Name: direct reprogramming of mouse fibroblasts into melanocytes
Uploaded: 2021-08-27T14:30:00
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इस अध्ययन को आंशिक रूप से चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (82070638 और 81770621) और जियांग्सू प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (बीके 20180281) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

इस काम को जियांग्सू विश्वविद्यालय (यूजेएस-आईएसीयूसी-एपी --20190305010) में प्रयोगशाला पशु प्रबंधन और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। प्रयोगों को एसोसिएशन फॉर असेसमेंट एंड एक्रिडिटेशन ऑफ लेबोरेटरी ?...

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	<li>Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo.">Vitiligo.</a> Lancet. 386 (9988), 74-84 (2015).</li><li>Picardo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo.">Vitiligo.</a> Nature Reviews. 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इस प्रोटोकॉल में मेलानोसाइट्स को प्रत्यक्ष रिप्रोग्रामिंग की सफलता के लिए वायरस की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में पैकेजिंग और ध्यान केंद्रित करने वाले वायरस की विधि सरल और दोहराने में आस?...

विटिलिगो एक त्वचा रोग है जो प्रभावित व्यक्तियों के शारीरिक और मानसिक स्वास्थ्य को गंभीर रूप से प्रभावित करता है। चयापचय संबंधी असामान्यताओं, ऑक्सीडेटिव तनाव, भड़काऊ मध्यस्थों की पीढ़ी, सेल टुकड़ी और ऑटोइम्यून प्रतिक्रिया सहित विभिन्न कारणों से, कार्यात्मक मेलानोसाइट्स खो जाते हैं, और मेलेनिन का स्राव बंद हो जाता है, जिससे विटिलिगो 1,2 का विकास होता है। यह स्थिति व्यापक रूप से होती है और चेहरे पर विशेष रूप से समस्याग्रस्त होती है। मुख्य उपचार कॉर्टिकोस्टेरॉइड्स और इम्यूनोमोड्यूलेटर का प्रणालीगत उपयोग है। फोटोथेरेपी का उपयोग प्रणालीगत या स्थानीय बीमारियों के लिए किया जा सकता है, और सर्जिकल उपचार हैं, जैसे छिद्रित त्वचा प्रत्यारोपण और ऑटोलॉगस मेलानोसाइट प्रत्यारोपण 3,4,5। हालांकि, ड्रग थेरेपी और फोटोथेरेपी का उपयोग करने वाले रोगियों को पुनरुत्थान का खतरा होता है, और इन उपचारों में खराब दीर्घकालिक चिकित्सीय प्रभाव होते हैं। सर्जिकल उपचार दर्दनाक है और केवल मामूली प्रभावी 2,6 है। इसलिए, विटिलिगो के लिए एक नई और प्रभावी चिकित्सीय रणनीति की आवश्यकता है।
प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) का रीप्रोग्रामिंग इन कोशिकाओं को उनके टर्मिनल राज्य से प्लुरिपोटेंट अवस्था में उलट देता है, प्रतिलेखन कारकों, अक्टूबर 4, सोक्स 2, केएलएफ 4 और सी-माइक7 द्वारा मध्यस्थता की जाने वाली प्रक्रिया। हालांकि, ट्यूमरजेनेसिटी की संभावना और लंबे उत्पादन समय के कारण, नैदानिक सेटिंग्स8 पर लागू होने पर इस तकनीक को संदेह के साथ मुलाकात की गई है। डायरेक्ट रीप्रोग्रामिंग एक ऐसी तकनीक है जो एक प्रकार के टर्मिनल सेल को दूसरे प्रकार के टर्मिनल सेल9 में बदल देती है। यह प्रक्रिया उपयुक्त प्रतिलेखन कारकों द्वारा प्राप्त की जाती है। विभिन्न कोशिकाओं को पहले से ही सफलतापूर्वक पुन: प्रोग्राम किया गया है, जिसमें कार्डियोमायोसाइट्स10, न्यूरॉन्स11 और कॉक्लियर हेयर सेल12 शामिल हैं। कुछ शोधकर्ताओं ने त्वचा के ऊतकों को सीधे सीटू में पुन: प्रोग्राम किया है, जिसका उपयोग घाव की मरम्मत के लिए किया जा सकताहै 13. प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के फायदों में कम प्रतीक्षा समय और लागत, कैंसर का कम जोखिम, कम नैतिक समस्याएं और सेल भाग्य निर्धारण अंतर्निहित तंत्र की बेहतर समझ शामिलहै 9.
यद्यपि प्रत्यक्ष रिप्रोग्रामिंग विधि का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, वर्तमान में मेलानोसाइट्स में त्वचा कोशिकाओं के प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए कोई निश्चित विधि नहीं है, खासकर कई प्रतिलेखन कारकों के कारण14,15 माना जाता है। प्रतिलेखन कारक, मिटीएफ, सोक्स 10 और पैक्स 3, का उपयोग मेलानोसाइट्स14 में त्वचा कोशिकाओं के प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए किया गया है। इसके विपरीत, एमआईटीएफ, पैक्स 3, एसओएक्स 2 और एसओएक्स 9 के संयोजन का उपयोग एक अन्य अध्ययन15 में मानव मेलानोसाइट्स में त्वचा कोशिकाओं के प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए भी किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, एक अलग स्क्रीनिंग विधि के उपयोग के बावजूद, एक ही परिणाम मेलानोसाइट्स में त्वचा कोशिकाओं के प्रत्यक्ष पुन: प्रोग्रामिंग के लिए mitf, Sox10, और पैक्स 3 के संयोजन के साथ प्राप्त किया गया था जैसा कि पहले14 वर्णित है। अन्य त्वचा कोशिकाओं से मेलानोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए एक प्रणाली विकसित करना विटिलिगो रोगियों की अन्य त्वचा कोशिकाओं को मेलानोसाइट्स में बदलने के लिए एक योजना प्रदान कर सकता है। इसलिए, मेलेनोसाइट्स को सफलतापूर्वक उत्पन्न करने के लिए इस प्रत्यक्ष रिप्रोग्रामिंग के लिए एक सरल और कुशल विधि का निर्माण करना महत्वपूर्ण है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-062</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;M filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHVR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene round bottom tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%/100% ethanol</td>
			<td>LANBAO</td>
			<td>210106</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2786</td>
			<td>Stock concentration 40 mg/mL 
			Final concentration 24 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21137</td>
			<td>Dilution of 1:500 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics(Pen/Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRP1/TYRP1 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABC592</td>
			<td>Host/Isotype: Mouse IgG2a 
			Species reactivity: Mouse/Human 
			Dilution of 1:200 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRP2/DCT Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab74073</td>
			<td>Host/Isotype: Rabbit IgG 
			Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>Stock concentration 10 mM 
			Final concentration 3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td>Stock concentration 0.3 mg/mL 
			Final concentration 20 pM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-165-144</td>
			<td>Dilution of 1:500 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (High glucose)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C 
			Heat-inactivated before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2)</td>
			<td>Hanheng Biological Technology Co., Ltd.</td>
			<td>pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab220365</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EDN3</td>
			<td>American-Peptide</td>
			<td>88-5-10A</td>
			<td>Stock concentration 100 &#956;M 
			Final concentration 0.1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/mL 
			Final concentration 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-DOPA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9628</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Transfection reagent, stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson-Fontana staining kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G2032</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral balsam</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8590</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (-)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Stock concentration 1 mM 
			Final concentration 200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td>cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 &#956;g/&#181;L 
			Final concentration 4 ng/&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13256-029</td>
			<td>Stock concentration 4 &#956;g/mL 
			Final concentration 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human insulin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>I3536</td>
			<td>Stock concentration 10 mg/mL 
			Final concentration 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human SCF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>255-SC-010</td>
			<td>Stock concentration 200 &#956;g/mL 
			Final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1330-20-7</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct reprogramming of mouse fibroblasts into melanocytes

मेलानोसाइट्स के कार्य का नुकसान विटिलिगो की ओर जाता है, जो प्रभावित व्यक्तियों के शारीरिक और मानसिक स्वास्थ्य को गंभीररूप से प्रभावित करता है। वर्तमान में, विटिलिगो के लिए कोई प्रभावी दीर्घकालिक उपचार नहीं है। इसलिए, विटिलिगो के लिए एक सुविधाजनक और प्रभावी उपचार विकसित करना आवश्यक है। मेलानोसाइट्स में त्वचा कोशिकाओं के प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए पुनर्योजी चिकित्सा प्रौद्योगिकी विटिलिगो का एक आशाजनक उपन्यास उपचार प्रतीत होता है। इसमें विटिलिगो के रोगियों में मेलानोसाइट्स के नुकसान को कम करने में मदद करने के लिए कार्यात्मक मेलानोसाइट्स में रोगी की त्वचा कोशिकाओं का प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग शामिल है। हालांकि, इस विधि को पहले चूहों पर परीक्षण करने की आवश्यकता है। यद्यपि प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, मेलानोसाइट्स में प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए कोई स्पष्ट प्रोटोकॉल नहीं है। इसके अलावा, उपलब्ध प्रतिलेखन कारकों की संख्या भारी है। 
यहां, एक केंद्रित लेंटीवायरस पैकेजिंग सिस्टम प्रोटोकॉल को सोलेनोसाइट्स के लिए त्वचा कोशिकाओं को पुन: प्रोग्राम करने के लिए चुने गए प्रतिलेखन कारकों का उत्पादन करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है, जिसमें सोक्स 10, मिटीएफ, पैक्स 3, सोक्स 2, सोक्स 9 और एसएनएआई 2 शामिल हैं। माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ) इन विट्रो में प्रेरित मेलानोसाइट्स (आईमेल्स) में एमईएफ के प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए इन सभी प्रतिलेखन कारकों के लिए केंद्रित लेंटिवायरस से संक्रमित थे। इसके अलावा, इन प्रतिलेखन कारकों की जांच की गई थी, और सिस्टम को मेलानोसाइट्स के लिए प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए अनुकूलित किया गया था। जीन या प्रोटीन स्तर पर आईमेल्स में मेलेनिन के विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति में काफी वृद्धि हुई थी। इन परिणामों से पता चलता है कि मेलानोसाइट्स के लिए फाइब्रोब्लास्ट्स का प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग विटिलिगो के लिए एक सफल नई चिकित्सीय रणनीति हो सकती है और मेलानोसाइट विकास के तंत्र की पुष्टि कर सकती है, जो विवो में मेलानोसाइट्स में फाइब्रोब्लास्ट्स के आगे प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए आधार प्रदान करेगी।

इस लेख में मेलानोसाइट्स के लिए फाइब्रोब्लास्ट्स के प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए प्रतिलेखन कारकों के लेंटिवायरस का उत्पादन करने के लिए एक केंद्रित लेंटिवायरस पैकेजिंग सिस्टम के प्रोटोकॉल और प्?...

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Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes

यहां, हम मेलानोसाइट्स के लिए एक अनुकूलित प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग सिस्टम और एक उच्च दक्षता, केंद्रित वायरस पैकेजिंग सिस्टम का वर्णन करते हैं जो चिकनी प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग सुनिश्चित करता है।

मेलानोसाइट्स में माउस फाइब्रोब्लास्ट्स का प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, ...

मेलानोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए प्रत्यक्ष रिप्रोग्रामिंग की सूचना दी गई है। हालांकि, विभिन्न अध्ययनों में विभिन्न प्रतिलेखन कारकों का उपयोग किया जाता है। इस प्रोटोकॉल में, हमने उच्च रिप्रोग्रामिंग दक्षता के साथ अभी भी प्रतिलेखन कारक संख्या को मान्य और कम किया है।हमने केवल तीन प्रतिलेखन कारकों, एमआईटीएफ, सोक्स 10 और पीएएक्स 3 का उपयोग करके मेलानोसाइट्स उत्पन्न करने के लिए एक प्रत्यक्ष रिप्रोग्रामिंग प्रणाली की स्थापना की, और इसे अधिक स्थिर और मजबूत बनाने के लिए संस्कृति प्रणाली को संशोधित किया। कार्यात्मक मेलानोसाइट्स को पुनर्जीवित कैसे करें, यह एक महत्वपूर्ण सवाल है जो विटिलिगो जैसे डिपिग्मेंटेशन रोगों के लिए चिकित्सा सीमाओं को संबोधित करने में मदद कर सकता है। सही रीप्रोग्रामिंग एक संभावित प्रदान करता है हमारी तकनीक में सुविधा, मजबूत संचालन और स्थिरता की विशेषताएं हैं, जो बढ़ावा देना और दोहराना आसान है।केंद्रित लेंटिवायरस का उत्पादन शुरू करने के लिए, 60 मिलीमीटर डिश में 6 एचईके -293 टी कोशिकाओं को 1.5 गुना 10 प्लेट करें, और 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ आर्द्र इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सामान्य माध्यम वाली कोशिकाओं को संस्कृति दें। इनक्यूबेशन के 24 घंटों के बाद, जब एचईके -293 टी कोशिकाएं 80 से 90% संगम तक पहुंच गई हैं, तो माध्यम को डीएमईएम के 3.5 एमएल के साथ बदलें, फिर दो घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ आर्द्र इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं। इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को हटाने के बाद, 2% एफबीएस युक्त डीएमईएम के साथ माध्यम को प्रतिस्थापित करें, और बूंद-वार तरीके से कोशिकाओं में ताजा तैयार अभिकर्मक जटिल मिश्रण जोड़ें।तरल मिश्रण को धीरे से मिलाएं। आठ घंटे के पूरा होने पर, सामान्य माध्यम के 3.5 मिलीलीटर के साथ सेल माध्यम बदलें। 24 और 48 घंटे में वायरस सतह पर तैरनेवाला ले लीजिए।इसके बाद, दो अलग-अलग समय बिंदुओं पर एकत्र किए गए वायरस सतह पर तैरनेवालों को मिलाएं और मिश्रण को चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 200 एक्सजी पर अपकेंद्रित्र करें। फिर 50-एमएल बाँझ शंक्वाकार ट्यूब में छानना इकट्ठा करने के लिए 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से एकत्र सतह पर तैरनेवाला पास करें। रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर 6, 000 एक्सजी पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा फ़िल्टर किए गए वायरस सतह पर तैरनेवाला ध्यान केंद्रित करें।एक बार हो जाने के बाद, सुनिश्चित करें कि वायरस गोली शंक्वाकार ट्यूब के तल पर दिखाई दे रही है। सतह पर तैरनेवाला धीरे-धीरे बाहर डालो। वायरस सतह पर तैरनेवाला के एक से 100 वें * मात्रा के साथ सामान्य माध्यम में वायरस गोली को भंग करने के लिए।एक समरूप 100x केंद्रित वायरस मिश्रण प्राप्त होने तक धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पिपेट करने के लिए एक पी 1000 माइक्रोपिपेट का उपयोग करें। 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए केंद्रित वायरस को माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में विभाजित करें। प्लेट 1 बार 10 से 5 वीं एचईके -293 टी कोशिकाओं को छह अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में।5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ एक आर्द्र इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सामान्य माध्यम के साथ इन कोशिकाओं को संस्कृति। 24 घंटों के बाद, प्रत्येक कुएं में 100x फ्लोरोसेंट केंद्रित वायरस के 0.1 से 0.2 माइक्रोलीटर जोड़ें। प्रत्येक कुएं में धनायनिक बहुलक अभिकर्मक अभिकर्मक के प्रति माइक्रोलीटर चार नैनोग्राम के अलावा।वायरस के संक्रमण के लगभग आठ से बारह घंटे बाद, माध्यम को सामान्य माध्यम से बदलें। संक्रमण के बाद अड़तालीस घंटे में, मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए बाँझ पीबीएस के 1 एमएल के साथ पकवान धो लें। फिर कमरे के तापमान पर छह अच्छी तरह से प्लेट के प्रति 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान के 250 माइक्रोलीटर का उपयोग करके कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज करें।चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 200 एक्सजी पर प्लेट अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला को हटाने के बाद, पीबीएस के एक एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और सेल निलंबन को पांच एमएल पॉलीस्टाइनिन राउंड-बॉटम ट्यूब में जोड़ें। फिर नमूना का विश्लेषण करने के लिए ट्यूब को प्रवाह साइटोमीटर में रखें।फाइब्रोब्लास्ट्स के प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के लिए, कमरे के तापमान पर 0.1% जिलेटिन समाधान के 1 एमएल के साथ छह अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट के एक कुएं को कोट करें। 15 से 30 मिनट के बाद, जब अच्छी तरह से जिलेटिन के साथ पूरी तरह से कवर किया जाता है, तो 0.1% जिलेटिन समाधान की आकांक्षा करें। अगला, प्लेट 5 बार 10 से 4 वें माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट्स, या एमईएफ, 0.1% जिलेटिन के साथ लेपित छह-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में, और 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ आर्द्र इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सामान्य माध्यम के साथ रात भर कोशिकाओं को संस्कृति दें।24 घंटों के बाद, जब एमईएफ 40 से 50% संगम तक पहुंच गए हैं, तो माध्यम को सामान्य माध्यम से बदलें। अगला, बर्फ पर जमे हुए, केंद्रित वायरस को पिघलाएं। समीकरण का उपयोग करके जोड़े जाने वाले वायरस की मात्रा की गणना करें और फिर गणना की गई मात्रा के अनुसार प्रत्येक कुएं में छह प्रतिलेखन कारकों के लिए केंद्रित वायरस जोड़ें।कुएं में धनायनिक बहुलक अभिकर्मक एजेंट के प्रति एमएल चार माइक्रोग्राम जोड़ें। इसे लेंटीवायरस संक्रमण के दिन शून्य के रूप में मानें। पहले दिन, संक्रमण के 8 से 12 घंटों के बाद, वायरस युक्त माध्यम को ताजा सामान्य माध्यम से बदलें, जबकि स्थिर संक्रमित सेल लाइनों को स्क्रीन करने के लिए 0.5 माइक्रोग्राम प्रति एमएल प्यूरोमाइसिन जोड़ें।दूसरे दिन, संक्रमण के 48 घंटे बाद, सतह पर तैरनेवाला माध्यम को धीरे-धीरे रिप्रोग्रामिंग माध्यम से बदलें। तीन माइक्रोमोलर सीएचआईआर 99021 जोड़ने से पहले कुल मध्यम मात्रा का एक-चौथाई बदलें। कोशिकाओं की स्थिति के आधार पर, दिन तीन से सात दिन तक, पांच दिनों के भीतर पूर्ण रिप्रोग्रामिंग माध्यम पर स्विच करने के लिए धीरे-धीरे इसे रीप्रोग्रामिंग माध्यम के उच्च अनुपात के साथ बदलकर माध्यम को बदलें।इसके बाद, कमरे के तापमान पर तीन मिनट के लिए 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए पाचन एंजाइम के 500 माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं को अलग करें। जब लगभग साठ प्रतिशत कोशिकाएं तैर जाती हैं, तो सामान्य माध्यम को जोड़कर पाचन को रोकें, पाचन एंजाइम की मात्रा का दो गुना। चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 200 एक्सजी पर अपकेंद्रित्र करने के लिए एक 15 एमएल बाँझ शंक्वाकार ट्यूब में सेल निलंबन ले लीजिए।रीप्रोग्रामिंग माध्यम के साथ सेल गोली को फिर से निलंबित करने से पहले सतह पर तैरनेवाला निकालें। जब किया जाता है, तो 60 मिलीमीटर बाँझ पकवान में फिर से निलंबित कोशिकाओं को प्लेट करें। आर्द्र 5% कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को संस्कृति दें।एचईके -293 टी कोशिकाओं में लेंटिवायरस संक्रमण के अड़तालीस घंटों के बाद, केंद्रित लेंटिवायरस उत्पादन की सफलता का मूल्यांकन जीएफपी की प्रतिदीप्ति तीव्रता या प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा किया गया था। केंद्रित वायरस का टिटर 10 से 8 वें टीयू / एमएल पर उच्च पाया गया था। फाइब्रोब्लास्ट्स के प्रत्यक्ष रीप्रोग्रामिंग के दौरान, सेल आकृति विज्ञान धीरे-धीरे लम्बी कोशिका अन्तर्ग्रथन और बढ़े हुए सेल नाभिक में बदल गया।हालांकि, कोशिकाएं बीस दिन के बाद उत्तरोत्तर वृद्ध हो जाती हैं। प्रतिलेखन कारकों को हटाने, एमआईटीएफ, पैक्स 3 या सोक्स 10, मेलेनोसाइटिक जीन, टायर, टायर्प 1 और म्लाना की अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप, मेलानोसाइट्स में फाइब्रोब्लास्ट रूपांतरण पर सबसे बड़ा प्रभाव दर्शाता है। इसलिए, छह प्रतिलेखन कारकों की तुलना में तीन प्रतिलेखन कारकों के साथ प्रत्यक्ष प्रोग्रामिंग द्वारा प्रेरित मेलानोसाइटिक जीन की अभिव्यक्ति अधिक थी।एमईएफ-प्रेरित मेलेनोसाइट्स, या आईमेल्स की पहचान करने के लिए, इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला का उपयोग करके मेलेनोसाइटिक मार्करों, टीवाईआरपी 1 और डीसीटी की अभिव्यक्ति का पता लगाया गया था। इसके अलावा, मेलेनिन-विशिष्ट धुंधला तरीकों जैसे डोपा और मैसन-फोंटाना धुंधला होने से सकारात्मक परिणाम दिखाई दिए। 293 टी कोशिकाओं को समान रूप से वितरित किया जाना चाहिए।इसके अलावा, कोशिकाओं को तैरने से रोकने के लिए कोशिकाओं में अभिकर्मक मिश्रण के अलावा धीरे-धीरे किया जाना चाहिए। प्रोटोकॉल स्थिर और व्यावहारिक है और इसका उपयोग अन्य प्रकार की कोशिकाओं को पुन: प्रोग्राम करने के लिए किया जा सकता है। यह भविष्य की दवा में मेलानोसाइट्स पुनर्जनन में विवो डायरेक्ट रीप्रोग्रामिंग के लिए एक संदर्भ और रणनीति प्रदान करने की उम्मीद करता है।

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