Name: direct reprogramming of mouse fibroblasts into melanocytes
Uploaded: 2021-08-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes at JoVE.com

Это исследование было частично поддержано грантами Национального фонда естественных наук Китая (82070638 и 81770621) и Фонда естественных наук провинции Цзянсу (BK20180281).

Эта работа была одобрена Комитетом по управлению и использованию лабораторных животных в Университете Цзянсу (UJS-IACUC-AP--20190305010). Эксперименты проводились в строгом соответствии со стандартами, установленными Международной ассоциацией по оценке и аккредитации по уходу за лабораторными ...

<ol>
	<li>Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo.">Vitiligo.</a> Lancet. 386 (9988), 74-84 (2015).</li><li>Picardo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo.">Vitiligo.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15011 (2015).</li><li>Speeckaert, R., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo:+An+update+on+pathophysiology+and+treatment+options.">Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options.</a> American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).</li><li>Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo+management:+combination+of+surgical+treatment+and+phototherapy+under+reflectance+confocal+microscopy+monitoring.">Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).</li><li>Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+therapies+for+vitiligo.">Surgical therapies for vitiligo.</a> Dermatologic Clinics. 35 (2), 193-203 (2017).</li><li>Bishnoi, A., Parsad, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+molecular+aspects+of+vitiligo+treatments.">Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments.</a> International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509 (2018).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+transcription+factor-mediated+reprogramming+to+pluripotency.">A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).</li><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-based+cell+therapy-promise+and+challenges.">Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges.</a> Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).</li><li>Xu, J., Du, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming:+strategies,+mechanisms,+and+applications.">Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li><li>Gasc&#243;n, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., G&#246;tz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neuronal+reprogramming:+achievements,+hurdles,+and+new+roads+to+success.">Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success.</a> Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).</li><li>Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cellular+reprogramming+and+inner+ear+regeneration.">Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).</li><li>Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+wound-resident+cells+generates+skin+epithelial+tissue.">In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue.</a> Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).</li><li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+to+functional+melanocytes+by+defined+factors.">Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors.</a> Nature Communications. 5, 5807 (2014).</li><li>Fehrenbach, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+tumorigenic+potential+upon+transdifferentiation+from+keratinocytic+into+melanocytic+lineage.">Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage.</a> Scientific Reports. 6, 28891 (2016).</li><li>Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+extracting+RNA+and+genomic+DNA+from+archived+human+blood+and+muscle.">A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle.</a> Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).</li><li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-transcription+PCR+(RT-PCR).">Reverse-transcription PCR (RT-PCR).</a> Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).</li><li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+staining.">Immunofluorescence staining.</a> Current Protocols in Cell Biology. 69 (1), 1-7 (2015).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+vectors+for+gene-based+therapy.">Non-viral vectors for gene-based therapy.</a> Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).</li></ol>

Качество вируса имеет решающее значение для успеха прямого перепрограммирования на меланоциты в этом протоколе. Способ упаковки и концентрирования вирусов в этом протоколе прост и легко повторяется и не опирается на какой-либо другой вспомогательный концентрированный реагент. Этот ?...

Витилиго – это кожное заболевание, которое серьезно влияет на физическое и психическое здоровье пострадавших лиц. По разным причинам, включая метаболические нарушения, окислительный стресс, генерацию медиаторов воспаления, отслойку клеток и аутоиммунный ответ, функциональные меланоциты теряются, а секреция меланина прекращается, что приводит к развитию витилиго 1,2. Это состояние встречается широко и особенно проблематично на лице. Основным методом лечения является системное применение кортикостероидов и иммуномодуляторов. Фототерапия может быть использована при системных или местных заболеваниях, и существуют хирургические методы лечения, такие как перфорированная трансплантация кожи и аутологичная трансплантация меланоцитов 3,4,5. Однако пациенты, которые используют медикаментозную терапию и фототерапию, склонны к рецидивам, и эти методы лечения имеют слабые долгосрочные терапевтические эффекты. Хирургическое лечение травматично и только умеренно эффективно 2,6. Поэтому при витилиго необходима новая и эффективная терапевтическая стратегия.
Перепрограммирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) возвращает эти клетки из их терминального состояния в плюрипотентное состояние, процесс, опосредованный факторами транскрипции Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc7. Однако из-за возможности опухолегенности и длительного времени производства эта технология была встречена со скептицизмом при применении в клинических условиях8. Прямое перепрограммирование - это технология, которая заставляет один тип терминальной ячейки превращаться в другой тип терминальной ячейки9. Этот процесс достигается подходящими факторами транскрипции. Различные клетки уже были успешно перепрограммированы, включая кардиомиоциты10, нейроны11 и кохлеарные волосковые клетки12. Некоторые исследователи даже перепрограммировали ткань кожи непосредственно на месте, которая может быть использована для заживления ран13. Преимущества прямого перепрограммирования включают сокращение времени ожидания и затрат, более низкий риск развития рака, меньше этических проблем и лучшее понимание механизма, лежащего в основе определения судьбы клеток9.
Хотя метод прямого перепрограммирования широко используется, в настоящее время нет определенного метода прямого перепрограммирования клеток кожи в меланоциты, особенно из-за многочисленных факторов транскрипции, которые следует считать14,15. Факторы транскрипции, Mitf, Sox10 и Pax3, были использованы для прямого перепрограммирования клеток кожи в меланоциты14. Напротив, комбинация MITF, PAX3, SOX2 и SOX9 также использовалась для прямого перепрограммирования клеток кожи в меланоциты человека в другом исследовании15. В этом протоколе, несмотря на использование другого метода скрининга, тот же результат был получен с комбинацией Mitf, Sox10 и Pax3 для прямого перепрограммирования клеток кожи в меланоциты, как описано ранее14. Разработка системы для генерации меланоцитов из других клеток кожи может обеспечить схему преобразования других клеток кожи пациентов с витилиго в меланоциты. Следовательно, крайне важно построить простой и эффективный метод для этого прямого перепрограммирования для успешной генерации меланоцитов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-062</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;M filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHVR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene round bottom tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%/100% ethanol</td>
			<td>LANBAO</td>
			<td>210106</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2786</td>
			<td>Stock concentration 40 mg/mL 
			Final concentration 24 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21137</td>
			<td>Dilution of 1:500 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics(Pen/Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRP1/TYRP1 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABC592</td>
			<td>Host/Isotype: Mouse IgG2a 
			Species reactivity: Mouse/Human 
			Dilution of 1:200 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRP2/DCT Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab74073</td>
			<td>Host/Isotype: Rabbit IgG 
			Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>Stock concentration 10 mM 
			Final concentration 3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td>Stock concentration 0.3 mg/mL 
			Final concentration 20 pM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-165-144</td>
			<td>Dilution of 1:500 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (High glucose)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C 
			Heat-inactivated before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2)</td>
			<td>Hanheng Biological Technology Co., Ltd.</td>
			<td>pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab220365</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EDN3</td>
			<td>American-Peptide</td>
			<td>88-5-10A</td>
			<td>Stock concentration 100 &#956;M 
			Final concentration 0.1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/mL 
			Final concentration 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-DOPA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9628</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Transfection reagent, stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson-Fontana staining kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G2032</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral balsam</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8590</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (-)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Stock concentration 1 mM 
			Final concentration 200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td>cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 &#956;g/&#181;L 
			Final concentration 4 ng/&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13256-029</td>
			<td>Stock concentration 4 &#956;g/mL 
			Final concentration 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human insulin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>I3536</td>
			<td>Stock concentration 10 mg/mL 
			Final concentration 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human SCF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>255-SC-010</td>
			<td>Stock concentration 200 &#956;g/mL 
			Final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1330-20-7</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct reprogramming of mouse fibroblasts into melanocytes

Потеря функции меланоцитов приводит к витилиго, что серьезно сказывается на физическом и психическом здоровье пораженных лиц. В настоящее время не существует эффективного долгосрочного лечения витилиго. Поэтому крайне важно разработать удобное и эффективное лечение витилиго. Технология регенеративной медицины для прямого перепрограммирования клеток кожи в меланоциты, по-видимому, является многообещающим новым методом лечения витилиго. Это включает в себя прямое перепрограммирование клеток кожи пациента в функциональные меланоциты, чтобы помочь улучшить потерю меланоцитов у пациентов с витилиго. Однако этот метод необходимо сначала протестировать на мышах. Хотя прямое перепрограммирование широко используется, нет четкого протокола для прямого перепрограммирования в меланоциты. Более того, количество доступных факторов транскрипции ошеломляет. 
Здесь представлен протокол концентрированной системы упаковки лентивируса для получения факторов транскрипции, выбранных для перепрограммирования клеток кожи в меланоциты, включая Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 и Snai2. Мышиные эмбриональные фибробласты (MEF) были инфицированы концентрированным лентивирусом для всех этих факторов транскрипции для прямого перепрограммирования MEF в индуцированные меланоциты (iMels) in vitro. Кроме того, эти факторы транскрипции были проверены, и система была оптимизирована для прямого перепрограммирования на меланоциты. Экспрессия характерных маркеров меланина в iMels на уровне гена или белка была значительно повышена. Эти результаты свидетельствуют о том, что прямое перепрограммирование фибробластов в меланоциты может стать успешной новой терапевтической стратегией при витилиго и подтвердить механизм развития меланоцитов, что обеспечит основу для дальнейшего прямого перепрограммирования фибробластов в меланоциты in vivo.

Данная статья включает протоколы концентрированной лентивирусной упаковочной системы для получения лентивируса факторов транскрипции для прямого перепрограммирования фибробластов в меланоциты и протоколы скрининга факторов транскрипции и прямого перепрограммирования меланоцит?...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes at JoVE.com

Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes

Здесь мы описываем оптимизированную систему прямого перепрограммирования меланоцитов и высокоэффективную, концентрированную систему упаковки вирусов, которая обеспечивает плавное прямое перепрограммирование.

Прямое перепрограммирование фибробластов мыши в меланоциты

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, ...

Сообщалось о прямом перепрограммировании для генерации меланоцитов. Тем не менее, различные факторы транскрипции используются в разных исследованиях. В этом протоколе мы проверили и уменьшили число факторов транскрипции еще с более высокой эффективностью перепрограммирования.Мы создали систему прямого перепрограммирования для генерации меланоцитов, используя только три фактора транскрипции, Mitf, Sox10 и PAX3, и модифицировали систему культивирования, чтобы сделать ее более стабильной и надежной. Как регенерировать функциональные меланоциты является важным вопросом, который может помочь устранить ограничения терапии для депигментационных заболеваний, таких как витилиго. Правильное перепрограммирование обеспечивает перспективу Наша техника обладает характеристиками удобства, сильной работоспособности и стабильности, которые легче продвигать и повторять.Чтобы начать производство концентрированного лентивируса, вводят 1,5 раза 10 по 6 heK-293T клеток в 60-миллиметровую чашку и культивируют клетки с нормальной средой при 37 градусах Цельсия в увлажненном инкубаторе с 5% углекислым газом. После 24 часов инкубации, когда клетки HEK-293T достигнут 80-90% конфюлюзии, замените среду 3,5 мл DMEM, затем инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия в увлажненном инкубаторе с 5% углекислым газом в течение двух часов. После удаления клеток из инкубатора замените среду DMEM, содержащую 2% FBS, и добавьте свежеприготовленную смесь трансфекционного комплекса в клетки по каплям.Аккуратно перемешайте жидкую смесь. По завершении восьми часов измените клеточную среду на 3,5 мл нормальной среды. Соберите супернатант вируса в 24 и 48 часов.Затем смешайте вирусные супернатанты, собранные в двух разных временных точках, и центрифугируйте смесь при 200 xg в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Затем пропустите собранный супернатант через 0,45-микронные фильтры для сбора фильтрата в 50-мл стерильную коническую трубку. Концентрируйте фильтрованный вирусный супернатант центрифугированием при 6 000 хг при четырех градусах Цельсия в течение ночи.После этого убедитесь, что гранула вируса видна в нижней части конической трубки. Выливайте супернатант медленно. Для растворения гранул вируса в нормальной среде с одним на 100*объемом супернатанта вируса.Используйте микропипетку P1000, чтобы аккуратно пипетку вверх и вниз до получения однородной 100-кратной концентрированной вирусной смеси. Разделите концентрированный вирус на микроцентрифужные трубки для хранения при температуре 80 градусов цельсия. Плита 1 раз по 10 до 5-й ячейки HEK-293T в одну скважину из шестилуночной пластины.Культивируйте эти клетки с нормальной средой при 37 градусах Цельсия в увлажненном инкубаторе с 5% углекислым газом. Через 24 часа добавьте от 0,1 до 0,2 микролитра 100-кратного флуоресцентного концентрированного вируса в каждую лунку. С последующим добавлением четырех нанограммов на микролитр катионного полимерного трансфекционного реагента к каждой лунке.Примерно через восемь-двенадцать часов после заражения вирусом замените среду нормальной средой. Через сорок восемь часов после заражения вымойте посуду 1 мл стерильного PBS, чтобы удалить мертвые клетки. Затем трипсинизируют клетки, используя 250 микролитров 0,05% раствора трипсина-ЭДТА на лунку шестилуночной пластины при комнатной температуре.Центрифугируйте пластину при 200 хг в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После удаления супернатанта повторно суспендируйте ячейку гранулы в одном мл PBS и добавьте клеточную суспензию в трубку с круглым дном из полистирола в пять мл. Затем поместите трубку в проточный цитометр для анализа образца.Для прямого перепрограммирования фибробластов покрывают одну лунку шестилуночной клеточной культуральной пластины 1 мл 0,1% раствора желатина при комнатной температуре. Через 15 - 30 минут, когда лунка будет полностью покрыта желатином, аспират 0,1% раствор желатина. Затем 5 раз по 10 до 4-й мышиные эмбриональные фибробласты, или MEF, помещают в одну лунку из шестилуночной пластины, покрытой 0,1% желатина, и культивируют клетки в течение ночи с нормальной средой при 37 градусах Цельсия в увлажненном инкубаторе с 5% углекислым газом.Через 24 часа, когда MEF достигнут слияния от 40 до 50%, замените среду нормальной средой. Далее растопить замороженный, концентрированный вирус на льду. Рассчитайте объем вируса, который будет добавлен с помощью уравнения, а затем добавьте концентрированный вирус для шести факторов транскрипции в каждую скважину в соответствии с рассчитанным объемом.Добавьте четыре микрограмма на мл катионного полимерного трансфекционного агента в лунку. Рассмотрим его как нулевой день лентивирусной инфекции. В первый день, после 8-12 часов инфекции, замените среду, содержащую вирус, свежей нормальной средой, добавляя 0,5 микрограмма на мл пуромицина для скрининга стабильных инфицированных клеточных линий.На второй день, через 48 часов после заражения, постепенно заменяйте надводную среду перепрограммирующей средой. Измените одну четверть от общего объема среды, прежде чем добавлять три микромоляра CHIR99021. С третьего по седьмой день, в зависимости от состояния клеток, изменяйте среду, постепенно заменяя ее более высокой долей перепрограммирующей среды, чтобы переключиться на полную среду перепрограммирования в течение пяти дней.Далее отделяют клетки 500 микролитрами 0,05% трипсина-ЭДТА пищеварительного фермента на три минуты при комнатной температуре. Когда примерно шестьдесят процентов клеток всплывут вверх, остановите пищеварение, добавив нормальную среду, в два раза превышающую объем пищеварительного фермента. Соберите клеточную суспензию в 15-мл стерильную коническую трубку для центрифуги при 200 хг в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.Удалите супернатант перед повторной приостановкой клеточной гранулы с помощью среды перепрограммирования. Когда это будет сделано, обложите повторно взвешенные клетки в 60-миллиметровую стерильную посуду. Культивируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в увлажненном 5%-ном инкубаторе углекислого газа.После сорока восьми часов лентивирусной инфекции в клетках HEK-293T успех концентрированной продукции лентивируса оценивали путем наблюдения за интенсивностью флуоресценции GFP или с помощью проточной цитометрии. Было обнаружено, что титр концентрированного вируса высок при 10-8-м TU/мл. Во время прямого перепрограммирования фибробластов морфология клеток постепенно изменялась на удлиненный клеточный синапс и увеличенные клеточные ядра.Однако клетки постепенно стареют после двадцати дней. Удаление факторов транскрипции, Mitf, Pax3 или Sox10, привело к заглушанию экспрессии меланоцитарных генов, Tyr, Tyrp1 и Mlana, что указывает на наибольшее влияние на превращение фибробластов в меланоциты. Следовательно, экспрессия меланоцитарных генов, индуцированных прямым программированием с тремя факторами транскрипции, была выше по сравнению с шестью факторами транскрипции.Для идентификации MEF-индуцированных меланоцитов, или iMels, экспрессия меланоцитарных маркеров, TYRP1 и DCT была обнаружена с использованием иммунофлуоресцентного окрашивания. Кроме того, меланин-специфические методы окрашивания, такие как DOPA и окрашивание Массона-Фонтана, показали положительные результаты. Ячейки 293T должны быть распределены равномерно.Кроме того, добавление трансфекционной смеси к клеткам должно быть сделано осторожно, чтобы предотвратить плавание клеток. Протокол является стабильным и практичным, и его можно использовать для перепрограммирования других типов клеток. Ожидается, что он обеспечит ориентир и стратегию прямого перепрограммирования in vivo в регенерации меланоцитов в будущей медицине.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Developmental Biology

Unit 1

The Integumentary System

SCIENTISTS IN ACTION

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Стабильной и эффективной генетической модификации клеток у мышей взрослых V-СВЗ для анализа нейронных стволовых клеток автономный и Неавтономные эффекты

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Методы Именно локализованного передачи ячеек или ДНК в начале постимплантационных эмбрионов мыши

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-свободный Вывод меланоцитов из человеческих плюрипотентные стволовые клетки

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Кинетическая измерения и в реальном времени Визуализация соматического Перепрограммирование

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Протокол для прямого преобразования мышиных эмбриональных фибробластов в трофобласт стволовых клеток

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Перепрограммирование эмбриональных фибробластов мыши с транскрипционных факторов для индуцирования кроветворения программы

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Создание пролиферативный тетраплоид клеток из нетрансформированных фибробластах человека

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

Условный Перепрограммирование педиатрический человеческого пищеводного эпителиальных клеток для использования в тканевой инженерии и профилактике заболеваний Исследование

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Оценка кардиомиоцитов подтипов После Транскрипция фактор опосредованного перепрограммирования эмбриональных фибробластов мыши

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Перепрограммирование первичной амниотической жидкости и мембраны клеток для плюрипотентности в условиях Xeno бесплатно

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...