Name: direct reprogramming of mouse fibroblasts into melanocytes
Uploaded: 2021-08-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes at JoVE.com

Denne studien ble delvis støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (82070638 og 81770621) og Natural Science Foundation of Jiangsu-provinsen (BK20180281).

Dette arbeidet ble godkjent av Laboratory Animal Management and Use Committee ved Jiangsu University (UJS-IACUC-AP--20190305010). Forsøkene ble utført i henhold til standardene fastsatt av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International). Det var ingen eksperimenter som involverte mennesker, så dette arbeidet trengte ikke godkjenning fra den menneskelige forskningsetiske komiteen. Se materialfortegnelsen hvis du vil ha mer informasjon om reage...

<ol>
	<li>Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo.">Vitiligo.</a> Lancet. 386 (9988), 74-84 (2015).</li><li>Picardo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo.">Vitiligo.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15011 (2015).</li><li>Speeckaert, R., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo:+An+update+on+pathophysiology+and+treatment+options.">Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options.</a> American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).</li><li>Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo+management:+combination+of+surgical+treatment+and+phototherapy+under+reflectance+confocal+microscopy+monitoring.">Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).</li><li>Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+therapies+for+vitiligo.">Surgical therapies for vitiligo.</a> Dermatologic Clinics. 35 (2), 193-203 (2017).</li><li>Bishnoi, A., Parsad, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+molecular+aspects+of+vitiligo+treatments.">Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments.</a> International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509 (2018).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+transcription+factor-mediated+reprogramming+to+pluripotency.">A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).</li><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-based+cell+therapy-promise+and+challenges.">Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges.</a> Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).</li><li>Xu, J., Du, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming:+strategies,+mechanisms,+and+applications.">Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li><li>Gasc&#243;n, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., G&#246;tz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neuronal+reprogramming:+achievements,+hurdles,+and+new+roads+to+success.">Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success.</a> Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).</li><li>Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cellular+reprogramming+and+inner+ear+regeneration.">Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).</li><li>Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+wound-resident+cells+generates+skin+epithelial+tissue.">In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue.</a> Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).</li><li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+to+functional+melanocytes+by+defined+factors.">Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors.</a> Nature Communications. 5, 5807 (2014).</li><li>Fehrenbach, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+tumorigenic+potential+upon+transdifferentiation+from+keratinocytic+into+melanocytic+lineage.">Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage.</a> Scientific Reports. 6, 28891 (2016).</li><li>Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+extracting+RNA+and+genomic+DNA+from+archived+human+blood+and+muscle.">A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle.</a> Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).</li><li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-transcription+PCR+(RT-PCR).">Reverse-transcription PCR (RT-PCR).</a> Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).</li><li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+staining.">Immunofluorescence staining.</a> Current Protocols in Cell Biology. 69 (1), 1-7 (2015).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+vectors+for+gene-based+therapy.">Non-viral vectors for gene-based therapy.</a> Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).</li></ol>

Kvaliteten på viruset er avgjørende for suksessen med direkte omprogrammering til melanocytter i denne protokollen. Metoden for pakking og konsentrerende virus i denne protokollen er enkel og enkel å gjenta og er ikke avhengig av noe annet ekstra konsentrert reagens. Denne protokollen kan følges i de fleste laboratorier. For å sikre kvaliteten på det konsentrerte viruset, trenger følgende punkter spesiell oppmerksomhet. Den ene er cellestatusen til HEK-293T. Selv om HEK-293T-celler er udødelige celler, må cellen...

Vitiligo er en hudsykdom som alvorlig påvirker den fysiske og mentale helsen til de berørte individene. Av ulike grunner, inkludert metabolske abnormiteter, oksidativt stress, generering av inflammatoriske mediatorer, celleavløsning og autoimmun respons, går de funksjonelle melanocyttene tapt, og sekresjonen av melanin stoppes, noe som fører til utvikling av vitiligo 1,2. Denne tilstanden oppstår mye og er spesielt problematisk i ansiktet. Hovedbehandlingen er systemisk bruk av kortikosteroider og immunmodulatorer. Fototerapi kan brukes til systemiske eller lokale sykdommer, og det er kirurgiske behandlinger, for eksempel perforert hudtransplantasjon og autolog melanocyttransplantasjon 3,4,5. Imidlertid er pasienter som bruker medikamentell terapi og fototerapi utsatt for tilbakefall, og disse behandlingene har dårlige langsiktige terapeutiske effekter. Kirurgisk behandling er traumatisk og bare moderat effektiv 2,6. Derfor er det nødvendig med en ny og effektiv terapeutisk strategi for vitiligo.
Omprogrammeringen av induserte pluripotente stamceller (iPSCer) reverserer disse cellene fra terminaltilstanden til en pluripotent tilstand, en prosess formidlet av transkripsjonsfaktorene, Oct4, Sox2, Klf4 og c-Myc7. Men på grunn av muligheten for tumorigisitet og lang produksjonstid, har denne teknologien blitt møtt med skepsis når den brukes på kliniske innstillinger8. Direkte omprogrammering er en teknologi som gjør at én type terminalcelle forvandles til en annen type terminalcelle9. Denne prosessen oppnås ved egnede transkripsjonsfaktorer. Ulike celler har allerede blitt direkte omprogrammert vellykket, inkludert kardiomyocytter10, nevroner11 og cochleahårceller12. Noen forskere har til og med omprogrammert hudvev direkte in situ, som kan brukes til sårreparasjon13. Fordelene med direkte omprogrammering inkluderer reduserte ventetider og kostnader, lavere risiko for kreft, færre etiske problemer og en bedre forståelse av mekanismen som ligger til grunn for celle skjebnebestemmelse9.
Selv om den direkte omprogrammeringsmetoden er mye brukt, er det for tiden ingen bestemt metode for direkte omprogrammering av hudceller til melanocytter, spesielt på grunn av de mange transkripsjonsfaktorene som skal betraktes som14,15. Transkripsjonsfaktorene Mitf, Sox10 og Pax3 har blitt brukt til direkte omprogrammering av hudceller til melanocytter14. Kombinasjonen av MITF, PAX3, SOX2 og SOX9 har derimot også blitt brukt til direkte omprogrammering av hudceller til humane melanocytter i en annen studie15. I denne protokollen, til tross for bruk av en annen screeningmetode, ble det samme resultatet oppnådd med kombinasjonen av Mitf, Sox10 og Pax3 for direkte omprogrammering av hudceller til melanocytter som beskrevet tidligere14. Å utvikle et system for å generere melanocytter fra andre hudceller kan gi en ordning for å transformere andre hudceller av vitiligo-pasienter til melanocytter. Derfor er det avgjørende å konstruere en enkel og effektiv metode for denne direkte omprogrammeringen for å generere melanocytter med hell.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-062</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;M filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHVR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene round bottom tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%/100% ethanol</td>
			<td>LANBAO</td>
			<td>210106</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2786</td>
			<td>Stock concentration 40 mg/mL 
			Final concentration 24 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21137</td>
			<td>Dilution of 1:500 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics(Pen/Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRP1/TYRP1 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABC592</td>
			<td>Host/Isotype: Mouse IgG2a 
			Species reactivity: Mouse/Human 
			Dilution of 1:200 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRP2/DCT Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab74073</td>
			<td>Host/Isotype: Rabbit IgG 
			Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>Stock concentration 10 mM 
			Final concentration 3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td>Stock concentration 0.3 mg/mL 
			Final concentration 20 pM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-165-144</td>
			<td>Dilution of 1:500 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (High glucose)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C 
			Heat-inactivated before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2)</td>
			<td>Hanheng Biological Technology Co., Ltd.</td>
			<td>pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab220365</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EDN3</td>
			<td>American-Peptide</td>
			<td>88-5-10A</td>
			<td>Stock concentration 100 &#956;M 
			Final concentration 0.1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/mL 
			Final concentration 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-DOPA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9628</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Transfection reagent, stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson-Fontana staining kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G2032</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral balsam</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8590</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (-)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Stock concentration 1 mM 
			Final concentration 200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td>cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 &#956;g/&#181;L 
			Final concentration 4 ng/&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13256-029</td>
			<td>Stock concentration 4 &#956;g/mL 
			Final concentration 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human insulin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>I3536</td>
			<td>Stock concentration 10 mg/mL 
			Final concentration 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human SCF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>255-SC-010</td>
			<td>Stock concentration 200 &#956;g/mL 
			Final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1330-20-7</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct reprogramming of mouse fibroblasts into melanocytes

Tap av funksjon av melanocytter fører til vitiligo, noe som alvorlig påvirker den fysiske og mentale helsen til de berørte individene. For tiden er det ingen effektiv langsiktig behandling for vitiligo. Derfor er det viktig å utvikle en praktisk og effektiv behandling for vitiligo. Regenerativ medisinteknologi for direkte omprogrammering av hudceller til melanocytter ser ut til å være en lovende ny behandling av vitiligo. Dette innebærer direkte omprogrammering av pasientens hudceller til funksjonelle melanocytter for å bidra til å forbedre tapet av melanocytter hos pasienter med vitiligo. Denne metoden må imidlertid først testes på mus. Selv om direkte omprogrammering er mye brukt, er det ingen klar protokoll for direkte omprogrammering til melanocytter. Videre er antall tilgjengelige transkripsjonsfaktorer overveldende. 
Her presenteres en konsentrert lentivirusemballasjesystemprotokoll for å produsere transkripsjonsfaktorer valgt for omprogrammering av hudceller til melanocytter, inkludert Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 og Snai2. Mus embryonale fibroblaster (MEFer) ble infisert med konsentrert lentivirus for alle disse transkripsjonsfaktorene for direkte omprogrammering av MEF-ene til induserte melanocytter (iMels) in vitro. Videre ble disse transkripsjonsfaktorene screenet, og systemet ble optimalisert for direkte omprogrammering til melanocytter. Uttrykket av de karakteristiske markørene til melanin i iMels på gen- eller proteinnivå ble betydelig økt. Disse resultatene tyder på at direkte omprogrammering av fibroblaster til melanocytter kan være en vellykket ny terapeutisk strategi for vitiligo og bekrefte mekanismen for melanocyttutvikling, noe som vil gi grunnlag for videre direkte omprogrammering av fibroblaster til melanocytter in vivo.

Denne artikkelen inneholder protokollene til et konsentrert lentivirusemballasjesystem for å produsere lentivirus av transkripsjonsfaktorer for direkte omprogrammering av fibroblaster til melanocytter og protokoller for screening for transkripsjonsfaktorer og direkte omprogrammering av melanocytter fra MEFer.
Suksessen med konsentrert lentivirusproduksjon ble evaluert ved å observere fluorescensintensiteten til GFP (figur 1A) eller ved strømningscytometri (<str...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes at JoVE.com

Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes

Her beskriver vi et optimalisert direkte omprogrammeringssystem for melanocytter og et høyeffektivt, konsentrert virusemballasjesystem som sikrer jevn direkte omprogrammering.

Direkte omprogrammering av musfibroblaster til Melanocytes

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, ...

Direkte omprogrammering for å generere melanocytter er rapportert. Imidlertid brukes ulike transkripsjonsfaktorer i forskjellige studier. I denne protokollen validerte og reduserte vi transkripsjonsfaktornummeret fortsatt med høyere omprogrammeringseffektivitet.Vi etablerte et direkte omprogrammeringssystem for å generere melanocytter ved hjelp av bare tre transkripsjonsfaktorer, Mitf, Sox10 og PAX3, og modifiserte kultursystemet for å gjøre det mer stabilt og robust. Hvordan regenerere funksjonelle melanocytter er et betydelig spørsmål som kan bidra til å adressere terapibegrensninger for depigmenteringssykdommer som vitiligo. Riktig omprogrammering gir en potensiell Vår teknikk har egenskapene til bekvemmelighet, sterk operabilitet og stabilitet, noe som er lettere å fremme og gjenta.For å starte produksjonen av det konsentrerte lentiviruset, plate 1,5 ganger 10 til 6 HEK-293T celler i en 60 millimeter tallerken, og kultur cellene med normalt medium ved 37 grader Celsius i en fuktet inkubator med 5% karbondioksid. Etter 24 timer med inkubasjonen, når HEK-293T-cellene har nådd 80 til 90% samløp, erstatt mediet med 3,5 ml DMEM, og inkuber deretter cellene ved 37 grader Celsius i en fuktet inkubator med 5% karbondioksid i to timer. Etter å ha fjernet cellene fra inkubatoren, erstatt mediet med DMEM som inneholder 2% FBS, og legg til den nylagde transfeksjonskompleksblandingen til cellene på en dråpevis måte.Bland væskeblandingen forsiktig. Når åtte timer er fullført, endrer du cellemediet med 3,5 ml normalt medium. Samle viruset supernatant på 24 og 48 timer.Bland deretter virus supernatanter samlet på to forskjellige tidspunkter og sentrifuger blandingen ved 200 xg i fem minutter ved fire grader Celsius. Før deretter den oppsamlede supernatanten gjennom 0,45 mikronfiltre for å samle filtratet i et 50 ml sterilt konisk rør. Konsentrer det filtrerte viruset supernatant ved sentrifugering ved 6000 xg ved fire grader Celsius over natten.Når du er ferdig, må du sørge for at viruspellet er synlig nederst på det koniske røret. Hell ut supernatanten sakte. For oppløsning av viruspellet i det normale mediet med en etter 100th * volum av viruset supernatant.Bruk en P1000 mikropipette til å pipette forsiktig opp og ned til en homogen 100x konsentrert virusblanding er oppnådd. Del det konsentrerte viruset inn i mikrocentrifugerørene for å lagre ved 80 grader Celsius. Plate 1 ganger 10 til femte HEK-293T celler i en brønn av en seks-brønns plate.Kultur disse cellene med det normale mediet ved 37 grader Celsius i en fuktet inkubator med 5% karbondioksid. Etter 24 timer, tilsett 0,1 til 0,2 mikroliter av det 100x fluorescerende konsentrerte viruset til hver brønn. Etterfulgt av tilsetning av fire nanogram per mikroliter av det kationiske polymere transfeksjonsreagenset til hver brønn.Omtrent åtte til tolv timer etter infeksjon med viruset, erstatt mediet med det normale mediet. Ved førtifem timer etter infeksjon, vask parabolen med 1 ml steril PBS for å fjerne de døde cellene. Prøv deretter cellene ved hjelp av 250 mikroliter 0,05% trypsin-EDTA-løsning per brønn av en seksbrønnsplate ved romtemperatur.Sentrifuger platen ved 200 xg i fem minutter ved fire grader Celsius. Etter å ha fjernet supernatanten, må du suspendere cellepelleten i en ml PBS og legge cellefjæringen til et fem ml polystyren rundbunnsrør. Plasser deretter røret i strømningscytometeret for å analysere prøven.For direkte omprogrammering av fibroblaster, belegge en brønn av en seks-brønns cellekulturplate med 1 ml 0,1% gelatinoppløsning ved romtemperatur. Etter 15 til 30 minutter, når brønnen er helt dekket med gelatin, aspirerer du 0,1% gelatinoppløsning. Deretter plate 5 ganger 10 til fjerde mus embryonale fibroblaster, eller MEF-er, i en brønn av en seks-brønns plate belagt med 0,1% gelatin, og kultur cellene over natten med det normale mediet ved 37 grader Celsius i en fuktet inkubator med 5% karbondioksid.Etter 24 timer, når MEF-ene har nådd 40 til 50 % samløp, erstatter du mediet med det normale mediet. Deretter smelter det frosne, konsentrerte viruset på is. Beregn volumet av viruset som skal legges til ved hjelp av ligning, og legg deretter til det konsentrerte viruset for de seks transkripsjonsfaktorene til hver brønn, i henhold til det beregnede volumet.Tilsett fire mikrogram per ml av det kationiske polymere transfeksjonsmiddelet til brønnen. Se på det som dag null av lentivirusinfeksjonen. På dag én, etter 8 til 12 timers infeksjon, erstatt mediet som inneholder viruset med det friske normale mediet, mens du legger til 0,5 mikrogram per ml puromycin for å screene stabile infiserte cellelinjer.På dag to, 48 timer etter infeksjon, erstatt det supernatante mediet gradvis med omprogrammeringsmediet. Endre en fjerdedel av det totale middels volumet før du legger til tre mikromolar CHIR99021. Fra dag tre til dag syv, avhengig av tilstanden til cellene, endrer du mediet ved å gradvis erstatte det med en høyere andel omprogrammeringsmedium for å bytte til hele omprogrammeringsmediet innen fem dager.Deretter løsner cellene med 500 mikroliter 0,05% trypsin-EDTA fordøyelsesenzym i tre minutter ved romtemperatur. Når omtrent seksti prosent av cellene har fløt opp, stopp fordøyelsen ved å legge til det normale mediet, to ganger volumet av fordøyelsesenzymet. Samle cellefjæringen i et 15 ml sterilt konisk rør for å sentrifugere ved 200 xg i fem minutter ved fire grader Celsius.Fjern supernatanten før du suspenderer cellepelleten på nytt med omprogrammeringsmediet. Når du er ferdig, skriv de re-suspenderte cellene i en 60 millimeter steril tallerken. Kultur cellene ved 37 grader Celsius i en fuktet 5% karbondioksid inkubator.Etter førtifåtte timer med lentivirusinfeksjon i HEK-293T-celler ble suksessen med konsentrert lentivirusproduksjon evaluert ved å observere fluorescensintensiteten til GFP eller ved strømningscytometri. Titeret av det konsentrerte viruset ble funnet å være høyt ved 10 til 8. Under direkte omprogrammering av fibroblaster endret cellemorfologien gradvis til langstrakt cellesynapse og forstørret cellekjerner.Imidlertid blir cellene gradvis alderen etter dag tjue. Fjerning av transkripsjonsfaktorene, Mitf, Pax3 eller Sox10, resulterte i silencing av uttrykket av melanocytiske gener, Tyr, Tyrp1 og Mlana, noe som indikerer størst innvirkning på fibroblastkonvertering til melanocytter. Derfor var uttrykket av melanocytiske gener indusert av direkte programmering med tre transkripsjonsfaktorer høyere sammenlignet med seks transkripsjonsfaktorer.For å identifisere MEF-induserte melanocytter, eller iMels, ble uttrykket av melanocytiske markører, TYRP1 og DCT oppdaget ved hjelp av immunfluorescerende farging. Videre viste de melaninspesifikke fargingsmetodene som DOPA og Masson-Fontana farging positive resultater. 293T-cellene skal fordeles jevnt.Også tilsetning av transfeksjonsblanding til celler må gjøres forsiktig for å forhindre at cellene flyter. Protokollen er stabil og praktisk, og den kan brukes til å omprogrammere andre typer celler. Den forventer å gi en referanse og en strategi for in vivo direkte omprogrammering i melanocytter regenerering i fremtidig medisin.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Developmental Biology

Unit 1

The Integumentary System

SCIENTISTS IN ACTION

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Stabil og effektiv genmodifisering av Celler i Adult Mouse V-SVZ for Analyse av Neural Stem Cell autonome og ikke-autonome Effects

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Metoder for Nettopp Lokalisert Overføring av celler eller DNA i Early fostertap Mouse Embryoer

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-fri Utledning av Melanocytter fra Menneskelig Pluripotent stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Real Time Kinetic Måling og visualisering av somatiske Omprogrammering

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Protokoll for direkte konvertering av Murine embryonale Fibroblaster i trophoblast stamceller

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Omprogrammering mus embryonale Fibroblaster med transkripsjonsfaktorer for å indusere en Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Etablering av Proliferativ Tetraploid Celler fra transformerte humane fibroblaster

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

Betinget Omprogrammering av Pediatric Menneskelig Esophageal Epitelceller for bruk i Tissue Engineering og sykdom Investigation

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Vurdere kardiomyocytt Subtyper Etter transkripsjonsfaktor-mediert omprogrammering av mus embryonale Fibroblaster

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Omprogrammere primære fostervann og membran celler Pluripotency Xeno-gratis forhold

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...