Name: direct reprogramming of mouse fibroblasts into melanocytes
Uploaded: 2021-08-27T14:30:00
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Questo studio è stato parzialmente supportato da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (82070638 and 81770621) e della Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20180281).

Questo lavoro è stato approvato dal Comitato per la gestione e l'uso degli animali da laboratorio presso l'Università di Jiangsu (UJS-IACUC-AP--20190305010). Gli esperimenti sono stati eseguiti in stretta conformità con gli standard stabiliti dall'Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International). Non c'erano esperimenti che coinvolgevano esseri umani, quindi questo lavoro non aveva bisogno dell'approvazione del comitato etico della ricerca umana. Fare riferime...

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La qualità del virus è cruciale per il successo della riprogrammazione diretta ai melanociti in questo protocollo. Il metodo di confezionamento e concentrazione dei virus in questo protocollo è semplice e facile da ripetere e non si basa su nessun altro reagente concentrato ausiliario. Questo protocollo può essere seguito con successo nella maggior parte dei laboratori. Per garantire la qualità del virus concentrato, i seguenti punti richiedono un'attenzione speciale. Uno è lo stato della cella di HEK-293T. Sebbene...

La vitiligine è una malattia della pelle che colpisce seriamente la salute fisica e mentale degli individui colpiti. Per vari motivi, tra cui anomalie metaboliche, stress ossidativo, generazione di mediatori infiammatori, distacco cellulare e risposta autoimmune, i melanociti funzionali vengono persi e la secrezione di melanina viene interrotta, portando allo sviluppo della vitiligine 1,2. Questa condizione si verifica ampiamente ed è particolarmente problematica sul viso. Il trattamento principale è l'uso sistemico di corticosteroidi e immunomodulatori. La fototerapia può essere utilizzata per malattie sistemiche o locali e ci sono trattamenti chirurgici, come il trapianto di pelle perforata e il trapianto di melanociti autologhi 3,4,5. Tuttavia, i pazienti che usano la terapia farmacologica e la fototerapia sono inclini a ricadute e questi trattamenti hanno scarsi effetti terapeutici a lungo termine. Il trattamento chirurgico è traumatico e solo moderatamente efficace 2,6. Pertanto, è necessaria una nuova ed efficace strategia terapeutica per la vitiligine.
La riprogrammazione delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) inverte queste cellule dal loro stato terminale a uno stato pluripotente, un processo mediato dai fattori di trascrizione, Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc7. Tuttavia, a causa della possibilità di tumorigenicità e del lungo tempo di produzione, questa tecnologia è stata accolta con scetticismo quando applicata a contesti clinici8. La riprogrammazione diretta è una tecnologia che fa sì che un tipo di cella terminale si trasformi in un altro tipo di cella terminale9. Questo processo è ottenuto da fattori di trascrizione adeguati. Varie cellule sono già state riprogrammate direttamente con successo, tra cui cardiomiociti10, neuroni11 e cellule ciliate cocleari12. Alcuni ricercatori hanno persino riprogrammato il tessuto cutaneo direttamente in situ, che può essere utilizzato per la riparazione delle ferite13. I vantaggi della riprogrammazione diretta includono tempi e costi di attesa ridotti, minor rischio di cancro, meno problemi etici e una migliore comprensione del meccanismo alla base della determinazione del destino cellulare9.
Sebbene il metodo della riprogrammazione diretta sia ampiamente utilizzato, attualmente non esiste un metodo definito per la riprogrammazione diretta delle cellule della pelle in melanociti, soprattutto a causa dei numerosi fattori di trascrizione da considerare14,15. I fattori di trascrizione, Mitf, Sox10 e Pax3, sono stati utilizzati per la riprogrammazione diretta delle cellule della pelle in melanociti14. Al contrario, la combinazione di MITF, PAX3, SOX2 e SOX9 è stata utilizzata anche per la riprogrammazione diretta delle cellule della pelle in melanociti umani in un altro studio15. In questo protocollo, nonostante l'uso di un diverso metodo di screening, lo stesso risultato è stato ottenuto con la combinazione di Mitf, Sox10 e Pax3 per la riprogrammazione diretta delle cellule della pelle in melanociti come descritto in precedenza14. Lo sviluppo di un sistema per generare melanociti da altre cellule della pelle può fornire uno schema per trasformare altre cellule della pelle dei pazienti con vitiligine in melanociti. Quindi, è fondamentale costruire un metodo semplice ed efficiente per questa riprogrammazione diretta per generare melanociti con successo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-062</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;M filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHVR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene round bottom tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%/100% ethanol</td>
			<td>LANBAO</td>
			<td>210106</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2786</td>
			<td>Stock concentration 40 mg/mL 
			Final concentration 24 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21137</td>
			<td>Dilution of 1:500 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics(Pen/Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRP1/TYRP1 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABC592</td>
			<td>Host/Isotype: Mouse IgG2a 
			Species reactivity: Mouse/Human 
			Dilution of 1:200 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRP2/DCT Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab74073</td>
			<td>Host/Isotype: Rabbit IgG 
			Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>Stock concentration 10 mM 
			Final concentration 3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td>Stock concentration 0.3 mg/mL 
			Final concentration 20 pM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-165-144</td>
			<td>Dilution of 1:500 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (High glucose)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C 
			Heat-inactivated before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2)</td>
			<td>Hanheng Biological Technology Co., Ltd.</td>
			<td>pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab220365</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EDN3</td>
			<td>American-Peptide</td>
			<td>88-5-10A</td>
			<td>Stock concentration 100 &#956;M 
			Final concentration 0.1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/mL 
			Final concentration 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-DOPA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9628</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Transfection reagent, stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson-Fontana staining kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G2032</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral balsam</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8590</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (-)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Stock concentration 1 mM 
			Final concentration 200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td>cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 &#956;g/&#181;L 
			Final concentration 4 ng/&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13256-029</td>
			<td>Stock concentration 4 &#956;g/mL 
			Final concentration 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human insulin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>I3536</td>
			<td>Stock concentration 10 mg/mL 
			Final concentration 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human SCF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>255-SC-010</td>
			<td>Stock concentration 200 &#956;g/mL 
			Final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1330-20-7</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct reprogramming of mouse fibroblasts into melanocytes

La perdita di funzione dei melanociti porta alla vitiligine, che influisce seriamente sulla salute fisica e mentale degli individui colpiti. Attualmente, non esiste un trattamento efficace a lungo termine per la vitiligine. Pertanto, è imperativo sviluppare un trattamento conveniente ed efficace per la vitiligine. La tecnologia di medicina rigenerativa per la riprogrammazione diretta delle cellule della pelle in melanociti sembra essere un nuovo promettente trattamento della vitiligine. Ciò comporta la riprogrammazione diretta delle cellule cutanee del paziente in melanociti funzionali per aiutare a migliorare la perdita di melanociti nei pazienti con vitiligine. Tuttavia, questo metodo deve essere prima testato sui topi. Sebbene la riprogrammazione diretta sia ampiamente utilizzata, non esiste un protocollo chiaro per la riprogrammazione diretta in melanociti. Inoltre, il numero di fattori di trascrizione disponibili è schiacciante. 
Qui, viene presentato un protocollo di sistema di confezionamento di lentivirus concentrato per produrre fattori di trascrizione selezionati per riprogrammare le cellule della pelle in melanociti, tra cui Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 e Snai2. I fibroblasti embrionali di topo (MEF) sono stati infettati dal lentivirus concentrato per tutti questi fattori di trascrizione per la riprogrammazione diretta dei MEF in melanociti indotti (iMels) in vitro. Inoltre, questi fattori di trascrizione sono stati sottoposti a screening e il sistema è stato ottimizzato per la riprogrammazione diretta ai melanociti. L'espressione dei marcatori caratteristici della melanina in iMels a livello genico o proteico è stata significativamente aumentata. Questi risultati suggeriscono che la riprogrammazione diretta dei fibroblasti in melanociti potrebbe essere una nuova strategia terapeutica di successo per la vitiligine e confermare il meccanismo di sviluppo dei melanociti, che fornirà la base per un'ulteriore riprogrammazione diretta dei fibroblasti in melanociti in vivo.

Questo articolo include i protocolli di un sistema di confezionamento concentrato di lentivirus per produrre lentivirus di fattori di trascrizione per la riprogrammazione diretta di fibroblasti a melanociti e protocolli per lo screening per i fattori di trascrizione e la riprogrammazione diretta dei melanociti dai MEF.
Il successo della produzione concentrata di lentivirus è stato valutato osservando l'intensità di fluorescenza della GFP (Figura 1A) o mediante c...

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Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes

Qui descriviamo un sistema di riprogrammazione diretta ottimizzato per i melanociti e un sistema di confezionamento dei virus concentrato ad alta efficienza che garantisce una riprogrammazione diretta senza intoppi.

Riprogrammazione diretta dei fibroblasti di topo in melanociti

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, ...

È stata riportata una riprogrammazione diretta per generare melanociti. Tuttavia, vari fattori di trascrizione sono utilizzati in diversi studi. In questo protocollo, abbiamo convalidato e ridotto il numero del fattore di trascrizione ancora con una maggiore efficienza di riprogrammazione.Abbiamo stabilito un sistema di riprogrammazione diretta per generare melanociti utilizzando solo tre fattori di trascrizione, Mitf, Sox10 e PAX3, e modificato il sistema di coltura per renderlo più stabile e robusto. Come rigenerare i melanociti funzionali è una domanda significativa che può aiutare ad affrontare le limitazioni della terapia per le malattie da depigmentazione come la vitiligine. La giusta riprogrammazione fornisce una prospettiva La nostra tecnica ha le caratteristiche di convenienza, forte operabilità e stabilità, che è più facile da promuovere e ripetere.Per iniziare la produzione del lentivirus concentrato, piastrare 1,5 volte 10 alle 6 cellule HEK-293T in un piatto da 60 millimetri e coltivare le cellule con mezzo normale a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica. Dopo 24 ore di incubazione, quando le cellule HEK-293T hanno raggiunto l'80-90% di confluenza, sostituire il mezzo con 3,5 ml di DMEM, quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con anidride carbonica al 5% per due ore. Dopo aver rimosso le cellule dall'incubatore, sostituire il mezzo con DMEM contenente il 2% di FBS e aggiungere la miscela complessa di trasfezione appena preparata alle cellule in modo a goccia.Mescolare delicatamente la miscela liquida. Al termine di otto ore, cambiare il mezzo cellulare con 3,5 ml di mezzo normale. Raccogliere il surnatante del virus a 24 e 48 ore.Quindi, mescolare i supernatanti virali raccolti in due diversi punti temporali e centrifugare la miscela a 200 xg per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quindi passare il surnatante raccolto attraverso filtri da 0,45 micron per raccogliere il filtrato in un tubo conico sterile da 50 ml. Concentrare il surnatante virale filtrato mediante centrifugazione a 6.000 xg a quattro gradi Celsius durante la notte.Una volta fatto, assicurarsi che il pellet di virus sia visibile nella parte inferiore del tubo conico. Versare lentamente il surnatante. Per sciogliere il pellet di virus nel mezzo normale con uno per 100 ° * volume del surnatante del virus.Utilizzare una micropipetta P1000 per pipettare su e giù delicatamente fino a ottenere una miscela di virus concentrata omogenea 100x. Dividere il virus concentrato nei tubi microcentrifuga per immagazzinare a 80 gradi Celsius. Piastra 1 volte 10 alla 5a cella HEK-293T in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti.Coltiva queste cellule con il mezzo normale a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica. Dopo 24 ore, aggiungere da 0,1 a 0,2 microlitri del virus concentrato fluorescente 100x a ciascun pozzetto. Seguito dall'aggiunta di quattro nanogrammi per microlitri del reagente di trasfezione polimerica cationica a ciascun pozzo.Circa otto-dodici ore dopo l'infezione con il virus, sostituire il mezzo con il mezzo normale. A quarantotto ore dopo l'infezione, lavare il piatto con 1 ml di PBS sterile per rimuovere le cellule morte. Quindi tripsinizzare le cellule utilizzando 250 microlitri di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,05% per pozzetto di una piastra a sei pozzetti a temperatura ambiente.Centrifugare la piastra a 200 xg per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso il surnatante, sospendere nuovamente il pellet cellulare in un mL di PBS e aggiungere la sospensione cellulare a un tubo a fondo tondo di polistirene da cinque ml. Quindi posizionare il tubo nel citometro a flusso per analizzare il campione.Per la riprogrammazione diretta dei fibroblasti, rivestire un pozzetto di una piastra di coltura cellulare a sei pozzetti con 1 mL di soluzione di gelatina allo 0,1% a temperatura ambiente. Dopo 15-30 minuti, quando il pozzetto è completamente coperto con la gelatina, aspirare la soluzione di gelatina allo 0,1%. Successivamente, placcare 5 volte 10 al 4 ° fibroblasti embrionali di topo, o MEF, in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti rivestita con gelatina allo 0,1% e coltivare le cellule durante la notte con il mezzo normale a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica.Dopo 24 ore, quando i MEF hanno raggiunto il 40-50% di confluenza, sostituire il mezzo con il mezzo normale. Quindi, sciogliere il virus congelato e concentrato sul ghiaccio. Calcola il volume del virus da aggiungere usando l'equazione e quindi aggiungi il virus concentrato per i sei fattori di trascrizione a ciascun pozzo, in base al volume calcolato.Aggiungere quattro microgrammi per mL dell'agente di trasfezione polimerica cationica al pozzo. Consideralo come il giorno zero dell'infezione da lentivirus. Il primo giorno, dopo 8-12 ore di infezione, sostituire il mezzo contenente il virus con il mezzo normale fresco, aggiungendo 0,5 microgrammi per mL di puromicina per lo screening di linee cellulari infette stabili.Il secondo giorno, 48 ore dopo l'infezione, sostituire gradualmente il mezzo surnatante con il mezzo di riprogrammazione. Modificare un quarto del volume medio totale prima di aggiungere tre micromolari CHIR99021. Dal terzo al settimo giorno, a seconda delle condizioni delle cellule, cambiare il mezzo sostituendolo gradualmente con una percentuale maggiore di mezzo di riprogrammazione per passare al mezzo di riprogrammazione completo entro cinque giorni.Successivamente, staccare le cellule con 500 microlitri dell'enzima digestivo 0,05% tripsina-EDTA per tre minuti a temperatura ambiente. Quando circa il sessanta percento delle cellule ha galleggiato, interrompere la digestione aggiungendo il mezzo normale, due volte il volume dell'enzima digestivo. Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico sterile da 15 ml per centrifugare a 200 xg per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Rimuovere il surnatante prima di sospendere nuovamente il pellet cellulare con il mezzo di riprogrammazione. Al termine, placcare le cellule ri-sospese in un piatto sterile di 60 millimetri. Coltivare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica umidificato al 5%.Dopo quarantotto ore di infezione da lentivirus nelle cellule HEK-293T, il successo della produzione concentrata di lentivirus è stato valutato osservando l'intensità di fluorescenza della GFP o mediante citometria a flusso. Il titolo del virus concentrato è risultato essere alto a 10 a 8th TU / mL. Durante la riprogrammazione diretta dei fibroblasti, la morfologia cellulare è cambiata gradualmente in sinapsi cellulari allungate e nuclei cellulari allargati.Tuttavia, le cellule sono progressivamente invecchiate dopo il ventesimo giorno. La rimozione dei fattori di trascrizione, Mitf, Pax3 o Sox10, ha portato al silenziamento dell'espressione dei geni melanocitici, Tyr, Tyrp1 e Mlana, indicando il maggiore impatto sulla conversione dei fibroblasti in melanociti. Quindi, l'espressione di geni melanocitici indotta dalla programmazione diretta con tre fattori di trascrizione era più alta rispetto a sei fattori di trascrizione.Per identificare i melanociti indotti da MEF, o iMels, l'espressione di marcatori melanocitici, TYRP1 e DCT è stata rilevata utilizzando la colorazione immunofluorescente. Inoltre, i metodi di colorazione specifici della melanina come la colorazione DOPA e Masson-Fontana hanno mostrato risultati positivi. Le celle 293T devono essere distribuite uniformemente.Inoltre, l'aggiunta di miscela di trasfezione alle cellule deve essere eseguita delicatamente per evitare che le cellule galleggino. Il protocollo è stabile e pratico e può essere utilizzato per riprogrammare altri tipi di cellule. Si aspetta di fornire un riferimento e una strategia per la riprogrammazione diretta in vivo nella rigenerazione dei melanociti nella medicina futura.

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