanocytter og et højeffektivt, koncentreret virusemballagesystem, der sikrer jævn direkte omprogrammering.

Direkte omprogrammering af musefibroblaster til melanocytter

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, ...

Direkte omprogrammering for at generere melanocytter er blevet rapporteret. Imidlertid anvendes forskellige transkriptionsfaktorer i forskellige undersøgelser. I denne protokol validerede og reducerede vi transkriptionsfaktornummeret stadig med højere omprogrammeringseffektivitet.Vi etablerede et direkte omprogrammeringssystem til at generere melanocytter ved hjælp af kun tre transkriptionsfaktorer, Mitf, Sox10 og PAX3, og ændrede kultursystemet for at gøre det mere stabilt og robust. Hvordan man regenererer funktionelle melanocytter er et væsentligt spørgsmål, der kan hjælpe med at løse terapibegrænsninger for depigmenteringssygdomme som vitiligo. Den rigtige omprogrammering giver et prospektiv Vores teknik har egenskaberne bekvemmelighed, stærk betjeningsevne og stabilitet, som er lettere at fremme og gentage.For at starte produktionen af det koncentrerede lentivirus, plade 1,5 gange 10 til de 6 HEK-293T celler i en 60 millimeter skål, og kultur cellerne med normalt medium ved 37 grader Celsius i en befugtet inkubator med 5% kuldioxid. Efter 24 timer efter inkubationen, når HEK-293T-cellerne har nået 80 til 90% sammenløb, skal du udskifte mediet med 3,5 ml DMEM og derefter inkubere cellerne ved 37 grader Celsius i en befugtet inkubator med 5% kuldioxid i to timer. Efter fjernelse af cellerne fra inkubatoren skal du udskifte mediet med DMEM indeholdende 2% FBS og tilsætte den frisklavede transfektionskompleksblanding til cellerne på en dråbevis måde.Bland den flydende blanding forsigtigt. Efter afslutningen af otte timer ændres cellemediet med 3,5 ml normalt medium. Saml virus supernatanten efter 24 og 48 timer.Bland derefter virussupernatanterne opsamlet på to forskellige tidspunkter og centrifuger blandingen ved 200 xg i fem minutter ved fire grader Celsius. Før derefter den opsamlede supernatant gennem 0,45 mikron filtre for at opsamle filtratet i et 50 ml sterilt konisk rør. Koncentrer den filtrerede virus supernatant ved centrifugering ved 6.000 xg ved fire grader Celsius natten over.Når det er gjort, skal du sikre dig, at viruspillen er synlig i bunden af det koniske rør. Hæld supernatanten langsomt ud. Til opløsning af viruspellet i det normale medium med et med 100. * volumen af virussupernatanten.Brug en P1000 mikropipette til at pipettere forsigtigt op og ned, indtil der opnås en homogen 100x koncentreret virusblanding. Opdel den koncentrerede virus i mikrocentrifugerørene for at opbevare ved 80 grader Celsius. Plade 1 gange 10 til 5. HEK-293T celler i en brønd af en seks-brønd plade.Kultur disse celler med det normale medium ved 37 grader Celsius i en befugtet inkubator med 5% kuldioxid. Efter 24 timer tilsættes 0,1 til 0,2 mikroliter af 100x fluorescerende koncentreret virus til hver brønd. Efterfulgt af tilsætning af fire nanogram pr. mikroliter af det kationiske polymertransfektionsreagens til hver brønd.Cirka otte til tolv timer efter infektion med virussen skal du erstatte mediet med det normale medium. Ved otteogfyrre timer efter infektion vaskes skålen med 1 ml steril PBS for at fjerne de døde celler. Prøv derefter cellerne ved hjælp af 250 mikroliter 0,05% trypsin-EDTA-opløsning pr. Brønd af en seks-brøndplade ved stuetemperatur.Pladen centrifugeres ved 200 xg i fem minutter ved fire grader Celsius. Efter fjernelse af supernatanten suspenderes cellepillen igen i en ml PBS og tilsættes cellesuspensionen til et fem ml polystyren rundbundet rør. Anbring derefter røret i flowcytometeret for at analysere prøven.Til direkte omprogrammering af fibroblaster skal du belægge en brønd af en seks-brønd cellekulturplade med 1 ml 0,1% gelatineopløsning ved stuetemperatur. Efter 15 til 30 minutter, når brønden er helt dækket med gelatinen, aspireres 0,1% gelatineopløsning. Dernæst plade 5 gange 10 til den 4. mus embryonale fibroblaster eller MEF'er i en brønd af en seks-brøndplade belagt med 0,1% gelatine og kultur cellerne natten over med det normale medium ved 37 grader Celsius i en befugtet inkubator med 5% kuldioxid.Efter 24 timer, når MEF'erne har nået 40 til 50% sammenløb, skal du erstatte mediet med det normale medium. Smelt derefter den frosne, koncentrerede virus på is. Beregn volumenet af den virus, der skal tilsættes ved hjælp af ligning, og tilsæt derefter den koncentrerede virus for de seks transkriptionsfaktorer til hver brønd i henhold til det beregnede volumen.Der tilsættes fire mikrogram pr. ml af det kationiske polymertransfektionsmiddel til brønden. Betragt det som dag nul af lentivirusinfektionen. På dag ét, efter 8 til 12 timers infektion, skal du erstatte mediet indeholdende virussen med det friske normale medium, mens der tilsættes 0,5 mikrogram pr. Ml puromycin for at screene stabile inficerede cellelinjer.På dag to, 48 timer efter infektion, skal supernatantmediet udskiftes gradvist med omprogrammeringsmediet. Skift en fjerdedel af det samlede mediumvolumen, før du tilføjer tre mikromolære CHIR99021. Fra dag tre til dag syv, afhængigt af cellernes tilstand, skal du ændre mediet ved gradvist at erstatte det med en højere andel af omprogrammeringsmediet for at skifte til det komplette omprogrammeringsmedium inden for fem dage.Løsrive derefter cellerne med 500 mikroliter af 0,05% trypsin-EDTA fordøjelsesenzym i tre minutter ved stuetemperatur. Når cirka tres procent af cellerne er flydt op, skal du stoppe fordøjelsen ved at tilføje det normale medium, to gange volumenet af fordøjelsesenzymet. Cellesuspensionen opsamles i et 15 ml sterilt konisk rør for at centrifugere ved 200 xg i fem minutter ved fire grader Celsius.Fjern supernatanten, før cellepillen suspenderes igen med omprogrammeringsmediet. Når du er færdig, skal du lægge de genophængte celler i en 60 millimeter steril skål. Kultur cellerne ved 37 grader Celsius i en befugtet 5% kuldioxid inkubator.Efter otteogfyrre timers lentivirusinfektion i HEK-293T-celler blev succesen med koncentreret lentivirusproduktion evalueret ved at observere fluorescensintensiteten af GFP eller ved flowcytometri. Titeren af den koncentrerede virus viste sig at være høj ved 10 til 8. TU / ml. Under den direkte omprogrammering af fibroblasterne ændrede cellemorfologien gradvist til langstrakt cellesynaps og forstørrede cellekerner.Imidlertid ældes cellerne gradvist efter dag tyve. Fjernelse af transkriptionsfaktorerne, Mitf, Pax3 eller Sox10, resulterede i dæmpning af ekspressionen af melanocytiske gener, Tyr, Tyrp1 og Mlana, hvilket indikerer den største indvirkning på fibroblastkonvertering til melanocytter. Derfor var ekspressionen af melanocytiske gener induceret af den direkte programmering med tre transkriptionsfaktorer højere sammenlignet med seks transkriptionsfaktorer.For at identificere MEF-inducerede melanocytter eller iMels blev ekspressionen af melanocytiske markører, TYRP1 og DCT detekteret ved anvendelse af immunofluorescerende farvning. Desuden viste de melaninspecifikke farvningsmetoder som DOPA og Masson-Fontana farvning positive resultater. 293T-cellerne skal fordeles jævnt.Tilsætningen af transfektionsblanding til celler skal også udføres forsigtigt for at forhindre cellerne i at flyde. Protokollen er stabil og praktisk, og den kan bruges til at omprogrammere andre typer celler. Det forventer at give en reference og en strategi for in vivo direkte omprogrammering i melanocytter regenerering i fremtidig medicin.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Developmental Biology

Unit 1

The Integumentary System

SCIENTISTS IN ACTION

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Stabil og effektiv genetisk modificering af celler i Voksen Mouse V-SVZ til analyse af neural stamcelle selvstyrende og ikke-selvstændige effekter

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Metoder til Præcist Lokaliseret Overførsel af Celler eller DNA i Early implantation museembryoer

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-fri Udledning af melanocytter fra menneskelige pluripotente stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Kinetic Måling og Real Time Visualisering af Somatisk Omprogrammering

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Protokol til direkte omdannelse af murine embryonale fibroblaster i trofoblasten Stamceller

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Omprogrammering mus embryonale fibroblaster med transkriptionsfaktorer at fremkalde en Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Etablering af proliferativ Tetraploide Celler fra transformerede humane fibroblaster

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

Betinget Omprogrammering af Pediatric Menneskelig Esophageal epitelceller til brug i Tissue Engineering og Sygdom Investigation

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Vurdering cardiomyocyte undertyper Efter Transcription Factor-medieret Omprogrammering af Mouse Embryonale fibroblaster

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Omprogrammering primære fostervand og membran celler til Pluripotency i Xeno-fri betingelser

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...