Name: direct reprogramming of mouse fibroblasts into melanocytes
Uploaded: 2021-08-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes at JoVE.com

Este estudio fue parcialmente apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82070638 y 81770621) y la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Jiangsu (BK20180281).

Este trabajo fue aprobado por el Comité de Manejo y Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad de Jiangsu (UJS-IACUC-AP--20190305010). Los experimentos se realizaron en estricta conformidad con los estándares establecidos por la Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International). No hubo experimentos con humanos, por lo que este trabajo no necesitó la aprobación del comité de ética de investigación humana. Consulte la Tabla de materiales</stron...

<ol>
	<li>Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo.">Vitiligo.</a> Lancet. 386 (9988), 74-84 (2015).</li><li>Picardo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo.">Vitiligo.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15011 (2015).</li><li>Speeckaert, R., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo:+An+update+on+pathophysiology+and+treatment+options.">Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options.</a> American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).</li><li>Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo+management:+combination+of+surgical+treatment+and+phototherapy+under+reflectance+confocal+microscopy+monitoring.">Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).</li><li>Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+therapies+for+vitiligo.">Surgical therapies for vitiligo.</a> Dermatologic Clinics. 35 (2), 193-203 (2017).</li><li>Bishnoi, A., Parsad, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+molecular+aspects+of+vitiligo+treatments.">Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments.</a> International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509 (2018).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+transcription+factor-mediated+reprogramming+to+pluripotency.">A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).</li><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-based+cell+therapy-promise+and+challenges.">Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges.</a> Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).</li><li>Xu, J., Du, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming:+strategies,+mechanisms,+and+applications.">Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li><li>Gasc&#243;n, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., G&#246;tz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neuronal+reprogramming:+achievements,+hurdles,+and+new+roads+to+success.">Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success.</a> Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).</li><li>Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cellular+reprogramming+and+inner+ear+regeneration.">Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).</li><li>Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+wound-resident+cells+generates+skin+epithelial+tissue.">In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue.</a> Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).</li><li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+to+functional+melanocytes+by+defined+factors.">Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors.</a> Nature Communications. 5, 5807 (2014).</li><li>Fehrenbach, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+tumorigenic+potential+upon+transdifferentiation+from+keratinocytic+into+melanocytic+lineage.">Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage.</a> Scientific Reports. 6, 28891 (2016).</li><li>Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+extracting+RNA+and+genomic+DNA+from+archived+human+blood+and+muscle.">A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle.</a> Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).</li><li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-transcription+PCR+(RT-PCR).">Reverse-transcription PCR (RT-PCR).</a> Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).</li><li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+staining.">Immunofluorescence staining.</a> Current Protocols in Cell Biology. 69 (1), 1-7 (2015).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+vectors+for+gene-based+therapy.">Non-viral vectors for gene-based therapy.</a> Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).</li></ol>

La calidad del virus es crucial para el éxito de la reprogramación directa a los melanocitos en este protocolo. El método de envasado y concentración de virus en este protocolo es simple y fácil de repetir y no depende de ningún otro reactivo concentrado auxiliar. Este protocolo se puede seguir con éxito en la mayoría de los laboratorios. Para garantizar la calidad del virus concentrado, los siguientes puntos necesitan una atención especial. Uno es el estado celular de HEK-293T. Aunque las células HEK-293T son ...

El vitiligo es una enfermedad de la piel que afecta seriamente la salud física y mental de los individuos afectados. Por diversas razones, incluyendo anomalías metabólicas, estrés oxidativo, generación de mediadores inflamatorios, desprendimiento celular y respuesta autoinmune, los melanocitos funcionales se pierden y se detiene la secreción de melanina, lo que lleva al desarrollo de vitiligo 1,2. Esta condición ocurre ampliamente y es particularmente problemática en la cara. El tratamiento principal es el uso sistémico de corticosteroides e inmunomoduladores. La fototerapia se puede utilizar para enfermedades sistémicas o locales, y existen tratamientos quirúrgicos, como el trasplante de piel perforada y el trasplante autólogo de melanocitos 3,4,5. Sin embargo, los pacientes que usan terapia farmacológica y fototerapia son propensos a la recaída, y estos tratamientos tienen efectos terapéuticos pobres a largo plazo. El tratamiento quirúrgico es traumático y sólo moderadamente efectivo 2,6. Por lo tanto, se necesita una estrategia terapéutica nueva y efectiva para el vitiligo.
La reprogramación de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) revierte estas células de su estado terminal a un estado pluripotente, un proceso mediado por los factores de transcripción, Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc7. Sin embargo, debido a la posibilidad de tumorigenicidad y al largo tiempo de producción, esta tecnología ha sido recibida con escepticismo cuando se aplica a entornos clínicos8. La reprogramación directa es una tecnología que hace que un tipo de célula terminal se transforme en otro tipo de célula terminal9. Este proceso se logra mediante factores de transcripción adecuados. Varias células ya han sido reprogramadas directamente con éxito, incluyendo cardiomiocitos10, neuronas11 y células ciliadas cocleares12. Algunos investigadores incluso han reprogramado el tejido de la piel directamente in situ, que se puede utilizar para la reparación de heridas13. Las ventajas de la reprogramación directa incluyen tiempos y costos de espera reducidos, menor riesgo de cáncer, menos problemas éticos y una mejor comprensión del mecanismo subyacente a la determinación del destino celular9.
Aunque el método de reprogramación directa es ampliamente utilizado, actualmente no existe un método definido para la reprogramación directa de las células de la piel en melanocitos, especialmente debido a los numerosos factores de transcripción que deben considerarse14,15. Los factores de transcripción, Mitf, Sox10 y Pax3, se han utilizado para la reprogramación directa de las células de la piel en melanocitos14. En contraste, la combinación de MITF, PAX3, SOX2 y SOX9 también se ha utilizado para la reprogramación directa de células de la piel en melanocitos humanos en otro estudio15. En este protocolo, a pesar del uso de un método de cribado diferente, se obtuvo el mismo resultado con la combinación de Mitf, Sox10 y Pax3 para la reprogramación directa de células de la piel en melanocitos como se describió anteriormente14. El desarrollo de un sistema para generar melanocitos a partir de otras células de la piel puede proporcionar un esquema para transformar otras células de la piel de pacientes con vitiligo en melanocitos. Por lo tanto, es crucial construir un método simple y eficiente para que esta reprogramación directa genere melanocitos con éxito.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-062</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;M filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHVR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene round bottom tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%/100% ethanol</td>
			<td>LANBAO</td>
			<td>210106</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2786</td>
			<td>Stock concentration 40 mg/mL 
			Final concentration 24 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21137</td>
			<td>Dilution of 1:500 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics(Pen/Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRP1/TYRP1 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABC592</td>
			<td>Host/Isotype: Mouse IgG2a 
			Species reactivity: Mouse/Human 
			Dilution of 1:200 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRP2/DCT Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab74073</td>
			<td>Host/Isotype: Rabbit IgG 
			Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>Stock concentration 10 mM 
			Final concentration 3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td>Stock concentration 0.3 mg/mL 
			Final concentration 20 pM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-165-144</td>
			<td>Dilution of 1:500 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (High glucose)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C 
			Heat-inactivated before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2)</td>
			<td>Hanheng Biological Technology Co., Ltd.</td>
			<td>pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab220365</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EDN3</td>
			<td>American-Peptide</td>
			<td>88-5-10A</td>
			<td>Stock concentration 100 &#956;M 
			Final concentration 0.1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/mL 
			Final concentration 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-DOPA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9628</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Transfection reagent, stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson-Fontana staining kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G2032</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral balsam</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8590</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (-)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Stock concentration 1 mM 
			Final concentration 200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td>cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 &#956;g/&#181;L 
			Final concentration 4 ng/&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13256-029</td>
			<td>Stock concentration 4 &#956;g/mL 
			Final concentration 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human insulin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>I3536</td>
			<td>Stock concentration 10 mg/mL 
			Final concentration 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human SCF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>255-SC-010</td>
			<td>Stock concentration 200 &#956;g/mL 
			Final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1330-20-7</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct reprogramming of mouse fibroblasts into melanocytes

La pérdida de función de los melanocitos conduce al vitiligo, que afecta seriamente la salud física y mental de los individuos afectados. Actualmente, no existe un tratamiento efectivo a largo plazo para el vitiligo. Por lo tanto, es imperativo desarrollar un tratamiento conveniente y efectivo para el vitiligo. La tecnología de medicina regenerativa para la reprogramación directa de las células de la piel en melanocitos parece ser un nuevo tratamiento prometedor para el vitiligo. Esto implica la reprogramación directa de las células de la piel del paciente en melanocitos funcionales para ayudar a mejorar la pérdida de melanocitos en pacientes con vitiligo. Sin embargo, este método debe probarse primero en ratones. Aunque la reprogramación directa es ampliamente utilizada, no existe un protocolo claro para la reprogramación directa en melanocitos. Además, el número de factores de transcripción disponibles es abrumador. 
Aquí, se presenta un protocolo de sistema de empaquetado de lentivirus concentrados para producir factores de transcripción seleccionados para reprogramar células de la piel a melanocitos, incluidos Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 y Snai2. Los fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) se infectaron con el lentivirus concentrado para todos estos factores de transcripción para la reprogramación directa de los MEF en melanocitos inducidos (iMels) in vitro. Además, se examinaron estos factores de transcripción y se optimizó el sistema para la reprogramación directa a los melanocitos. La expresión de los marcadores característicos de melanina en iMels a nivel de gen o proteína aumentó significativamente. Estos resultados sugieren que la reprogramación directa de fibroblastos a melanocitos podría ser una nueva estrategia terapéutica exitosa para el vitiligo y confirmar el mecanismo de desarrollo de melanocitos, que proporcionará la base para una mayor reprogramación directa de fibroblastos en melanocitos in vivo.

Este artículo incluye los protocolos de un sistema concentrado de empaquetado de lentivirus para producir lentivirus de factores de transcripción para la reprogramación directa de fibroblastos a melanocitos y protocolos para la detección de factores de transcripción y reprogramación directa de melanocitos a partir de MEFs.
El éxito de la producción concentrada de lentivirus se evaluó observando la intensidad de fluorescencia de GFP (Figura 1A) o por citom...

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Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes

Aquí, describimos un sistema de reprogramación directa optimizado para melanocitos y un sistema de empaquetado de virus concentrado de alta eficiencia que garantiza una reprogramación directa sin problemas.

Reprogramación directa de fibroblastos de ratón en melanocitos

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, ...

Se ha reportado reprogramación directa para generar melanocitos. Sin embargo, varios factores de transcripción se utilizan en diferentes estudios. En este protocolo, validamos y redujimos el número de factores de transcripción aún con una mayor eficiencia de reprogramación.Establecimos un sistema de reprogramación directa para generar melanocitos utilizando solo tres factores de transcripción, Mitf, Sox10 y PAX3, y modificamos el sistema de cultivo para hacerlo más estable y robusto. Cómo regenerar los melanocitos funcionales es una pregunta importante que puede ayudar a abordar las limitaciones de la terapia para las enfermedades de despigmentación como el vitiligo. La reprogramación correcta proporciona una perspectiva Nuestra técnica tiene las características de conveniencia, fuerte operatividad y estabilidad, que es más fácil de promover y repetir.Para comenzar la producción del lentivirus concentrado, coloque la placa 1.5 veces 10 a las 6 células HEK-293T en un plato de 60 milímetros, y cultive las células con medio normal a 37 grados Celsius en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono. Después de 24 horas de la incubación, cuando las células HEK-293T hayan alcanzado una confluencia del 80 al 90%, reemplace el medio con 3.5 mL de DMEM, luego incube las células a 37 grados Celsius en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono durante dos horas. Después de retirar las células de la incubadora, reemplace el medio con DMEM que contenga 2% FBS y agregue la mezcla compleja de transfección recién preparada a las células de manera aleatoria.Mezcle la mezcla líquida suavemente. Al finalizar ocho horas, cambie el medio celular con 3,5 ml de medio normal. Recoger el sobrenadante del virus a las 24 y 48 horas.A continuación, mezcle los sobrenadantes del virus recolectados en dos puntos de tiempo diferentes y centrífuga la mezcla a 200 xg durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Luego pase el sobrenadante recolectado a través de filtros de 0.45 micras para recolectar el filtrado en un tubo cónico estéril de 50 ml. Concentre el sobrenadante del virus filtrado por centrifugación a 6.000 xg a cuatro grados centígrados durante la noche.Una vez hecho esto, asegúrese de que el gránulo del virus sea visible en la parte inferior del tubo cónico. Vierta el sobrenadante lentamente. Para disolver el gránulo del virus en el medio normal con uno por 100 * volumen del sobrenadante del virus.Use una micropipeta P1000 para pipetear hacia arriba y hacia abajo suavemente hasta obtener una mezcla homogénea de virus concentrado 100x. Divida el virus concentrado en los tubos de la microcentrífuga para almacenarlo a 80 grados centígrados. Placa 1 veces 10 a la 5ª célula HEK-293T en un pozo de una placa de seis pocillos.Cultive estas células con el medio normal a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono. Después de 24 horas, agregue de 0.1 a 0.2 microlitros del virus concentrado fluorescente 100x a cada pocillo. Seguido de la adición de cuatro nanogramos por microlitros del reactivo de transfección polimérica catiónica a cada pozo.Alrededor de ocho a doce horas después de la infección con el virus, reemplace el medio con el medio normal. A las cuarenta y ocho horas después de la infección, lave el plato con 1 ml de PBS estéril para eliminar las células muertas. Luego tripsinizar las células usando 250 microlitros de solución de tripsina-EDTA al 0.05% por pocillo de una placa de seis pocillos a temperatura ambiente.Centrifugar la placa a 200 xg durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de retirar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet celular en un ml de PBS y agregue la suspensión celular a un tubo de fondo redondo de poliestireno de cinco ml. Luego coloque el tubo en el citómetro de flujo para analizar la muestra.Para la reprogramación directa de fibroblastos, cubra un pocillo de una placa de cultivo celular de seis pocillos con 1 ml de solución de gelatina al 0,1% a temperatura ambiente. Después de 15 a 30 minutos, cuando el pozo esté completamente cubierto con la gelatina, aspire la solución de gelatina al 0,1%. A continuación, coloque 5 veces 10 a los 4º fibroblastos embrionarios de ratón, o MEF, en un pozo de una placa de seis pocillos recubierta con gelatina al 0,1%, y cultive las células durante la noche con el medio normal a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono.Después de 24 horas, cuando los MEF hayan alcanzado una confluencia del 40 al 50%, reemplace el medio por el medio normal. A continuación, derrita el virus congelado y concentrado en el hielo. Calcule el volumen del virus que se agregará utilizando la ecuación y luego agregue el virus concentrado para los seis factores de transcripción a cada pozo, de acuerdo con el volumen calculado.Agregue cuatro microgramos por ml del agente de transfección polimérica catiónica al pozo. Considéralo como el día cero de la infección por lentivirus. El primer día, después de 8 a 12 horas de infección, reemplace el medio que contiene el virus con el medio normal fresco, mientras agrega 0.5 microgramos por ml de puromicina para detectar líneas celulares infectadas estables.En el segundo día, 48 horas después de la infección, reemplace el medio sobrenadante gradualmente con el medio de reprogramación. Cambie una cuarta parte del volumen medio total antes de agregar tres micromolares CHIR99021. Desde el tercer día hasta el día siete, dependiendo de la condición de las células, cambie el medio reemplazándolo gradualmente con una mayor proporción de medio de reprogramación para cambiar al medio de reprogramación completo dentro de los cinco días.A continuación, separe las células con 500 microlitros de enzima digestiva tripsina-EDTA al 0,05% durante tres minutos a temperatura ambiente. Cuando aproximadamente el sesenta por ciento de las células han flotado, detenga la digestión agregando el medio normal, dos veces el volumen de la enzima digestiva. Recoja la suspensión celular en un tubo cónico estéril de 15 ml para centrifugar a 200 xg durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Retire el sobrenadante antes de volver a suspender el pellet celular con el medio de reprogramación. Cuando haya terminado, coloque las células resuspendidas en un plato estéril de 60 milímetros. Cultive las células a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5%.Después de cuarenta y ocho horas de infección por lentivirus en células HEK-293T, el éxito de la producción concentrada de lentivirus se evaluó observando la intensidad de fluorescencia de GFP o mediante citometría de flujo. Se encontró que el título del virus concentrado era alto en 10 a 8º TU/ml. Durante la reprogramación directa de los fibroblastos, la morfología celular cambió gradualmente a sinapsis celular alargada y núcleos celulares agrandados.Sin embargo, las células envejecieron progresivamente después del día veinte. La eliminación de los factores de transcripción, Mitf, Pax3 o Sox10, resultó en el silenciamiento de la expresión de los genes melanocíticos, Tyr, Tyrp1 y Mlana, lo que indica el mayor impacto en la conversión de fibroblastos a melanocitos. Por lo tanto, la expresión de genes melanocíticos inducida por la programación directa con tres factores de transcripción fue mayor en comparación con seis factores de transcripción.Para identificar melanocitos inducidos por MEF, o iMels, se detectó la expresión de marcadores melanocíticos, TYRP1 y DCT mediante tinción inmunofluorescente. Además, los métodos de tinción específicos de melanina como DOPA y tinción de Masson-Fontana mostraron resultados positivos. Las células 293T deben distribuirse uniformemente.Además, la adición de mezcla de transfección a las células debe hacerse suavemente para evitar que las células floten. El protocolo es estable y práctico y se puede utilizar para reprogramar otros tipos de células. Se espera proporcionar una referencia y una estrategia para la reprogramación directa in vivo en la regeneración de melanocitos en la medicina futura.

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Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Estable y eficiente modificación genética de células en el ratón adulto V-SVZ para el análisis de neural de células madre Autónoma y los efectos no autónomos

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Los métodos para la transferencia Precisamente localizada de células o ADN en Early postimplantación embriones de ratón

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Derivación sin alimentador de melanocitos partir de células madre pluripotentes

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Cinética Medición y visualización en tiempo real de la reprogramación somática

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Protocolo para la conversión directa de murinos fibroblastos embrionarios en células madre Trofoblasto

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

La reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón con factores de transcripción para inducir un programa Hemogenic

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

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Establecimiento de células tetraploides proliferativa de fibroblastos humanos no transformadas

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

La reprogramación condicional de células epiteliales del esófago Pediátrico Humano para el Uso en Ingeniería de Tejidos e Investigación de Enfermedades

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

La evaluación de cardiomiocitos subtipos A raíz de reprogramación mediada por el factor de transcripción de fibroblastos embrionarios de ratón

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Reprogramación de primario líquido amniótico y las células de la membrana a pluripotencia en condiciones libres de Xeno

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...