Name: direct reprogramming of mouse fibroblasts into melanocytes
Uploaded: 2021-08-27T14:30:00
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Este estudo foi parcialmente apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (82070638 e 81770621) e da Fundação de Ciência Natural da Província de Jiangsu (BK20180281).

Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Gestão e Uso de Animais laboratoriais da Universidade de Jiangsu (UJS-IACUC-AP-20190305010). Os experimentos foram realizados em estrita conformidade com as normas estabelecidas pela Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care International (AAALAC International). Não houve experimentos envolvendo humanos, por isso este trabalho não precisava de aprovação do comitê de ética em pesquisa humana. Consulte a Tabela de Materiais par...

<ol>
	<li>Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo.">Vitiligo.</a> Lancet. 386 (9988), 74-84 (2015).</li><li>Picardo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo.">Vitiligo.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15011 (2015).</li><li>Speeckaert, R., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo:+An+update+on+pathophysiology+and+treatment+options.">Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options.</a> American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).</li><li>Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo+management:+combination+of+surgical+treatment+and+phototherapy+under+reflectance+confocal+microscopy+monitoring.">Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).</li><li>Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+therapies+for+vitiligo.">Surgical therapies for vitiligo.</a> Dermatologic Clinics. 35 (2), 193-203 (2017).</li><li>Bishnoi, A., Parsad, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+molecular+aspects+of+vitiligo+treatments.">Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments.</a> International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509 (2018).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+transcription+factor-mediated+reprogramming+to+pluripotency.">A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).</li><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-based+cell+therapy-promise+and+challenges.">Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges.</a> Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).</li><li>Xu, J., Du, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming:+strategies,+mechanisms,+and+applications.">Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li><li>Gasc&#243;n, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., G&#246;tz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neuronal+reprogramming:+achievements,+hurdles,+and+new+roads+to+success.">Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success.</a> Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).</li><li>Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cellular+reprogramming+and+inner+ear+regeneration.">Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).</li><li>Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+wound-resident+cells+generates+skin+epithelial+tissue.">In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue.</a> Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).</li><li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+to+functional+melanocytes+by+defined+factors.">Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors.</a> Nature Communications. 5, 5807 (2014).</li><li>Fehrenbach, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+tumorigenic+potential+upon+transdifferentiation+from+keratinocytic+into+melanocytic+lineage.">Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage.</a> Scientific Reports. 6, 28891 (2016).</li><li>Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+extracting+RNA+and+genomic+DNA+from+archived+human+blood+and+muscle.">A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle.</a> Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).</li><li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-transcription+PCR+(RT-PCR).">Reverse-transcription PCR (RT-PCR).</a> Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).</li><li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+staining.">Immunofluorescence staining.</a> Current Protocols in Cell Biology. 69 (1), 1-7 (2015).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+vectors+for+gene-based+therapy.">Non-viral vectors for gene-based therapy.</a> Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).</li></ol>

A qualidade do vírus é crucial para o sucesso da reprogramação direta aos melanócitos neste protocolo. O método de embalar e concentrar vírus neste protocolo é simples e fácil de repetir e não conta com nenhum outro reagente concentrado auxiliar. Este protocolo pode ser seguido com sucesso na maioria dos laboratórios. Para garantir a qualidade do vírus concentrado, os seguintes pontos precisam de atenção especial. Um deles é o estado celular do HEK-293T. Embora as células HEK-293T sejam células imortaliz...

O vitiligo é uma doença de pele que afeta seriamente a saúde física e mental dos indivíduos afetados. Por várias razões, incluindo anormalidades metabólicas, estresse oxidativo, geração de mediadores inflamatórios, descolamento celular e resposta autoimune, os melanócitos funcionais são perdidos, e a secreção da melanina é interrompida, levando ao desenvolvimento do vitiligo 1,2. Esta condição ocorre amplamente e é particularmente problemática no rosto. O principal tratamento é o uso sistêmico de corticosteroides e imunomoduladores. A fototerapia pode ser usada para doenças sistêmicas ou locais, e há tratamentos cirúrgicos, como transplante de pele perfurado e transplante de melanócitos autólogos 3,4,5. No entanto, pacientes que usam terapia medicamentosa e fototerapia são propensos a recaídas, e esses tratamentos têm efeitos terapêuticos de longo prazo ruins. O tratamento cirúrgico é traumático e apenas moderadamente eficaz 2,6. Portanto, uma nova e eficaz estratégia terapêutica é necessária para o vitiligo.
A reprogramação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) reverte essas células de seu estado terminal para um estado pluripotente, um processo mediado pelos fatores de transcrição, Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc7. No entanto, devido à possibilidade de tumorigenicidade e ao longo tempo de produção, essa tecnologia tem sido recebida com ceticismo quando aplicada aos cenários clínicos8. Reprogramação direta é uma tecnologia que faz com que um tipo de célula terminal se transforme em outro tipo de célula terminal9. Esse processo é alcançado por fatores adequados de transcrição. Várias células já foram diretamente reprogramadas com sucesso, incluindo cardiomiócitos10, neurônios11 e células ciliadas cocleares12. Alguns pesquisadores até reprogramaram tecido da pele diretamente in situ, que pode ser usado para reparação de feridas13. As vantagens da reprogramação direta incluem redução do tempo de espera e custos, menor risco de câncer, menos problemas éticos e uma melhor compreensão do mecanismo subjacente à determinação do destinocelular 9.
Embora o método de reprogramação direta seja amplamente utilizado, atualmente não há um método definido para a reprogramação direta das células da pele em melanócitos, especialmente por causa dos numerosos fatores de transcrição a serem considerados14,15. Os fatores de transcrição, Mitf, Sox10 e Pax3, têm sido usados para reprogramação direta de células da pele em melanócitos14. Em contraste, a combinação de MITF, PAX3, SOX2 e SOX9 também tem sido usada para reprogramação direta de células da pele em melanócitos humanos em outro estudo15. Neste protocolo, apesar do uso de um método de triagem diferente, o mesmo resultado foi obtido com a combinação de Mitf, Sox10 e Pax3 para reprogramação direta de células da pele em melanócitos como descrito anteriormente14. Desenvolver um sistema para gerar melanócitos de outras células da pele pode fornecer um esquema para transformar outras células da pele de pacientes com vitiligo em melanócitos. Por isso, é fundamental construir um método simples e eficiente para essa reprogramação direta para gerar melanócitos com sucesso.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-062</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;M filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHVR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene round bottom tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%/100% ethanol</td>
			<td>LANBAO</td>
			<td>210106</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2786</td>
			<td>Stock concentration 40 mg/mL 
			Final concentration 24 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21137</td>
			<td>Dilution of 1:500 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics(Pen/Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRP1/TYRP1 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABC592</td>
			<td>Host/Isotype: Mouse IgG2a 
			Species reactivity: Mouse/Human 
			Dilution of 1:200 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRP2/DCT Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab74073</td>
			<td>Host/Isotype: Rabbit IgG 
			Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>Stock concentration 10 mM 
			Final concentration 3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td>Stock concentration 0.3 mg/mL 
			Final concentration 20 pM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-165-144</td>
			<td>Dilution of 1:500 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (High glucose)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C 
			Heat-inactivated before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2)</td>
			<td>Hanheng Biological Technology Co., Ltd.</td>
			<td>pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab220365</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EDN3</td>
			<td>American-Peptide</td>
			<td>88-5-10A</td>
			<td>Stock concentration 100 &#956;M 
			Final concentration 0.1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/mL 
			Final concentration 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-DOPA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9628</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Transfection reagent, stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson-Fontana staining kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G2032</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral balsam</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8590</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (-)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Stock concentration 1 mM 
			Final concentration 200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td>cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 &#956;g/&#181;L 
			Final concentration 4 ng/&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13256-029</td>
			<td>Stock concentration 4 &#956;g/mL 
			Final concentration 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human insulin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>I3536</td>
			<td>Stock concentration 10 mg/mL 
			Final concentration 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human SCF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>255-SC-010</td>
			<td>Stock concentration 200 &#956;g/mL 
			Final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1330-20-7</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct reprogramming of mouse fibroblasts into melanocytes

A perda da função dos melanócitos leva ao vitiligo, que afeta seriamente a saúde física e mental dos indivíduos afetados. Atualmente, não há tratamento eficaz a longo prazo para o vitiligo. Portanto, é imprescindível desenvolver um tratamento conveniente e eficaz para o vitiligo. A tecnologia de medicina regenerativa para reprogramação direta de células da pele em melanócitos parece ser um novo tratamento promissor do vitiligo. Isso envolve a reprogramação direta das células da pele do paciente em melanócitos funcionais para ajudar a amenizar a perda de melanócitos em pacientes com vitiligo. No entanto, este método precisa ser testado primeiro em camundongos. Embora a reprogramação direta seja amplamente utilizada, não há um protocolo claro para reprogramação direta em melanócitos. Além disso, o número de fatores de transcrição disponíveis é esmagador. 
Aqui, um protocolo concentrado do sistema de embalagem de lentivírus é apresentado para produzir fatores de transcrição selecionados para reprogramação de células da pele para melanócitos, incluindo Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 e Snai2. Os fibroblastos embrionários do camundongo (MEFs) foram infectados com o lentivírus concentrado para todos esses fatores de transcrição para a reprogramação direta dos MEFs em melanócitos induzidos (iMels) in vitro. Além disso, esses fatores de transcrição foram examinados, e o sistema foi otimizado para reprogramação direta aos melanócitos. A expressão dos marcadores característicos da melanina em iMels no nível genético ou proteico foi significativamente aumentada. Esses resultados sugerem que a reprogramação direta de fibroblastos para melanócitos pode ser uma nova estratégia terapêutica bem sucedida para o vitiligo e confirmar o mecanismo de desenvolvimento de melanócitos, o que fornecerá a base para uma reprogramação direta de fibroblastos em melanócitos in vivo.

Este artigo inclui os protocolos de um sistema concentrado de embalagem de lentivírus para produzir lentivírus de fatores de transcrição para reprogramação direta de fibroblastos para melanócitos e protocolos para triagem de fatores de transcrição e reprogramação direta de melanócitos de MEFs.
O sucesso da produção concentrada de lentivírus foi avaliado observando a intensidade de fluorescência de GFP (Figura 1A) ou por citometria de fluxo (<strong...

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Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes

Aqui, descrevemos um sistema de reprogramação direta otimizado para melanócitos e um sistema de embalagem de vírus concentrado de alta eficiência que garante uma reprogramação direta suave.

Reprogramação Direta de Fibroblastos de Rato em Melanócitos

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, ...

A reprogramação direta para gerar melanócitos foi relatada. No entanto, vários fatores de transcrição são utilizados em diferentes estudos. Neste protocolo, validamos e reduzimos o número do fator de transcrição ainda com maior eficiência de reprogramação.Estabelecemos um sistema de reprogramação direta para gerar melanócitos usando apenas três fatores de transcrição, Mitf, Sox10 e PAX3, e modificamos o sistema de cultura para torná-lo mais estável e robusto. Como regenerar melanócitos funcionais é uma questão significativa que pode ajudar a lidar com limitações terapêuticas para doenças despigmentação como o vitiligo. A reprogramação certa proporciona uma potencial Nossa técnica tem as características de conveniência, forte operabilidade e estabilidade, o que é mais fácil de promover e repetir.Para iniciar a produção do lentivírus concentrado, a placa 1,5 vezes 10 para as 6 células HEK-293T em um prato de 60 milímetros, e cultivar as células com meio normal a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono. Após 24 horas de incubação, quando as células HEK-293T atingirem 80 a 90% de confluência, substitua o meio por 3,5 mL de DMEM e incuba as células a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono por duas horas. Depois de remover as células da incubadora, substitua o meio por DMEM contendo 2% de FBS e adicione a mistura de complexo de transfecção recém-preparada às células de forma drop-wise.Misture a mistura líquida suavemente. Ao completar oito horas, troque o meio celular com 3,5 mL de meio normal. Colete o vírus supernante em 24 e 48 horas.Em seguida, misture os supernacantes do vírus coletados em dois pontos de tempo diferentes e centrifugar a mistura a 200 xg por cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, passe o supernante coletado através de filtros de 0,45 mícrons para coletar o filtrado em um tubo cônico estéril de 50 mL. Concentre o vírus filtrado supernacido por centrifugação a 6.000 xg a quatro graus Celsius durante a noite.Uma vez feito, certifique-se de que a pelota do vírus é visível na parte inferior do tubo cônico. Despeje o supernatante lentamente. Para dissolver a pelota do vírus no meio normal com um por 100º volume do vírus supernante.Use uma micropipette P1000 para pipeta para cima e para baixo suavemente até que uma mistura homogênea de vírus concentrado de 100x seja obtida. Divida o vírus concentrado nos tubos de microcentrifuuagem para armazenar a 80 graus Celsius. Placa 1 vezes 10 para a 5ª célula HEK-293T em um poço de uma placa de seis poços.Cultuam essas células com o meio normal a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono. Após 24 horas, adicione 0,1 a 0,2 microlitres do vírus concentrado fluorescente de 100x a cada poço. Seguido pela adição de quatro nanogramas por microliters do reagente de transfecção policrórica cônica a cada poço.Cerca de oito a doze horas após a infecção pelo vírus, substitua o meio pelo meio normal. Às 48 horas após a infecção, lave o prato com 1 mL de PBS estéril para remover as células mortas. Em seguida, tentepsinizar as células usando 250 microlitres de 0,05% trypsin-EDTA solução por poço de uma placa de seis poços à temperatura ambiente.Centrifugar a placa a 200 xg por cinco minutos a quatro graus Celsius. Depois de remover o supernasce, suspenda a pelota celular em um mL de PBS e adicione a suspensão celular a um tubo de fundo redondo de poliestireno de cinco mL. Em seguida, coloque o tubo no citômetro de fluxo para analisar a amostra.Para reprogramação direta de fibroblastos, cubra um poço de uma placa de cultura celular de seis poços com 1 mL de solução de gelatina de 0,1% à temperatura ambiente. Após 15 a 30 minutos, quando o poço estiver completamente coberto com a gelatina, aspirar solução de gelatina de 0,1%. Em seguida, chapa 5 vezes 10 para o 4º camundongo fibroblastos embrionários, ou MEFs, em um poço de uma placa de seis poços revestida com 0,1% de gelatina, e cultura as células durante a noite com o meio normal a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono.Após 24 horas, quando os MEFs atingirem 40 a 50% de confluência, substitua o meio pelo meio normal. Em seguida, derreta o vírus congelado e concentrado no gelo. Calcule o volume do vírus a ser adicionado usando a equação e, em seguida, adicione o vírus concentrado para os seis fatores de transcrição a cada poço, de acordo com o volume calculado.Adicione quatro microgramas por mL do agente de transfecção polimérica cônica ao poço. Considere-o como o dia zero da infecção por lentivírus. No primeiro dia, após 8 a 12 horas de infecção, substitua o meio contendo o vírus pelo meio normal fresco, ao mesmo tempo em que adiciona 0,5 microgramas por mL puramicina para tela de linhas celulares infectadas estáveis.No segundo dia, 48 horas após a infecção, substitua gradualmente o meio supernante pelo meio de reprogramação. Altere um quarto do volume médio total antes de adicionar três micromolar CHIR99021. Do terceiro ao sétimo dia, dependendo da condição das células, altere o meio substituindo-o gradualmente por uma maior proporção de meio de reprogramação para mudar para o meio de reprogramação completo dentro de cinco dias.Em seguida, desprendem as células com 500 microlitrais de enzima digestiva 0,05% trypsin-EDTA por três minutos à temperatura ambiente. Quando aproximadamente sessenta por cento das células flutuarem, pare a digestão adicionando o meio normal, duas vezes o volume da enzima digestiva. Colete a suspensão celular em um tubo cônico estéril de 15 mL para centrífuga a 200 xg por cinco minutos a quatro graus Celsius.Remova o supernatante antes de suspender a pelota celular com o meio de reprogramação. Quando terminar, emplaque as células re-suspensas em um prato estéril de 60 milímetros. Cultume as células a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada de 5% de dióxido de carbono.Após quarenta e oito horas de infecção por lentivírus em células HEK-293T, o sucesso da produção concentrada de lentivírus foi avaliado observando a intensidade de fluorescência do GFP ou por citometria de fluxo. O título do vírus concentrado foi encontrado alto em 10 a 8 tu/mL. Durante a reprogramação direta dos fibroblastos, a morfologia celular mudou gradualmente para sinapse celular alongada e núcleos celulares aumentados.No entanto, as células envelhecem progressivamente após o dia 20. A remoção dos fatores de transcrição, Mitf, Pax3 ou Sox10, resultou no silenciamento da expressão de genes melanócticos, Tyr, Tyrp1 e Mlana, indicando o maior impacto na conversão do fibroblasto para melanócitos. Assim, a expressão de genes melanóciticos induzidos pela programação direta com três fatores de transcrição foi maior quando comparada com seis fatores de transcrição.Para identificar melanócitos induzidos pelo MEF, ou iMels, a expressão de marcadores melanócticos, TYRP1 e DCT foi detectada usando manchas imunofluorescentes. Além disso, os métodos de coloração específicos de melanina, como dopa e coloração de Masson-Fontana, apresentaram resultados positivos. As células 293T devem ser distribuídas uniformemente.Além disso, a adição de mistura de transfecção às células deve ser feita suavemente para evitar que as células flutuam. O protocolo é estável e prático e pode ser usado para reprogramar outros tipos de células. Espera fornecer uma referência e uma estratégia para a reprogramação direta in vivo na regeneração de melanócitos na medicina futura.

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JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Developmental Biology

Unit 1

The Integumentary System

SCIENTISTS IN ACTION

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Estável e eficiente modificação genética de células do rato adulto V-SVZ para a Análise da Neural Stem Cell Autónoma e Efeitos não autónomos

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Biologia do Desenvolvimento

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Métodos de Transferência Precisamente localizada de células ou DNA em adiantado postimplantation embriões de camundongos

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Derivação sem alimentador de melanócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Kinetic Medição e visualização em tempo real de Reprogramação Somatic

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Protocolo para a conversão directa de murino embrionárias fibroblastos em células-tronco trofoblásticas

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Reprogramação do rato embrionárias fibroblastos com Fatores de transcrição para induzir um Programa hegemônicos

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Estabelecimento de células tetraplóides proliferativa de fibroblastos humanos não transformadas

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

Reprogramação condicional de células Pediátrica Humano esofágico epiteliais para uso em Engenharia de Tecidos e Doença de Investigação

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Avaliando cardiomiócitos subtipos Seguindo Reprogramação Fator de Transcrição mediada por embrionárias de camundongos Fibroblastos

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Reprogramação de primário líquido amniótico e a membrana de células de pluripotência em condições Xeno-livre

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...