Name: direct reprogramming of mouse fibroblasts into melanocytes
Uploaded: 2021-08-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes at JoVE.com

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82070638 ו-81770621) ומהקרן למדעי הטבע של מחוז ג'יאנגסו (BK20180281).

עבודה זו אושרה על ידי הוועדה לניהול ושימוש בחיות מעבדה באוניברסיטת ג'יאנגסו (UJS-IACUC-AP--20190305010). הניסויים בוצעו תוך הקפדה על התקנים שנקבעו על ידי האגודה להערכה והסמכה של ארגון המחקר הבינלאומי לטיפול בחיות מעבדה (AAALAC International). לא היו ניסויים שבהם היו מעורבים בני אדם, ולכן עבודה זו לא הייתה זקוקה ...

<ol>
	<li>Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo.">Vitiligo.</a> Lancet. 386 (9988), 74-84 (2015).</li><li>Picardo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo.">Vitiligo.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15011 (2015).</li><li>Speeckaert, R., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo:+An+update+on+pathophysiology+and+treatment+options.">Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options.</a> American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).</li><li>Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo+management:+combination+of+surgical+treatment+and+phototherapy+under+reflectance+confocal+microscopy+monitoring.">Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).</li><li>Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+therapies+for+vitiligo.">Surgical therapies for vitiligo.</a> Dermatologic Clinics. 35 (2), 193-203 (2017).</li><li>Bishnoi, A., Parsad, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+molecular+aspects+of+vitiligo+treatments.">Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments.</a> International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509 (2018).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+transcription+factor-mediated+reprogramming+to+pluripotency.">A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).</li><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-based+cell+therapy-promise+and+challenges.">Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges.</a> Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).</li><li>Xu, J., Du, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming:+strategies,+mechanisms,+and+applications.">Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li><li>Gasc&#243;n, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., G&#246;tz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neuronal+reprogramming:+achievements,+hurdles,+and+new+roads+to+success.">Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success.</a> Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).</li><li>Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cellular+reprogramming+and+inner+ear+regeneration.">Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).</li><li>Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+wound-resident+cells+generates+skin+epithelial+tissue.">In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue.</a> Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).</li><li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+to+functional+melanocytes+by+defined+factors.">Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors.</a> Nature Communications. 5, 5807 (2014).</li><li>Fehrenbach, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+tumorigenic+potential+upon+transdifferentiation+from+keratinocytic+into+melanocytic+lineage.">Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage.</a> Scientific Reports. 6, 28891 (2016).</li><li>Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+extracting+RNA+and+genomic+DNA+from+archived+human+blood+and+muscle.">A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle.</a> Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).</li><li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-transcription+PCR+(RT-PCR).">Reverse-transcription PCR (RT-PCR).</a> Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).</li><li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+staining.">Immunofluorescence staining.</a> Current Protocols in Cell Biology. 69 (1), 1-7 (2015).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+vectors+for+gene-based+therapy.">Non-viral vectors for gene-based therapy.</a> Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).</li></ol>

איכות הנגיף חיונית להצלחת התכנות מחדש הישיר למלנוציטים בפרוטוקול זה. השיטה של אריזה וריכוז וירוסים בפרוטוקול זה היא פשוטה וקלה לחזרה ואינה מסתמכת על כל מגיב מרוכז עזר אחר. פרוטוקול זה ניתן לעקוב בהצלחה ברוב המעבדות. כדי להבטיח את איכות הנגיף המרוכז, הנקודות הבאות זקוקות לתשומת לב מיוחדת. ?...

ויטיליגו היא מחלת עור המשפיעה קשות על בריאותם הגופנית והנפשית של האנשים המושפעים. מסיבות שונות, כולל הפרעות מטבוליות, עקה חמצונית, יצירת מתווכים דלקתיים, ניתוק תאים ותגובה אוטואימונית, המלנוציטים התפקודיים הולכים לאיבוד, והפרשת המלנין נעצרת, מה שמוביל להתפתחות של ויטיליגו 1,2. מצב זה מתרחש באופן נרחב והוא בעייתי במיוחד על הפנים. הטיפול העיקרי הוא שימוש סיסטמי בקורטיקוסטרואידים ובאימונומודולטורים. פוטותרפיה יכולה לשמש למחלות סיסטמיות או מקומיות, וישנם טיפולים כירורגיים, כגון השתלת עור מחורר והשתלת מלנוציטים אוטולוגית 3,4,5. עם זאת, חולים המשתמשים בטיפול תרופתי ובפוטותרפיה נוטים להישנות, ולטיפולים אלה יש השפעות טיפוליות ארוכות טווח גרועות. הטיפול הכירורגי הוא טראומטי ויעיל למדי רק 2,6. לכן, יש צורך באסטרטגיה טיפולית חדשה ויעילה עבור ויטיליגו.
התכנות מחדש של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) הופך את התאים האלה ממצבם הסופי למצב פלוריפוטנטי, תהליך המתווך על ידי גורמי השעתוק, Oct4, Sox2, Klf4 ו-c-Myc7. עם זאת, בשל האפשרות של גידולים סרטניים וזמן הייצור הארוך, טכנולוגיה זו נתקלה בספקנות כאשר יושמה על הגדרות קליניות8. תכנות מחדש ישיר הוא טכנולוגיה שגורמת לסוג אחד של תא סופני להפוך לסוג אחר של תא סופני9. תהליך זה מושג על ידי גורמי שעתוק מתאימים. תאים שונים כבר תוכננו מחדש ישירות בהצלחה, כולל קרדיומיוציטים10, נוירונים11 ותאי שיער שבלול12. חלק מהחוקרים אף תיכנתו מחדש את רקמת העור ישירות באתרה, שיכולה לשמש לתיקוןפצעים 13. היתרונות של תכנות מחדש ישיר כוללים זמני המתנה ועלויות מופחתים, סיכון נמוך יותר לסרטן, פחות בעיות אתיות והבנה טובה יותר של המנגנון העומד בבסיס קביעת גורל התא9.
למרות ששיטת התכנות מחדש הישירה נמצאת בשימוש נרחב, אין כיום שיטה מוגדרת לתכנות מחדש ישיר של תאי עור למלנוציטים, במיוחד בגלל גורמי השעתוק הרבים להיחשב14,15. גורמי השעתוק, Mitf, Sox10 ו-Pax3, שימשו לתכנות מחדש ישיר של תאי העור למלנוציטים14. לעומת זאת, השילוב של MITF, PAX3, SOX2 ו-SOX9 שימש גם לתכנות מחדש ישיר של תאי עור למלנוציטים אנושיים במחקר אחר15. בפרוטוקול זה, למרות השימוש בשיטת סינון שונה, אותה תוצאה הושגה עם השילוב של Mitf, Sox10 ו- Pax3 לתכנות מחדש ישיר של תאי עור למלנוציטים כפי שתואר קודם לכן14. פיתוח מערכת ליצירת מלנוציטים מתאי עור אחרים יכול לספק תוכנית להפיכת תאי עור אחרים של חולי ויטיליגו למלנוציטים. לפיכך, חיוני לבנות שיטה פשוטה ויעילה לתכנות מחדש ישיר זה כדי ליצור מלנוציטים בהצלחה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-062</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;M filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHVR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene round bottom tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%/100% ethanol</td>
			<td>LANBAO</td>
			<td>210106</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2786</td>
			<td>Stock concentration 40 mg/mL 
			Final concentration 24 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21137</td>
			<td>Dilution of 1:500 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics(Pen/Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRP1/TYRP1 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABC592</td>
			<td>Host/Isotype: Mouse IgG2a 
			Species reactivity: Mouse/Human 
			Dilution of 1:200 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRP2/DCT Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab74073</td>
			<td>Host/Isotype: Rabbit IgG 
			Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>Stock concentration 10 mM 
			Final concentration 3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td>Stock concentration 0.3 mg/mL 
			Final concentration 20 pM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-165-144</td>
			<td>Dilution of 1:500 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (High glucose)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C 
			Heat-inactivated before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2)</td>
			<td>Hanheng Biological Technology Co., Ltd.</td>
			<td>pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab220365</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EDN3</td>
			<td>American-Peptide</td>
			<td>88-5-10A</td>
			<td>Stock concentration 100 &#956;M 
			Final concentration 0.1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/mL 
			Final concentration 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-DOPA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9628</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Transfection reagent, stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson-Fontana staining kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G2032</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral balsam</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8590</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (-)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Stock concentration 1 mM 
			Final concentration 200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td>cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 &#956;g/&#181;L 
			Final concentration 4 ng/&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13256-029</td>
			<td>Stock concentration 4 &#956;g/mL 
			Final concentration 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human insulin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>I3536</td>
			<td>Stock concentration 10 mg/mL 
			Final concentration 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human SCF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>255-SC-010</td>
			<td>Stock concentration 200 &#956;g/mL 
			Final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1330-20-7</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct reprogramming of mouse fibroblasts into melanocytes

אובדן התפקוד של מלנוציטים מוביל vitiligo, אשר משפיע ברצינות על הבריאות הפיזית והנפשית של האנשים המושפעים. כיום, אין טיפול יעיל לטווח ארוך עבור vitiligo. לכן, זה הכרחי לפתח טיפול נוח ויעיל עבור vitiligo. טכנולוגיית רפואה רגנרטיבית לתכנות מחדש ישיר של תאי עור למלנוציטים נראית כטיפול חדשני ומבטיח בויטיליגו. זה כרוך בתכנות מחדש ישיר של תאי העור של המטופל למלנוציטים תפקודיים כדי לעזור למתן את אובדן המלנוציטים בחולים עם ויטיליגו. עם זאת, שיטה זו צריכה להיבדק תחילה על עכברים. למרות שתכנות מחדש ישיר נמצא בשימוש נרחב, אין פרוטוקול ברור לתכנות מחדש ישיר למלנוציטים. יתר על כן, מספר גורמי השעתוק הזמינים הוא מכריע. 
כאן, פרוטוקול מערכת אריזה מרוכזת של lentivirus מוצג כדי לייצר גורמי שעתוק שנבחרו לתכנות מחדש של תאי עור למלנוציטים, כולל Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 ו- Snai2. פיברובלסטים עובריים של עכברים (MEFs) נדבקו בנגיף הלנטי המרוכז עבור כל גורמי השעתוק הללו לתכנות מחדש ישיר של ה-MEFs למלנוציטים מושרים (iMels) במבחנה. יתר על כן, גורמי שעתוק אלה נבדקו, והמערכת הותאמה לתכנות מחדש ישיר למלנוציטים. הביטוי של הסמנים האופייניים של מלנין ב- iMels ברמת הגן או החלבון היה מוגבר באופן משמעותי. תוצאות אלה מצביעות על כך שתכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים למלנוציטים יכול להיות אסטרטגיה טיפולית חדשה ומוצלחת עבור ויטיליגו ולאשר את המנגנון של התפתחות מלנוציטים, אשר יספק את הבסיס לתכנות מחדש ישיר נוסף של פיברובלסטים למלנוציטים in vivo.

מאמר זה כולל את הפרוטוקולים של מערכת אריזה מרוכזת של lentivirus לייצור lentivirus של גורמי שעתוק לתכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים למלנוציטים ופרוטוקולים לסינון גורמי שעתוק ותכנות מחדש ישיר של מלנוציטים מ- MEFs.
ההצלחה של ייצור לנטי-וירוס מרוכז הוערכה על ידי התבוננות בעוצמת הפלואורסצנט...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes at JoVE.com

Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes

כאן, אנו מתארים מערכת תכנות מחדש ישירה ממוטבת עבור מלנוציטים ומערכת אריזה מרוכזת של וירוסים ביעילות גבוהה המבטיחה תכנות מחדש ישיר חלק.

תכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים של עכברים למלנוציטים

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, ...

דווח על תכנות מחדש ישיר ליצירת מלנוציטים. עם זאת, גורמי שעתוק שונים משמשים במחקרים שונים. בפרוטוקול זה, אימתנו והפחתנו את מספר גורמי השעתוק עדיין עם יעילות תכנות מחדש גבוהה יותר.הקמנו מערכת תכנות מחדש ישירה כדי ליצור מלנוציטים באמצעות שלושה גורמי שעתוק בלבד, Mitf, Sox10 ו-PAX3, ושינינו את מערכת התרבית כדי להפוך אותה ליציבה וחזקה יותר. כיצד לחדש מלנוציטים תפקודיים היא שאלה משמעותית שעשויה לעזור לטפל במגבלות הטיפול במחלות דפיגמנטציה כמו ויטיליגו. התכנות מחדש הנכון מספק פרוספקטיבי הטכניקה שלנו יש את המאפיינים של נוחות, יכולת פעולה חזקה ויציבות, אשר קל יותר לקדם ולחזור.כדי להתחיל בייצור של נגיף הלנטי המרוכז, צלחת 1.5 כפול 10 עד 6 תאי HEK-293T לתוך צלחת של 60 מילימטר, ותרבית את התאים עם תווך נורמלי ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר 24 שעות של הדגירה, כאשר תאי HEK-293T הגיעו ל-80 עד 90% מפגש, החליפו את המדיום ב-3.5 מ"ל של DMEM, ואז דגירו את התאים ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% פחמן דו-חמצני במשך שעתיים. לאחר הסרת התאים מהאינקובטור, החליפו את המדיום ב-DMEM המכיל 2%FBS, והוסיפו את תערובת קומפלקס הטרנספקציה שזה עתה הוכנה לתאים בצורה טיפתית.מערבבים את התערובת הנוזלית בעדינות. בסיום שמונה שעות, לשנות את מדיום התא עם 3.5 מ"ל של בינוני נורמלי. לאסוף את supernatant וירוס ב 24 ו 48 שעות.לאחר מכן, ערבבו את הווירוסים שנאספו בשתי נקודות זמן שונות וצנטריפוגות בתערובת ב-200 xg למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן מעבירים את הסופרנטנט שנאסף דרך מסנני 0.45 מיקרון כדי לאסוף את התסיס בצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל. מרכזים את הווירוס המסונן על ידי צנטריפוגה ב-6, 000 xg בארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה.לאחר שתסיים, ודא שכדור הנגיף נראה בתחתית הצינור החרוטי. שופכים את ה-supernatant לאט. להמסת גלולת הנגיף במדיום התקין עם נפח אחד על 100*של הווירוס.השתמשו במיקרופיפט P1000 כדי לטפטף למעלה ולמטה בעדינות עד לקבלת תערובת וירוסים מרוכזת הומוגנית פי 100. מחלקים את הנגיף המרוכז לצינורות המיקרו-צנטריפוג' כדי לאחסן אותם בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס. צלחת 1 כפול 10 עד 5 תאי HEK-293T לתוך באר אחת של צלחת שש באר.תרבית תאים אלה עם המדיום הנורמלי ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר 24 שעות, הוסף 0.1 עד 0.2 מיקרוליטרים של הנגיף המרוכז 100x פלואורסצנטי לכל באר. לאחר מכן נוספו ארבעה ננוגרמים לכל מיקרוליטרים של מגיב הטרנספקציה הפולימרית הקטיונית לכל באר.כשמונה עד שתים עשרה שעות לאחר ההדבקה בנגיף, החליפו את המדיום במדיום הרגיל. בארבעים ושמונה שעות לאחר ההדבקה, שטפו את התבשיל עם 1 מ"ל של PBS סטרילי כדי להסיר את התאים המתים. לאחר מכן נסה את התאים באמצעות 250 מיקרוליטרים של תמיסת 0.05% טריפסין-EDTA לכל באר של צלחת בעלת שש בארות בטמפרטורת החדר.צנטריפוגה על הלוח ב 200 xg במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסרת הסופרנטנט, השעו מחדש את גלולת התא במ"ל אחד של PBS והוסיפו את תרחיף התא לצינור פוליסטירן בעל תחתית עגולה של חמישה מ"ל. לאחר מכן מניחים את הצינור לתוך ציטומטר הזרימה כדי לנתח את הדגימה.לתכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים, ציפו באר אחת של צלחת תרבית תאים בת שש בארות עם תמיסת ג'לטין של 1 מ"ל של 0.1% בטמפרטורת החדר. לאחר 15 עד 30 דקות, כאשר הבאר מכוסה לחלוטין בג'לטין, שאפו לתמיסת ג'לטין 0.1%. לאחר מכן, צלחת 5 כפול 10 עד הפיברובלסטים העובריים של העכבר הרביעי, או MEFs, לתוך באר אחת של צלחת בעלת שש בארות המצופה בג'לטין של 0.1%, ותרבית את התאים למשך הלילה עם המדיום הרגיל ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5% פחמן דו-חמצני.לאחר 24 שעות, כאשר ה- MEFs הגיעו למפגש של 40 עד 50%, החלף את המדיום במדיום הרגיל. לאחר מכן, להמיס את הנגיף הקפוא והמרוכז על קרח. חשב את נפח הנגיף שיש להוסיף באמצעות משוואה ולאחר מכן הוסף את הווירוס המרוכז עבור ששת גורמי השעתוק לכל באר, בהתאם לנפח המחושב.הוסף ארבעה מיקרוגרם לכל מ"ל של חומר הטרנספקציה הפולימרית הקטיונית לבאר. שקול את זה כמו יום אפס של זיהום lentivirus. ביום הראשון, לאחר 8 עד 12 שעות של הדבקה, החליפו את המדיום המכיל את הנגיף במדיום הנורמלי הטרי, תוך הוספת 0.5 מיקרוגרם לפורומיצין מ"ל כדי לסנן קווי תאים נגועים יציבים.ביום השני, 48 שעות לאחר ההדבקה, החליפו את מדיום העל בהדרגה במדיום התכנות מחדש. שנה רבע מהנפח הבינוני הכולל לפני שתוסיף שלושה מיקרומולרים CHIR99021. מהיום השלישי ועד היום השביעי, בהתאם למצבם של התאים, משנים את המדיום על ידי החלפתו בהדרגה בשיעור גבוה יותר של מדיום תכנות מחדש כדי לעבור למדיום התכנות מחדש המלא תוך חמישה ימים.לאחר מכן, נתקו את התאים עם 500 מיקרוליטרים של אנזים העיכול 0.05% טריפסין-EDTA למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. כאשר כשישים אחוז מהתאים צפו למעלה, עצרו את העיכול על ידי הוספת המדיום התקין, פי שניים מנפח אנזים העיכול. אספו את מתלי התא בצינור חרוטי סטרילי של 15 מ"ל לצנטריפוגה ב-200 xg במשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.הסר את ה-supernatant לפני השהייה מחדש של גלולת התא עם מדיום התכנות מחדש. בסיום, צלחת את התאים התלויים מחדש בצלחת סטרילית של 60 מילימטר. תרבית את התאים ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% פחמן דו-חמצני.לאחר ארבעים ושמונה שעות של זיהום lentivirus בתאי HEK-293T, ההצלחה של ייצור לנטיוירוס מרוכז הוערכה על ידי התבוננות בעוצמת הפלואורסצנציה של GFP או על ידי ציטומטריה של זרימה. נמצא כי הטיטר של הנגיף המרוכז היה גבוה ב-10 עד ה-TU/mL ה-8. במהלך התכנות מחדש הישיר של הפיברובלסטים, המורפולוגיה של התא השתנתה בהדרגה לסינפסה התארית ולגרעיני תאים מוגדלים.עם זאת, התאים הזדקנו בהדרגה לאחר היום העשרים. הסרת גורמי השעתוק, Mitf, Pax3 או Sox10, הביאה להשתקת הביטוי של גנים מלנוציטיים, Tyr, Tyrp1 ו-Mlana, מה שמעיד על ההשפעה הגדולה ביותר על המרת פיברובלסטים למלנוציטים. לפיכך, הביטוי של גנים מלנוציטיים המושרים על ידי התכנות הישיר עם שלושה גורמי שעתוק היה גבוה יותר בהשוואה לשישה גורמי שעתוק.כדי לזהות מלנוציטים המושרים על ידי MEF, או iMels, הביטוי של סמנים מלנוציטיים, TYRP1 ו- DCT זוהה באמצעות כתמים אימונופלואורסצנטיים. יתר על כן, שיטות ההכתמה הספציפיות למלנין כגון DOPA וצביעת מאסון-פונטנה הראו תוצאות חיוביות. תאי 293T צריכים להיות מופצים באופן שווה.כמו כן, התוספת של תערובת טרנספקציה לתאים חייבת להיעשות בעדינות כדי למנוע מהתאים לצוף. הפרוטוקול יציב ומעשי וניתן להשתמש בו כדי לתכנת מחדש סוגים אחרים של תאים. הוא מצפה לספק התייחסות ואסטרטגיה לתכנות מחדש ישיר in vivo בהתחדשות מלנוציטים ברפואה עתידית.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Developmental Biology

Unit 1

The Integumentary System

SCIENTISTS IN ACTION

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

הנדסה גנטית יציבה ויעילה של תאי V-SVZ העכבר למבוגרים עבור הניתוח של הגזע עצבי נייד אוטונומי והשפעות חד אוטונומיות

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

שיטות להעברת לוקליזציה דווקא של תאים או DNA לPostimplantation המוקדם עכבר עוברים

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

מזין ללא גזירת &quot;מלנוציטים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנוש

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

מדידת קינטי Real Time ויזואליזציה של תכנות מחדש סומטיים

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

פרוטוקול עבור ההמרה הישירה של Murine העוברי פיברובלסטים לתאי גזע Trophoblast

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

תכנות מחדש עכבר עוברי פיברובלסטים עם גורמי שעתוק כדי לגרום תכנית Hemogenic

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

הקמת תאי tetraploid Proliferative מ Nontransformed אדם פיברובלסטים

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

תכנות מחדש מותנה של תאי אפיתל ושט האדם Pediatric לשימוש בהנדסת רקמות וחקירת מחלות

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

הערכה תת סוגי Cardiomyocyte בעקבות תמלול פקטור בתיווך תכנות מחדש של פיברובלסטים עכבר עובריים

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

התכנות ראשי מי שפיר ו ממברנות התאים כדי Pluripotency בתנאים קסנו-חופשית

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...