Name: direct reprogramming of mouse fibroblasts into melanocytes
Uploaded: 2021-08-27T14:30:00
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Cette étude a été partiellement soutenue par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82070638 et 81770621) et de la Fondation des sciences naturelles de la province du Jiangsu (BK20180281).

Ce travail a été approuvé par le Comité de gestion et d’utilisation des animaux de laboratoire de l’Université du Jiangsu (UJS-IACUC-AP--20190305010). Les expériences ont été réalisées en stricte conformité avec les normes établies par l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International). Il n’y a pas eu d’expériences impliquant des humains, donc ce travail n’a pas eu besoin de l’approbation du comité d’éthique de la recherche humaine...

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La qualité du virus est cruciale pour le succès de la reprogrammation directe en mélanocytes dans ce protocole. La méthode d’emballage et de concentration des virus dans ce protocole est simple et facile à répéter et ne repose sur aucun autre réactif concentré auxiliaire. Ce protocole peut être suivi avec succès dans la plupart des laboratoires. Pour garantir la qualité du virus concentré, les points suivants nécessitent une attention particulière. L’un est le statut cellulaire de HEK-293T. Bien que le...

Le vitiligo est une maladie de la peau qui affecte gravement la santé physique et mentale des personnes touchées. Pour diverses raisons, y compris les anomalies métaboliques, le stress oxydatif, la génération de médiateurs inflammatoires, le détachement cellulaire et la réponse auto-immune, les mélanocytes fonctionnels sont perdus et la sécrétion de mélanine est arrêtée, conduisant au développement du vitiligo 1,2. Cette condition se produit largement et est particulièrement problématique sur le visage. Le traitement principal est l’utilisation systémique de corticostéroïdes et d’immunomodulateurs. La photothérapie peut être utilisée pour des maladies systémiques ou locales, et il existe des traitements chirurgicaux, tels que la greffe de peau perforée et la greffe de mélanocytesautologues 3,4,5. Cependant, les patients qui utilisent la pharmacothérapie et la photothérapie sont sujets aux rechutes, et ces traitements ont de faibles effets thérapeutiques à long terme. Le traitement chirurgical est traumatisant et n’est que modérément efficace 2,6. Par conséquent, une nouvelle stratégie thérapeutique efficace est nécessaire pour le vitiligo.
La reprogrammation des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) inverse ces cellules de leur état terminal à un état pluripotent, un processus médié par les facteurs de transcription Oct4, Sox2, Klf4 et c-Myc7. Cependant, en raison de la possibilité de tumorigénicité et du long temps de production, cette technologie a été accueillie avec scepticisme lorsqu’elle est appliquée à des contextes cliniques8. La reprogrammation directe est une technologie qui transforme un type de cellule terminale en un autre type de cellule terminale9. Ce processus est réalisé par des facteurs de transcription appropriés. Diverses cellules ont déjà été directement reprogrammées avec succès, notamment les cardiomyocytes10, les neurones11 et les cellules ciliées cochléaires12. Certains chercheurs ont même reprogrammé des tissus cutanés directement in situ, qui peuvent être utilisés pour la réparation des plaies13. Les avantages de la reprogrammation directe comprennent la réduction des temps d’attente et des coûts, la réduction du risque de cancer, la réduction des problèmes éthiques et une meilleure compréhension du mécanisme sous-jacent à la détermination du devenir cellulaire9.
Bien que la méthode de reprogrammation directe soit largement utilisée, il n’existe actuellement aucune méthode précise pour la reprogrammation directe des cellules de la peau en mélanocytes, en particulier en raison des nombreux facteurs de transcription à considérer14,15. Les facteurs de transcription, Mitf, Sox10 et Pax3, ont été utilisés pour la reprogrammation directe des cellules de la peau en mélanocytes14. En revanche, la combinaison de MITF, PAX3, SOX2 et SOX9 a également été utilisée pour la reprogrammation directe des cellules de la peau en mélanocytes humains dans une autre étude15. Dans ce protocole, malgré l’utilisation d’une méthode de dépistage différente, le même résultat a été obtenu avec la combinaison de Mitf, Sox10 et Pax3 pour la reprogrammation directe des cellules de la peau en mélanocytes comme décrit précédemment14. Le développement d’un système pour générer des mélanocytes à partir d’autres cellules de la peau peut fournir un schéma pour transformer d’autres cellules cutanées de patients atteints de vitiligo en mélanocytes. Par conséquent, il est crucial de construire une méthode simple et efficace pour cette reprogrammation directe afin de générer des mélanocytes avec succès.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-062</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;M filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHVR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene round bottom tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%/100% ethanol</td>
			<td>LANBAO</td>
			<td>210106</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2786</td>
			<td>Stock concentration 40 mg/mL 
			Final concentration 24 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21137</td>
			<td>Dilution of 1:500 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics(Pen/Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRP1/TYRP1 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABC592</td>
			<td>Host/Isotype: Mouse IgG2a 
			Species reactivity: Mouse/Human 
			Dilution of 1:200 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRP2/DCT Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab74073</td>
			<td>Host/Isotype: Rabbit IgG 
			Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>Stock concentration 10 mM 
			Final concentration 3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td>Stock concentration 0.3 mg/mL 
			Final concentration 20 pM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-165-144</td>
			<td>Dilution of 1:500 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (High glucose)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C 
			Heat-inactivated before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2)</td>
			<td>Hanheng Biological Technology Co., Ltd.</td>
			<td>pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab220365</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EDN3</td>
			<td>American-Peptide</td>
			<td>88-5-10A</td>
			<td>Stock concentration 100 &#956;M 
			Final concentration 0.1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/mL 
			Final concentration 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-DOPA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9628</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Transfection reagent, stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson-Fontana staining kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G2032</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral balsam</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8590</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (-)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Stock concentration 1 mM 
			Final concentration 200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td>cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 &#956;g/&#181;L 
			Final concentration 4 ng/&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13256-029</td>
			<td>Stock concentration 4 &#956;g/mL 
			Final concentration 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human insulin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>I3536</td>
			<td>Stock concentration 10 mg/mL 
			Final concentration 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human SCF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>255-SC-010</td>
			<td>Stock concentration 200 &#956;g/mL 
			Final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1330-20-7</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct reprogramming of mouse fibroblasts into melanocytes

La perte de fonction des mélanocytes conduit au vitiligo, qui affecte gravement la santé physique et mentale des personnes touchées. Actuellement, il n’existe pas de traitement efficace à long terme pour le vitiligo. Par conséquent, il est impératif de développer un traitement pratique et efficace pour le vitiligo. La technologie de médecine régénérative pour la reprogrammation directe des cellules de la peau en mélanocytes semble être un nouveau traitement prometteur du vitiligo. Cela implique la reprogrammation directe des cellules de la peau du patient en mélanocytes fonctionnels pour aider à améliorer la perte de mélanocytes chez les patients atteints de vitiligo. Cependant, cette méthode doit d’abord être testée sur des souris. Bien que la reprogrammation directe soit largement utilisée, il n’existe pas de protocole clair pour la reprogrammation directe en mélanocytes. De plus, le nombre de facteurs de transcription disponibles est écrasant. 
Ici, un protocole de système d’emballage de lentivirus concentré est présenté pour produire des facteurs de transcription sélectionnés pour reprogrammer les cellules de la peau en mélanocytes, y compris Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 et Snai2. Des fibroblastes embryonnaires (MEF) de souris ont été infectés par le lentivirus concentré pour tous ces facteurs de transcription pour la reprogrammation directe des MEF en mélanocytes induits (iMels) in vitro. De plus, ces facteurs de transcription ont été examinés et le système a été optimisé pour une reprogrammation directe en mélanocytes. L’expression des marqueurs caractéristiques de la mélanine dans iMels au niveau du gène ou de la protéine a été significativement augmentée. Ces résultats suggèrent que la reprogrammation directe des fibroblastes en mélanocytes pourrait être une nouvelle stratégie thérapeutique réussie pour le vitiligo et confirmer le mécanisme de développement des mélanocytes, ce qui fournira la base d’une reprogrammation directe ultérieure des fibroblastes en mélanocytes in vivo.

Cet article comprend les protocoles d’un système d’emballage de lentivirus concentré pour produire le lentivirus des facteurs de transcription pour la reprogrammation directe des fibroblastes en mélanocytes et les protocoles pour le dépistage des facteurs de transcription et la reprogrammation directe des mélanocytes à partir de MEF.
Le succès de la production de lentivirus concentré a été évalué en observant l’intensité de fluorescence de la GFP (Figure...

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Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes

Nous décrivons ici un système de reprogrammation directe optimisé pour les mélanocytes et un système d’emballage de virus concentré à haute efficacité qui assure une reprogrammation directe en douceur.

Reprogrammation directe des fibroblastes de souris en mélanocytes

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, ...

Une reprogrammation directe pour générer des mélanocytes a été rapportée. Cependant, divers facteurs de transcription sont utilisés dans différentes études. Dans ce protocole, nous avons validé et réduit le nombre de facteurs de transcription toujours avec une efficacité de reprogrammation plus élevée.Nous avons établi un système de reprogrammation directe pour générer des mélanocytes en utilisant seulement trois facteurs de transcription, Mitf, Sox10 et PAX3, et modifié le système de culture pour le rendre plus stable et robuste. Comment régénérer les mélanocytes fonctionnels est une question importante qui peut aider à résoudre les limites thérapeutiques pour les maladies de dépigmentation comme le vitiligo. La bonne reprogrammation fournit une perspective Notre technique a les caractéristiques de commodité, de forte opérabilité et de stabilité, ce qui est plus facile à promouvoir et à répéter.Pour commencer la production du lentivirus concentré, plaquez 1,5 fois 10 aux 6 cellules HEK-293T dans une boîte de 60 millimètres et cultivez les cellules avec un milieu normal à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5% de dioxyde de carbone. Après 24 heures d’incubation, lorsque les cellules HEK-293T ont atteint 80 à 90% de confluence, remplacez le milieu par 3,5 mL de DMEM, puis incubez les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5% de dioxyde de carbone pendant deux heures. Après avoir retiré les cellules de l’incubateur, remplacez le milieu par du DMEM contenant 2% de FBS et ajoutez le mélange complexe de transfection fraîchement préparé aux cellules de manière goutte à goutte.Mélanger doucement le mélange liquide. À la fin de huit heures, changez le milieu cellulaire avec 3,5 mL de milieu normal. Prélever le surnageant du virus à 24 et 48 heures.Ensuite, mélangez les surnageants du virus collectés à deux moments différents et centrifugez le mélange à 200 xg pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, passez le surnageant collecté à travers des filtres de 0,45 micron pour recueillir le filtrat dans un tube conique stérile de 50 mL. Concentrer le surnageant du virus filtré par centrifugation à 6 000 xg à quatre degrés Celsius pendant la nuit.Une fois cela fait, assurez-vous que la pastille virale est visible au fond du tube conique. Versez le surnageant lentement. Pour dissoudre la pastille virale dans le milieu normal avec un par 100ème * volume du surnageant du virus.Utilisez une micropipette P1000 pour pipeter doucement de haut en bas jusqu’à l’obtention d’un mélange homogène de virus concentré 100x. Divisez le virus concentré dans les tubes de microcentrifugation pour le stocker à 80 degrés Celsius. Plaque 1 fois 10 à la 5ème cellule HEK-293T dans un puits d’une plaque de six puits.Cultivez ces cellules avec le milieu normal à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5% de dioxyde de carbone. Après 24 heures, ajouter 0,1 à 0,2 microlitre du virus concentré fluorescent 100x à chaque puits. Suivi de l’ajout de quatre nanogrammes par microlitre du réactif de transfection polymère cationique à chaque puits.Environ huit à douze heures après l’infection par le virus, remplacez le milieu par le milieu normal. Quarante-huit heures après l’infection, lavez la vaisselle avec 1 mL de PBS stérile pour éliminer les cellules mortes. Ensuite, essayez les cellules en utilisant 250 microlitres de solution de trypsine-EDTA à 0,05% par puits d’une plaque de six puits à température ambiante.Centrifugez la plaque à 200 xg pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir retiré le surnageant, remettez en suspension la pastille de cellule dans un mL de PBS et ajoutez la suspension de cellule à un tube à fond rond en polystyrène de cinq mL. Placez ensuite le tube dans le cytomètre en flux pour analyser l’échantillon.Pour la reprogrammation directe des fibroblastes, recouvrir un puits d’une plaque de culture cellulaire à six puits avec 1 mL de solution de gélatine à 0,1% à température ambiante. Après 15 à 30 minutes, lorsque le puits est complètement recouvert de gélatine, aspirer une solution de gélatine à 0,1%. Ensuite, plaquez 5 fois 10 à la 4ème fibroblaste embryonnaire de souris, ou MEF, dans un puits d’une plaque de six puits recouverte de 0,1% de gélatine, et cultivez les cellules pendant la nuit avec le milieu normal à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5% de dioxyde de carbone.Après 24 heures, lorsque les MEF ont atteint 40 à 50% de confluence, remplacez le milieu par le milieu normal. Ensuite, faites fondre le virus congelé et concentré sur de la glace. Calculez le volume du virus à ajouter à l’aide de l’équation, puis ajoutez le virus concentré pour les six facteurs de transcription à chaque puits, en fonction du volume calculé.Ajouter quatre microgrammes par mL de l’agent de transfection polymère cationique au puits. Considérez-le comme le jour zéro de l’infection à lentivirus. Le premier jour, après 8 à 12 heures d’infection, remplacez le milieu contenant le virus par le milieu normal frais, tout en ajoutant 0,5 microgramme par mL de puromycine pour dépister les lignées cellulaires infectées stables.Le deuxième jour, 48 heures après l’infection, remplacez progressivement le milieu surnageant par le milieu de reprogrammation. Modifiez un quart du volume moyen total avant d’ajouter trois CHIR99021 micromolaires. Du troisième au septième jour, en fonction de l’état des cellules, changez le milieu en le remplaçant progressivement par une proportion plus élevée de milieu de reprogrammation pour passer au milieu de reprogrammation complet dans les cinq jours.Ensuite, détachez les cellules avec 500 microlitres d’enzyme digestive 0,05% trypsine-EDTA pendant trois minutes à température ambiante. Lorsqu’environ soixante pour cent des cellules ont flotté, arrêtez la digestion en ajoutant le milieu normal, deux fois le volume de l’enzyme digestive. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique stérile de 15 mL pour centrifuger à 200 xg pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Retirez le surnageant avant de suspendre à nouveau la pastille cellulaire avec le milieu de reprogrammation. Lorsque vous avez terminé, plaquez les cellules re-suspendues dans un plat stérile de 60 millimètres. Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5% de dioxyde de carbone.Après quarante-huit heures d’infection à lentivirus dans les cellules HEK-293T, le succès de la production concentrée de lentivirus a été évalué en observant l’intensité de fluorescence de la GFP ou par cytométrie en flux. Le titre du virus concentré s’est avéré élevé entre 10 et 8e TU/mL. Au cours de la reprogrammation directe des fibroblastes, la morphologie cellulaire a changé progressivement en synapse cellulaire allongée et en noyaux cellulaires élargis.Cependant, les cellules vieillissaient progressivement après le vingtième jour. L’élimination des facteurs de transcription, Mitf, Pax3 ou Sox10, a entraîné le silence de l’expression des gènes mélanocytaires, Tyr, Tyrp1 et Mlana, indiquant le plus grand impact sur la conversion des fibroblastes en mélanocytes. Par conséquent, l’expression des gènes mélanocytaires induits par la programmation directe avec trois facteurs de transcription était plus élevée par rapport à six facteurs de transcription.Pour identifier les mélanocytes induits par meF, ou iMels, l’expression de marqueurs mélanocytaires, TYRP1 et DCT a été détectée à l’aide d’une coloration immunofluorescente. De plus, les méthodes de coloration spécifiques à la mélanine telles que la coloration DOPA et Masson-Fontana ont montré des résultats positifs. Les cellules 293T doivent être réparties uniformément.En outre, l’ajout de mélange de transfection aux cellules doit être fait doucement pour empêcher les cellules de flotter. Le protocole est stable et pratique et peut être utilisé pour reprogrammer d’autres types de cellules. Il prévoit de fournir une référence et une stratégie pour la reprogrammation directe in vivo de la régénération des mélanocytes dans la médecine future.

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Stable et efficace modification génétique de cellules dans le Adulte souris V-SVZ pour l&#39;analyse des cellules souches neurales autonome et effets non autonomes

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

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Biologie du développement

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