Name: direct reprogramming of mouse fibroblasts into melanocytes
Uploaded: 2021-08-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes at JoVE.com

Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (82070638 and 81770621) en de Natural Science Foundation van de provincie Jiangsu (BK20180281).

Dit werk werd goedgekeurd door het Laboratory Animal Management and Use Committee aan de Jiangsu University (UJS-IACUC-AP--20190305010). De experimenten werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de normen die zijn vastgesteld door de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International). Er waren geen experimenten met mensen, dus dit werk had geen goedkeuring nodig van de ethische commissie voor menselijk onderzoek. Raadpleeg de tabel met materialen</st...

<ol>
	<li>Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo.">Vitiligo.</a> Lancet. 386 (9988), 74-84 (2015).</li><li>Picardo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo.">Vitiligo.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15011 (2015).</li><li>Speeckaert, R., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo:+An+update+on+pathophysiology+and+treatment+options.">Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options.</a> American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).</li><li>Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo+management:+combination+of+surgical+treatment+and+phototherapy+under+reflectance+confocal+microscopy+monitoring.">Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).</li><li>Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+therapies+for+vitiligo.">Surgical therapies for vitiligo.</a> Dermatologic Clinics. 35 (2), 193-203 (2017).</li><li>Bishnoi, A., Parsad, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+molecular+aspects+of+vitiligo+treatments.">Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments.</a> International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509 (2018).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+transcription+factor-mediated+reprogramming+to+pluripotency.">A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).</li><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-based+cell+therapy-promise+and+challenges.">Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges.</a> Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).</li><li>Xu, J., Du, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming:+strategies,+mechanisms,+and+applications.">Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li><li>Gasc&#243;n, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., G&#246;tz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neuronal+reprogramming:+achievements,+hurdles,+and+new+roads+to+success.">Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success.</a> Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).</li><li>Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cellular+reprogramming+and+inner+ear+regeneration.">Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).</li><li>Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+wound-resident+cells+generates+skin+epithelial+tissue.">In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue.</a> Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).</li><li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+to+functional+melanocytes+by+defined+factors.">Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors.</a> Nature Communications. 5, 5807 (2014).</li><li>Fehrenbach, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+tumorigenic+potential+upon+transdifferentiation+from+keratinocytic+into+melanocytic+lineage.">Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage.</a> Scientific Reports. 6, 28891 (2016).</li><li>Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+extracting+RNA+and+genomic+DNA+from+archived+human+blood+and+muscle.">A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle.</a> Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).</li><li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-transcription+PCR+(RT-PCR).">Reverse-transcription PCR (RT-PCR).</a> Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).</li><li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+staining.">Immunofluorescence staining.</a> Current Protocols in Cell Biology. 69 (1), 1-7 (2015).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+vectors+for+gene-based+therapy.">Non-viral vectors for gene-based therapy.</a> Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).</li></ol>

De kwaliteit van het virus is cruciaal voor het succes van directe herprogrammering naar melanocyten in dit protocol. De methode voor het verpakken en concentreren van virussen in dit protocol is eenvoudig en gemakkelijk te herhalen en is niet afhankelijk van een ander hulpgeconcentreerd reagens. Dit protocol kan in de meeste laboratoria met succes worden gevolgd. Om de kwaliteit van het geconcentreerde virus te waarborgen, hebben de volgende punten speciale aandacht nodig. Een daarvan is de celstatus van HEK-293T. Hoewe...

Vitiligo is een huidziekte die de fysieke en mentale gezondheid van de getroffen personen ernstig beïnvloedt. Om verschillende redenen, waaronder metabole afwijkingen, oxidatieve stress, generatie van ontstekingsmediatoren, celloslating en auto-immuunrespons, gaan de functionele melanocyten verloren en wordt de afscheiding van melanine gestopt, wat leidt tot de ontwikkeling van vitiligo 1,2. Deze aandoening komt veel voor en is bijzonder problematisch op het gezicht. De belangrijkste behandeling is het systemisch gebruik van corticosteroïden en immunomodulatoren. Fototherapie kan worden gebruikt voor systemische of lokale ziekten en er zijn chirurgische behandelingen, zoals geperforeerde huidtransplantatie en autologe melanocytentransplantatie 3,4,5. Patiënten die medicamenteuze therapie en fototherapie gebruiken, zijn echter vatbaar voor terugval en deze behandelingen hebben slechte therapeutische effecten op de lange termijn. Chirurgische behandeling is traumatisch en slechts matig effectief 2,6. Daarom is een nieuwe en effectieve therapeutische strategie nodig voor vitiligo.
De herprogrammering van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) keert deze cellen om van hun terminale toestand naar een pluripotente toestand, een proces gemedieerd door de transcriptiefactoren Oct4, Sox2, Klf4 en c-Myc7. Vanwege de mogelijkheid van tumorigeniciteit en de lange productietijd is deze technologie echter met scepsis ontvangen wanneer deze wordt toegepast op klinische omgevingen8. Directe herprogrammering is een technologie die het ene type terminalcel laat transformeren in een ander type terminalcel9. Dit proces wordt bereikt door geschikte transcriptiefactoren. Verschillende cellen zijn al direct met succes geherprogrammeerd, waaronder cardiomyocyten10, neuronen11 en cochleaire haarcellen12. Sommige onderzoekers hebben zelfs huidweefsel direct in situ geherprogrammeerd, dat kan worden gebruikt voor wondherstel13. De voordelen van directe herprogrammering zijn onder meer kortere wachttijden en kosten, een lager risico op kanker, minder ethische problemen en een beter begrip van het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de bepaling van het lot van cellen9.
Hoewel de directe herprogrammeringsmethode veel wordt gebruikt, is er momenteel geen definitieve methode voor de directe herprogrammering van huidcellen tot melanocyten, vooral vanwege de vele transcriptiefactoren die als14,15 moeten worden beschouwd. De transcriptiefactoren, Mitf, Sox10 en Pax3, zijn gebruikt voor directe herprogrammering van huidcellen in melanocyten14. Daarentegen is de combinatie van MITF, PAX3, SOX2 en SOX9 ook gebruikt voor directe herprogrammering van huidcellen in menselijke melanocyten in een andere studie15. In dit protocol werd, ondanks het gebruik van een andere screeningsmethode, hetzelfde resultaat verkregen met de combinatie van Mitf, Sox10 en Pax3 voor directe herprogrammering van huidcellen in melanocyten zoals eerder beschreven14. Het ontwikkelen van een systeem om melanocyten te genereren uit andere huidcellen kan een schema bieden voor het transformeren van andere huidcellen van vitiligopatiënten in melanocyten. Daarom is het cruciaal om een eenvoudige en efficiënte methode te construeren voor deze directe herprogrammering om melanocyten met succes te genereren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-062</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;M filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHVR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene round bottom tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%/100% ethanol</td>
			<td>LANBAO</td>
			<td>210106</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2786</td>
			<td>Stock concentration 40 mg/mL 
			Final concentration 24 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21137</td>
			<td>Dilution of 1:500 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics(Pen/Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRP1/TYRP1 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABC592</td>
			<td>Host/Isotype: Mouse IgG2a 
			Species reactivity: Mouse/Human 
			Dilution of 1:200 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRP2/DCT Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab74073</td>
			<td>Host/Isotype: Rabbit IgG 
			Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>Stock concentration 10 mM 
			Final concentration 3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td>Stock concentration 0.3 mg/mL 
			Final concentration 20 pM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-165-144</td>
			<td>Dilution of 1:500 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (High glucose)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C 
			Heat-inactivated before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2)</td>
			<td>Hanheng Biological Technology Co., Ltd.</td>
			<td>pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab220365</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EDN3</td>
			<td>American-Peptide</td>
			<td>88-5-10A</td>
			<td>Stock concentration 100 &#956;M 
			Final concentration 0.1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/mL 
			Final concentration 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-DOPA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9628</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Transfection reagent, stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson-Fontana staining kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G2032</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral balsam</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8590</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (-)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Stock concentration 1 mM 
			Final concentration 200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td>cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 &#956;g/&#181;L 
			Final concentration 4 ng/&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13256-029</td>
			<td>Stock concentration 4 &#956;g/mL 
			Final concentration 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human insulin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>I3536</td>
			<td>Stock concentration 10 mg/mL 
			Final concentration 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human SCF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>255-SC-010</td>
			<td>Stock concentration 200 &#956;g/mL 
			Final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1330-20-7</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct reprogramming of mouse fibroblasts into melanocytes

Het verlies van functie van melanocyten leidt tot vitiligo, dat de fysieke en mentale gezondheid van de getroffen personen ernstig beïnvloedt. Momenteel is er geen effectieve langetermijnbehandeling voor vitiligo. Daarom is het noodzakelijk om een handige en effectieve behandeling voor vitiligo te ontwikkelen. Regeneratieve geneeskunde technologie voor directe herprogrammering van huidcellen in melanocyten lijkt een veelbelovende nieuwe behandeling van vitiligo. Dit omvat de directe herprogrammering van de huidcellen van de patiënt in functionele melanocyten om het verlies van melanocyten bij patiënten met vitiligo te helpen verbeteren. Deze methode moet echter eerst op muizen worden getest. Hoewel directe herprogrammering veel wordt gebruikt, is er geen duidelijk protocol voor directe herprogrammering in melanocyten. Bovendien is het aantal beschikbare transcriptiefactoren overweldigend. 
Hier wordt een geconcentreerd lentivirus-verpakkingssysteemprotocol gepresenteerd om transcriptiefactoren te produceren die zijn geselecteerd voor het herprogrammeren van huidcellen naar melanocyten, waaronder Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 en Snai2. Muis embryonale fibroblasten (MEF's) werden geïnfecteerd met het geconcentreerde lentivirus voor al deze transcriptiefactoren voor de directe herprogrammering van de MEF's in geïnduceerde melanocyten (iMels) in vitro. Bovendien werden deze transcriptiefactoren gescreend en werd het systeem geoptimaliseerd voor directe herprogrammering naar melanocyten. De expressie van de karakteristieke markers van melanine in iMels op gen- of eiwitniveau was significant verhoogd. Deze resultaten suggereren dat directe herprogrammering van fibroblasten naar melanocyten een succesvolle nieuwe therapeutische strategie voor vitiligo zou kunnen zijn en het mechanisme van melanocytenontwikkeling zou kunnen bevestigen, wat de basis zal vormen voor verdere directe herprogrammering van fibroblasten in melanocyten in vivo.

Dit artikel bevat de protocollen van een geconcentreerd lentivirusverpakkingssysteem om lentivirus van transcriptiefactoren te produceren voor directe herprogrammering van fibroblasten naar melanocyten en protocollen voor screening op transcriptiefactoren en directe herprogrammering van melanocyten uit MEFs.
Het succes van geconcentreerde lentivirusproductie werd geëvalueerd door de fluorescentie-intensiteit van GFP (figuur 1A) of door flowcytometrie (<strong cla...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes at JoVE.com

Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd direct herprogrammeringssysteem voor melanocyten en een zeer efficiënt, geconcentreerd virusverpakkingssysteem dat zorgt voor een soepele directe herprogrammering.

Directe herprogrammering van muisfibroblasten in melanocyten

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, ...

Directe herprogrammering om melanocyten te genereren is gemeld. Verschillende transcriptiefactoren worden echter in verschillende onderzoeken gebruikt. In dit protocol hebben we het aantal transcriptiefactoren gevalideerd en verminderd met een hogere herprogrammeringsefficiëntie.We hebben een direct herprogrammeringssysteem opgezet om melanocyten te genereren met behulp van slechts drie transcriptiefactoren, Mitf, Sox10 en PAX3, en hebben het kweeksysteem aangepast om het stabieler en robuuster te maken. Hoe functionele melanocyten te regenereren is een belangrijke vraag die kan helpen bij het aanpakken van therapiebeperkingen voor depigmentatieziekten zoals vitiligo. De juiste herprogrammering biedt een prospectieve Onze techniek heeft de kenmerken van gemak, sterke bediening en stabiliteit, die gemakkelijker te promoten en te herhalen is.Om de productie van het geconcentreerde lentivirus te beginnen, plaat 1,5 keer 10 tot de 6 HEK-293T-cellen in een schaal van 60 millimeter en kweek de cellen met normaal medium op 37 graden Celsius in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide. Na 24 uur van de incubatie, wanneer de HEK-293T-cellen 80 tot 90% confluency hebben bereikt, vervangt u het medium door 3,5 ml DMEM en incubeert u de cellen vervolgens bij 37 graden Celsius in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide gedurende twee uur. Nadat u de cellen uit de incubator hebt verwijderd, vervangt u het medium door DMEM met 2% FBS en voegt u het vers bereide transfectiecomplexmengsel druppelsgewijs toe aan de cellen.Meng het vloeibare mengsel voorzichtig. Verander aan het einde van acht uur het celmedium met 3,5 ml normaal medium. Verzamel het virussupernatant op 24 en 48 uur.Meng vervolgens de virussupernatanten die op twee verschillende tijdstippen zijn verzameld en centrifugeer het mengsel op 200 xg gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Laat vervolgens het verzamelde supernatant door filters van 0,45 micron gaan om het filtraat in een steriele conische buis van 50 ml te verzamelen. Concentreer het gefilterde virussupernatant door centrifugatie bij 6.000 xg bij vier graden Celsius 's nachts.Als u klaar bent, moet u ervoor zorgen dat de viruskorrel zichtbaar is aan de onderkant van de conische buis. Giet het supernatant langzaam uit. Voor het oplossen van de viruskorrel in het normale medium met één bij 100e* volume van het virussupernatant.Gebruik een P1000-micropipette om voorzichtig op en neer te pipetteren totdat een homogeen 100x geconcentreerd virusmengsel is verkregen. Verdeel het geconcentreerde virus in de microcentrifugebuizen om op te slaan bij 80 graden Celsius. Plaat 1 maal 10 tot de 5e HEK-293T cellen in één put van een zes-well plaat.Kweek deze cellen met het normale medium bij 37 graden Celsius in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide. Voeg na 24 uur 0,1 tot 0,2 microliter van het 100x fluorescerende geconcentreerde virus toe aan elke put. Gevolgd door de toevoeging van vier nanogram per microliter van het kationische polymere transfectiereagens aan elke put.Vervang ongeveer acht tot twaalf uur na infectie met het virus het medium door het normale medium. Was achtenveertig uur na de infectie het gerecht met 1 ml steriele PBS om de dode cellen te verwijderen. Trypsinize de cellen vervolgens met behulp van 250 microliter 0,05% trypsine-EDTA-oplossing per put van een zesputtenplaat bij kamertemperatuur.Centrifugeer de plaat op 200 xg gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Na het verwijderen van het supernatant, suspensie de celpellet opnieuw in één ml PBS en voeg de celsuspensie toe aan een vijf ml polystyreen buis met ronde bodem. Plaats vervolgens de buis in de flowcytometer om het monster te analyseren.Voor directe herprogrammering van fibroblasten, bedek een put van een celkweekplaat met zes putten met 1 ml 0,1% gelatine-oplossing bij kamertemperatuur. Na 15 tot 30 minuten, wanneer de put volledig bedekt is met de gelatine, aspirateer 0,1% gelatine-oplossing. Vervolgens, plaat 5 keer 10 tot de 4e muis embryonale fibroblasten, of MEFs, in een put van een zes-well plaat bedekt met 0,1% gelatine, en kweek de cellen 's nachts met het normale medium op 37 graden Celsius in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide.Na 24 uur, wanneer de MEF's 40 tot 50% confluency hebben bereikt, vervangt u het medium door het normale medium. Smelt vervolgens het bevroren, geconcentreerde virus op ijs. Bereken het volume van het toe te voegen virus met behulp van een vergelijking en voeg vervolgens het geconcentreerde virus voor de zes transcriptiefactoren toe aan elke put, volgens het berekende volume.Voeg vier microgram per ml van het kationische polymere transfectiemiddel toe aan de put. Beschouw het als dag nul van de lentivirusinfectie. Vervang op de eerste dag, na 8 tot 12 uur infectie, het medium dat het virus bevat door het verse normale medium, terwijl 0,5 microgram per ml puromycine wordt toegevoegd om stabiele geïnfecteerde cellijnen te screenen.Vervang op dag twee, 48 uur na infectie, het supernatant medium geleidelijk door het herprogrammerende medium. Verander een vierde van het totale mediumvolume voordat u drie micromolaire CHIR99021 toevoegt. Verander van dag drie tot dag zeven, afhankelijk van de toestand van de cellen, het medium door het geleidelijk te vervangen door een hoger aandeel herprogrammeringsmedium om binnen vijf dagen over te schakelen naar het volledige herprogrammeringsmedium.Maak vervolgens de cellen los met 500 microliter 0,05% trypsine-EDTA spijsverteringsenzym gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Wanneer ongeveer zestig procent van de cellen omhoog is gegaan, stop dan de spijsvertering door het normale medium toe te voegen, twee keer het volume van het spijsverteringsenzym. Verzamel de celsuspensie in een steriele conische buis van 15 ml om gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius bij 200 xg te centrifugeren.Verwijder het supernatant voordat u de celpellet opnieuw opsuspendeert met het herprogrammeringsmedium. Als u klaar bent, plaatst u de opnieuw gesuspendeerde cellen in een steriele schaal van 60 millimeter. Kweek de cellen op 37 graden Celsius in een bevochtigde 5% kooldioxide incubator.Na achtenveertig uur lentivirusinfectie in HEK-293T-cellen werd het succes van geconcentreerde lentivirusproductie geëvalueerd door de fluorescentie-intensiteit van GFP of door flowcytometrie te observeren. De titer van het geconcentreerde virus bleek hoog te zijn op 10 tot de 8e TU/ml. Tijdens de directe herprogrammering van de fibroblasten veranderde de celmorfologie geleidelijk naar langwerpige celsynaps en vergrote celkernen.De cellen verouderen echter geleidelijk na dag twintig. Verwijdering van de transcriptiefactoren, Mitf, Pax3 of Sox10, resulteerde in het uitschakelen van de expressie van melanocytische genen, Tyr, Tyrp1 en Mlana, wat wijst op de grootste impact op fibroblastconversie naar melanocyten. Vandaar dat de expressie van melanocytische genen geïnduceerd door de directe programmering met drie transcriptiefactoren hoger was in vergelijking met zes transcriptiefactoren.Om MEF-geïnduceerde melanocyten of iMels te identificeren, werd de expressie van melanocytische markers, TYRP1 en DCT gedetecteerd met behulp van immunofluorescente kleuring. Bovendien lieten de melanine-specifieke kleuringsmethoden zoals DOPA en Masson-Fontana kleuring positieve resultaten zien. De 293T-cellen moeten gelijkmatig worden verdeeld.Ook moet de toevoeging van transfectiemengsel aan cellen voorzichtig worden gedaan om te voorkomen dat de cellen drijven. Het protocol is stabiel en praktisch en kan worden gebruikt om andere soorten cellen te herprogrammeren. Het verwacht een referentie en een strategie te bieden voor in vivo directe herprogrammering in melanocytenregeneratie in toekomstige geneeskunde.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Developmental Biology

Unit 1

The Integumentary System

SCIENTISTS IN ACTION

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Stabiele en efficiënte genetische modificatie van cellen in de Adult Mouse V-SVZ voor de Analyse van de neurale stamcel autonome en niet-autonome Effects

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Methoden voor Juist Gelokaliseerde Overdracht van cellen of DNA in Early postimplantatie muizenembryo&#39;s

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-vrij Afleiding van melanocyten uit menselijke pluripotente stamcellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Kinetic Meet- en Real Time Visualisatie van Somatic herprogrammeren

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Protocol voor de directe omzetting van muizen embryonale fibroblasten in Trofoblast Stamcellen

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Herprogrammeren muis embryonale fibroblasten met transcriptiefactoren een Hemogenic Program Laten

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Oprichting van Proliferatieve Tetraploïde Cellen uit niet-getransformeerde humane fibroblasten

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

Voorwaardelijke herprogrammeren van Pediatric Human slokdarmkanker epitheelcellen voor gebruik in Tissue Engineering and Disease Investigation

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Het beoordelen van Cardiomyocyte Subtypen Na transcriptie Factor-gemedieerde herprogrammeren van muis embryonale fibroblasten

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Herprogrammering van de primaire vruchtwater en membraan cellen pluripotent in Xeno-vrij voorwaarden

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...