Name: direct reprogramming of mouse fibroblasts into melanocytes
Uploaded: 2021-08-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes at JoVE.com

Diese Studie wurde teilweise durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (82070638 und 81770621) und der Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20180281) unterstützt.

Diese Arbeit wurde vom Laboratory Animal Management and Use Committee an der Jiangsu University (UJS-IACUC-AP--20190305010) genehmigt. Die Experimente wurden in strikter Übereinstimmung mit den Standards durchgeführt, die von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International) festgelegt wurden. Es gab keine Experimente mit Menschen, so dass diese Arbeit keine Genehmigung der Ethikkommission für Humanforschung benötigte. Weitere Informationen zu Reagenzien f...

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	<li>Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo.">Vitiligo.</a> Lancet. 386 (9988), 74-84 (2015).</li><li>Picardo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo.">Vitiligo.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15011 (2015).</li><li>Speeckaert, R., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo:+An+update+on+pathophysiology+and+treatment+options.">Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options.</a> American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).</li><li>Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo+management:+combination+of+surgical+treatment+and+phototherapy+under+reflectance+confocal+microscopy+monitoring.">Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).</li><li>Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+therapies+for+vitiligo.">Surgical therapies for vitiligo.</a> Dermatologic Clinics. 35 (2), 193-203 (2017).</li><li>Bishnoi, A., Parsad, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+molecular+aspects+of+vitiligo+treatments.">Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments.</a> International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509 (2018).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+transcription+factor-mediated+reprogramming+to+pluripotency.">A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).</li><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-based+cell+therapy-promise+and+challenges.">Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges.</a> Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).</li><li>Xu, J., Du, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming:+strategies,+mechanisms,+and+applications.">Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li><li>Gasc&#243;n, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., G&#246;tz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neuronal+reprogramming:+achievements,+hurdles,+and+new+roads+to+success.">Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success.</a> Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).</li><li>Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cellular+reprogramming+and+inner+ear+regeneration.">Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).</li><li>Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+wound-resident+cells+generates+skin+epithelial+tissue.">In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue.</a> Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).</li><li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+to+functional+melanocytes+by+defined+factors.">Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors.</a> Nature Communications. 5, 5807 (2014).</li><li>Fehrenbach, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+tumorigenic+potential+upon+transdifferentiation+from+keratinocytic+into+melanocytic+lineage.">Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage.</a> Scientific Reports. 6, 28891 (2016).</li><li>Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+extracting+RNA+and+genomic+DNA+from+archived+human+blood+and+muscle.">A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle.</a> Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).</li><li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-transcription+PCR+(RT-PCR).">Reverse-transcription PCR (RT-PCR).</a> Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).</li><li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+staining.">Immunofluorescence staining.</a> Current Protocols in Cell Biology. 69 (1), 1-7 (2015).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+vectors+for+gene-based+therapy.">Non-viral vectors for gene-based therapy.</a> Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).</li></ol>

Die Qualität des Virus ist entscheidend für den Erfolg der direkten Reprogrammierung auf Melanozyten in diesem Protokoll. Die Methode zum Verpacken und Konzentrieren von Viren in diesem Protokoll ist einfach und leicht zu wiederholen und stützt sich nicht auf ein anderes konzentriertes Hilfsreagenz. Dieses Protokoll kann in den meisten Labors erfolgreich befolgt werden. Um die Qualität des konzentrierten Virus zu gewährleisten, bedürfen die folgenden Punkte besonderer Aufmerksamkeit. Einer ist der Zellstatus von HE...

Vitiligo ist eine Hautkrankheit, die die körperliche und geistige Gesundheit der betroffenen Personen ernsthaft beeinträchtigt. Aus verschiedenen Gründen, einschließlich metabolischer Anomalien, oxidativem Stress, Bildung von Entzündungsmediatoren, Zellablösung und Autoimmunreaktion, gehen die funktionellen Melanozyten verloren und die Sekretion von Melanin wird gestoppt, was zur Entwicklung von Vitiligo 1,2 führt. Dieser Zustand tritt häufig auf und ist besonders problematisch im Gesicht. Die Hauptbehandlung ist die systemische Verwendung von Kortikosteroiden und Immunmodulatoren. Phototherapie kann für systemische oder lokale Krankheiten verwendet werden, und es gibt chirurgische Behandlungen, wie perforierte Hauttransplantation und autologe Melanozytentransplantation 3,4,5. Patienten, die medikamentöse Therapie und Phototherapie anwenden, sind jedoch anfällig für Rückfälle, und diese Behandlungen haben schlechte langfristige therapeutische Wirkungen. Die chirurgische Behandlung ist traumatisch und nur mäßig wirksam 2,6. Daher ist eine neue und wirksame therapeutische Strategie für Vitiligo erforderlich.
Die Reprogrammierung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) kehrt diese Zellen von ihrem terminalen Zustand in einen pluripotenten Zustand um, ein Prozess, der durch die Transkriptionsfaktoren Oct4, Sox2, Klf4 und c-Myc7 vermittelt wird. Aufgrund der Möglichkeit der Tumorigenität und der langen Produktionszeit ist diese Technologie jedoch auf Skepsis gestoßen, wenn sie auf klinische Umgebungen angewendet wird8. Die direkte Reprogrammierung ist eine Technologie, die einen Typ einer Terminalzelle in einen anderen Typ einer Terminalzelleverwandelt 9. Dieser Prozess wird durch geeignete Transkriptionsfaktoren erreicht. Verschiedene Zellen wurden bereits erfolgreich direkt umprogrammiert, darunter Kardiomyozyten10, Neuronen 11 und Cochlea-Haarzellen12. Einige Forscher haben sogar Hautgewebe direkt in situ umprogrammiert, das zur Wundheilung genutzt werden kann13. Zu den Vorteilen einer direkten Reprogrammierung gehören reduzierte Wartezeiten und Kosten, ein geringeres Krebsrisiko, weniger ethische Probleme und ein besseres Verständnis des Mechanismus, der der Bestimmung des Zellschicksals zugrunde liegt9.
Obwohl die direkte Reprogrammierungsmethode weit verbreitet ist, gibt es derzeit keine definitive Methode zur direkten Reprogrammierung von Hautzellen in Melanozyten, insbesondere wegen der zahlreichen Transkriptionsfaktoren, dieals 14,15 zu betrachten sind. Die Transkriptionsfaktoren Mitf, Sox10 und Pax3 wurden zur direkten Reprogrammierung von Hautzellen in Melanozyten14 verwendet. Im Gegensatz dazu wurde die Kombination von MITF, PAX3, SOX2 und SOX9 in einer anderen Studie15 auch für die direkte Reprogrammierung von Hautzellen in menschliche Melanozyten verwendet. In diesem Protokoll wurde trotz der Verwendung einer anderen Screening-Methode das gleiche Ergebnis mit der Kombination von Mitf, Sox10 und Pax3 zur direkten Reprogrammierung von Hautzellen in Melanozyten erzielt, wie zuvorbeschrieben 14. Die Entwicklung eines Systems zur Erzeugung von Melanozyten aus anderen Hautzellen kann ein Schema für die Umwandlung anderer Hautzellen von Vitiligo-Patienten in Melanozyten liefern. Daher ist es entscheidend, eine einfache und effiziente Methode für diese direkte Reprogrammierung zu konstruieren, um Melanozyten erfolgreich zu erzeugen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-062</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;M filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHVR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene round bottom tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%/100% ethanol</td>
			<td>LANBAO</td>
			<td>210106</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2786</td>
			<td>Stock concentration 40 mg/mL 
			Final concentration 24 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21137</td>
			<td>Dilution of 1:500 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics(Pen/Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRP1/TYRP1 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABC592</td>
			<td>Host/Isotype: Mouse IgG2a 
			Species reactivity: Mouse/Human 
			Dilution of 1:200 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRP2/DCT Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab74073</td>
			<td>Host/Isotype: Rabbit IgG 
			Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>Stock concentration 10 mM 
			Final concentration 3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td>Stock concentration 0.3 mg/mL 
			Final concentration 20 pM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-165-144</td>
			<td>Dilution of 1:500 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (High glucose)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C 
			Heat-inactivated before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2)</td>
			<td>Hanheng Biological Technology Co., Ltd.</td>
			<td>pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab220365</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EDN3</td>
			<td>American-Peptide</td>
			<td>88-5-10A</td>
			<td>Stock concentration 100 &#956;M 
			Final concentration 0.1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/mL 
			Final concentration 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-DOPA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9628</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Transfection reagent, stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson-Fontana staining kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G2032</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral balsam</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8590</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (-)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Stock concentration 1 mM 
			Final concentration 200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td>cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 &#956;g/&#181;L 
			Final concentration 4 ng/&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13256-029</td>
			<td>Stock concentration 4 &#956;g/mL 
			Final concentration 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human insulin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>I3536</td>
			<td>Stock concentration 10 mg/mL 
			Final concentration 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human SCF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>255-SC-010</td>
			<td>Stock concentration 200 &#956;g/mL 
			Final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1330-20-7</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct reprogramming of mouse fibroblasts into melanocytes

Der Funktionsverlust der Melanozyten führt zu Vitiligo, was die körperliche und geistige Gesundheit der betroffenen Personen ernsthaft beeinträchtigt. Derzeit gibt es keine wirksame Langzeitbehandlung für Vitiligo. Daher ist es unerlässlich, eine bequeme und wirksame Behandlung für Vitiligo zu entwickeln. Die Technologie der regenerativen Medizin zur direkten Reprogrammierung von Hautzellen in Melanozyten scheint eine vielversprechende neuartige Behandlung der Vitiligo zu sein. Dies beinhaltet die direkte Umprogrammierung der Hautzellen des Patienten in funktionelle Melanozyten, um den Verlust von Melanozyten bei Patienten mit Vitiligo zu lindern. Diese Methode muss jedoch zuerst an Mäusen getestet werden. Obwohl die direkte Reprogrammierung weit verbreitet ist, gibt es kein klares Protokoll für die direkte Reprogrammierung in Melanozyten. Darüber hinaus ist die Anzahl der verfügbaren Transkriptionsfaktoren überwältigend. 
Hier wird ein konzentriertes Lentivirus-Verpackungssystemprotokoll vorgestellt, um Transkriptionsfaktoren zu erzeugen, die für die Reprogrammierung von Hautzellen in Melanozyten ausgewählt wurden, einschließlich Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 und Snai2. Embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus wurden mit dem konzentrierten Lentivirus für all diese Transkriptionsfaktoren für die direkte Reprogrammierung der MEFs in induzierte Melanozyten (iMels) in vitro infiziert. Darüber hinaus wurden diese Transkriptionsfaktoren gescreent und das System für die direkte Reprogrammierung auf Melanozyten optimiert. Die Expression der charakteristischen Melaninmarker in iMels auf Gen- oder Proteinebene war signifikant erhöht. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die direkte Reprogrammierung von Fibroblasten auf Melanozyten eine erfolgreiche neue therapeutische Strategie für Vitiligo sein könnte und den Mechanismus der Melanozytenentwicklung bestätigt, der die Grundlage für eine weitere direkte Reprogrammierung von Fibroblasten in Melanozyten in vivo bilden wird.

Dieser Artikel enthält die Protokolle eines konzentrierten Lentivirus-Verpackungssystems zur Herstellung von Lentiviren von Transkriptionsfaktoren für die direkte Reprogrammierung von Fibroblasten zu Melanozyten und Protokolle für das Screening auf Transkriptionsfaktoren und die direkte Reprogrammierung von Melanozyten aus MEFs.
Der Erfolg der konzentrierten Lentivirusproduktion wurde durch Beobachtung der Fluoreszenzintensität von GFP (Abbildung 1A) oder durch Durchflusszytometrie (Abbild...

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Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes

Hier beschreiben wir ein optimiertes Direktreprogrammierungssystem für Melanozyten und ein hocheffizientes, konzentriertes Virusverpackungssystem, das eine reibungslose direkte Reprogrammierung gewährleistet.

Direkte Reprogrammierung von Mausfibroblasten in Melanozyten

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, ...

Eine direkte Reprogrammierung zur Erzeugung von Melanozyten wurde berichtet. In verschiedenen Studien werden jedoch verschiedene Transkriptionsfaktoren verwendet. In diesem Protokoll haben wir die Anzahl der Transkriptionsfaktoren validiert und reduziert, immer noch mit höherer Reprogrammierungseffizienz.Wir haben ein direktes Reprogrammierungssystem eingerichtet, um Melanozyten mit nur drei Transkriptionsfaktoren, Mitf, Sox10 und PAX3, zu erzeugen, und das Kultursystem modifiziert, um es stabiler und robuster zu machen. Wie man funktionelle Melanozyten regeneriert, ist eine wichtige Frage, die helfen kann, Therapieeinschränkungen für Depigmentierungskrankheiten wie Vitiligo anzugehen. Die richtige Neuprogrammierung bietet eine Perspektive Unsere Technik hat die Eigenschaften von Komfort, starker Bedienbarkeit und Stabilität, die leichter zu fördern und zu wiederholen ist.Um mit der Produktion des konzentrierten Lentivirus zu beginnen, werden die 6 HEK-293T-Zellen 1,5 mal 10 Mal in eine 60-Millimeter-Schale gepresst und die Zellen mit normalem Medium bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid kultiviert. Nach 24 Stunden der Inkubation, wenn die HEK-293T-Zellen eine Konfluenz von 80 bis 90% erreicht haben, ersetzen Sie das Medium durch 3,5 ml DMEM und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid für zwei Stunden. Nachdem Sie die Zellen aus dem Inkubator entfernt haben, ersetzen Sie das Medium durch DMEM, das 2% FBS enthält, und fügen Sie die frisch zubereitete Transfektionskomplexmischung tropfenweise zu den Zellen hinzu.Mischen Sie die flüssige Mischung vorsichtig. Nach Ablauf von acht Stunden wechseln Sie das Zellmedium mit 3,5 ml normalem Medium. Sammeln Sie den Virusüberstand nach 24 und 48 Stunden.Als nächstes mischen Sie die zu zwei verschiedenen Zeitpunkten gesammelten Virusüberstände und zentrifugieren Sie die Mischung bei 200 xg für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Führen Sie dann den gesammelten Überstand durch 0,45-Mikron-Filter, um das Filtrat in einem sterilen 50-ml-Konusrohr zu sammeln. Konzentrieren Sie den filtrierten Virusüberstand durch Zentrifugation auf 6.000 xg bei vier Grad Celsius über Nacht.Stellen Sie nach dem Fertig sicher, dass das Viruspellet am Boden des konischen Röhrchens sichtbar ist. Gießen Sie den Überstand langsam aus. Zum Auflösen des Viruspellets im normalen Medium mit einem mal 100-Volumen*Volumen des Virusüberstandes.Verwenden Sie eine P1000-Mikropipette, um vorsichtig auf und ab zu pipettieren, bis eine homogene 100x konzentrierte Virusmischung erhalten wird. Teilen Sie das konzentrierte Virus in die Mikrozentrifugenröhrchen, um es bei 80 Grad Celsius zu lagern. Platte 1 mal 10 bis die 5. HEK-293T Zellen in eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte.Kultivieren Sie diese Zellen mit dem normalen Medium bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid. Nach 24 Stunden fügen Sie 0,1 bis 0,2 Mikroliter des 100x fluoreszierenden konzentrierten Virus zu jeder Vertiefung hinzu. Gefolgt von der Zugabe von vier Nanogramm pro Mikroliter des kationischen polymeren Transfektionsreagenzes zu jeder Vertiefung.Etwa acht bis zwölf Stunden nach der Infektion mit dem Virus das Medium durch das normale Medium ersetzen. Achtundvierzig Stunden nach der Infektion waschen Sie das Geschirr mit 1 ml sterilem PBS, um die toten Zellen zu entfernen. Dann trypsinisieren Sie die Zellen mit 250 Mikrolitern 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung pro Vertiefung einer Sechs-Well-Platte bei Raumtemperatur.Zentrieren Sie die Platte bei 200 xg für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, suspendieren Sie das Zellpellet erneut in einem ml PBS und fügen Sie die Zellsuspension zu einem fünf ml Polystyrol-Rundbodenrohr hinzu. Legen Sie dann das Rohr in das Durchflusszytometer, um die Probe zu analysieren.Zur direkten Reprogrammierung von Fibroblasten beschichten Sie eine Vertiefung einer Zellkulturplatte mit sechs Well mit 1 ml 0,1%iger Gelatinelösung bei Raumtemperatur. Nach 15 bis 30 Minuten, wenn der Brunnen vollständig mit der Gelatine bedeckt ist, aspirieren Sie 0,1% Gelatinelösung. Als nächstes Platte 5 mal 10 bis zur 4. Maus embryonale Fibroblasten oder MEFs, in eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte, die mit 0,1% Gelatine beschichtet ist, und die Zellen über Nacht mit dem normalen Medium bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5% Kohlendioxid kultivieren.Nach 24 Stunden, wenn die MEFs eine Konfluenz von 40 bis 50% erreicht haben, ersetzen Sie das Medium durch das normale Medium. Als nächstes schmelzen Sie das gefrorene, konzentrierte Virus auf Eis. Berechnen Sie das Volumen des hinzuzufügenden Virus mithilfe der Gleichung und addieren Sie dann das konzentrierte Virus für die sechs Transkriptionsfaktoren zu jedem Bohrloch entsprechend dem berechneten Volumen.Fügen Sie vier Mikrogramm pro ml des kationischen polymeren Transfektionsmittels in die Vertiefung hinzu. Betrachten Sie es als Tag Null der Lentivirus-Infektion. Am ersten Tag, nach 8 bis 12 Stunden Infektion, ersetzen Sie das Medium, das das Virus enthält, durch das frische normale Medium, während Sie 0,5 Mikrogramm pro ml Puromycin hinzufügen, um stabile infizierte Zelllinien zu screenen.Ersetzen Sie am zweiten Tag, 48 Stunden nach der Infektion, das überstehende Medium allmählich durch das Reprogrammierungsmedium. Ändern Sie ein Viertel des gesamten mittleren Volumens, bevor Sie drei mikromolare CHIR99021 hinzufügen. Wechseln Sie vom dritten bis zum siebten Tag je nach Zustand der Zellen das Medium, indem Sie es schrittweise durch einen höheren Anteil an Reprogrammiermedium ersetzen, um innerhalb von fünf Tagen auf das komplette Reprogrammiermedium umzusteigen.Als nächstes lösen Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern 0,05% Trypsin-EDTA-Verdauungsenzym für drei Minuten bei Raumtemperatur. Wenn etwa sechzig Prozent der Zellen nach oben geschwommen sind, stoppen Sie die Verdauung, indem Sie das normale Medium hinzufügen, das Zweifache des Volumens des Verdauungsenzyms. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15-ml-sterilen konischen Röhrchen, um bei 200 xg für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.Entfernen Sie den Überstand, bevor Sie das Zellpellet mit dem Reprogrammiermedium wieder suspendieren. Wenn Sie fertig sind, plattieren Sie die resuspendierten Zellen in einer 60-Millimeter-Sterilschale. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5%Kohlendioxid-Inkubator.Nach achtundvierzig Stunden Lentivirus-Infektion in HEK-293T-Zellen wurde der Erfolg der konzentrierten Lentivirus-Produktion durch Beobachtung der Fluoreszenzintensität von GFP oder durch Durchflusszytometrie bewertet. Der Titer des konzentrierten Virus war bei 10 bis zur 8. TU / ml hoch. Während der direkten Reprogrammierung der Fibroblasten änderte sich die Zellmorphologie allmählich zu länglichen Zellsynapsen und vergrößerten Zellkernen.Die Zellen alterten jedoch nach dem zwanzigsten Tag zunehmend. Die Entfernung der Transkriptionsfaktoren Mitf, Pax3 oder Sox10 führte zum Schweigen der Expression der melanozytären Gene Tyr, Tyrp1 und Mlana, was auf den größten Einfluss auf die Umwandlung von Fibroblasten in Melanozyten hinweist. Daher war die Expression von melanozytären Genen, die durch die direkte Programmierung mit drei Transkriptionsfaktoren induziert wurden, im Vergleich zu sechs Transkriptionsfaktoren höher.Zur Identifizierung von MEF-induzierten Melanozyten oder iMels, der Expression von melanozytären Markern, wurde TYRP1 und DCT mittels Immunfluoreszenzfärbung nachgewiesen. Darüber hinaus zeigten die Melanin-spezifischen Färbemethoden wie DOPA und Masson-Fontana-Färbung positive Ergebnisse. Die 293T-Zellen sollten gleichmäßig verteilt sein.Auch die Zugabe von Transfektionsmischung zu Zellen muss sanft erfolgen, um zu verhindern, dass die Zellen schweben. Das Protokoll ist stabil und praktisch und kann verwendet werden, um andere Arten von Zellen neu zu programmieren. Es wird erwartet, dass es eine Referenz und eine Strategie für die direkte In-vivo-Reprogrammierung der Melanozytenregeneration in der zukünftigen Medizin liefern wird.

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Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Stabile und effiziente genetische Veränderung von Zellen in der erwachsenen Maus V-SVZ für die Analyse von Neural Stem Cell Autonome und Nicht autonome Effekte

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Methoden für die genau zu lokalisieren Übertragung von Zellen oder DNA in frühen Postimplantations Maus Embryonen

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

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Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

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Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Protokoll für die direkte Umwandlung von murinen embryonalen Fibroblasten in Trophoblast Stammzellen

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren

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Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

Bedingte Reprogrammierung von Pediatric menschliche Speiseröhre Epithelzellen für den Einsatz im Tissue Engineering and Disease Investigation

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

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Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Reprogrammierung primäre Fruchtwasser und Membrane Zellen zur Pluripotenz in Xeno-freien Bedingungen

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