Name: direct reprogramming of mouse fibroblasts into melanocytes
Uploaded: 2021-08-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes at JoVE.com

Denna studie stöddes delvis av bidrag från National Natural Science Foundation of China (82070638 and 81770621) och Natural Science Foundation of Jiangsu Province (BK20180281).

Detta arbete godkändes av Laboratory Animal Management and Use Committee vid Jiangsu University (UJS-IACUC-AP--20190305010). Experimenten utfördes i strikt överensstämmelse med de standarder som fastställts av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International). Det fanns inga experiment med människor, så detta arbete behövde inte godkännande från den mänskliga forskningsetiska kommittén. Se materialförteckningen för mer information om...

<ol>
	<li>Ezzedine, K., Eleftheriadou, V., Whitton, M., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo.">Vitiligo.</a> Lancet. 386 (9988), 74-84 (2015).</li><li>Picardo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo.">Vitiligo.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15011 (2015).</li><li>Speeckaert, R., van Geel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo:+An+update+on+pathophysiology+and+treatment+options.">Vitiligo: An update on pathophysiology and treatment options.</a> American Journal of Clinical Dermatology. 18 (6), 733-744 (2017).</li><li>Cortelazzi, C., Pellacani, G., Raposio, E., Di Nuzzo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitiligo+management:+combination+of+surgical+treatment+and+phototherapy+under+reflectance+confocal+microscopy+monitoring.">Vitiligo management: combination of surgical treatment and phototherapy under reflectance confocal microscopy monitoring.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 24 (13), 7366-7371 (2020).</li><li>Mohammad, T. F., Hamzavi, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+therapies+for+vitiligo.">Surgical therapies for vitiligo.</a> Dermatologic Clinics. 35 (2), 193-203 (2017).</li><li>Bishnoi, A., Parsad, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+molecular+aspects+of+vitiligo+treatments.">Clinical and molecular aspects of vitiligo treatments.</a> International journal of molecular sciences. 19 (5), 1509 (2018).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+transcription+factor-mediated+reprogramming+to+pluripotency.">A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (3), 183-193 (2016).</li><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-based+cell+therapy-promise+and+challenges.">Pluripotent stem cell-based cell therapy-promise and challenges.</a> Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).</li><li>Xu, J., Du, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming:+strategies,+mechanisms,+and+applications.">Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).</li><li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors.">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li><li>Gasc&#243;n, S., Masserdotti, G., Russo, G. L., G&#246;tz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+neuronal+reprogramming:+achievements,+hurdles,+and+new+roads+to+success.">Direct neuronal reprogramming: achievements, hurdles, and new roads to success.</a> Cell Stem Cell. 21 (1), 18-34 (2017).</li><li>Atkinson, P. J., Kim, G. S., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cellular+reprogramming+and+inner+ear+regeneration.">Direct cellular reprogramming and inner ear regeneration.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (2), 129-139 (2019).</li><li>Kurita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+wound-resident+cells+generates+skin+epithelial+tissue.">In vivo reprogramming of wound-resident cells generates skin epithelial tissue.</a> Nature. 561 (7722), 243-247 (2018).</li><li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+to+functional+melanocytes+by+defined+factors.">Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors.</a> Nature Communications. 5, 5807 (2014).</li><li>Fehrenbach, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+tumorigenic+potential+upon+transdifferentiation+from+keratinocytic+into+melanocytic+lineage.">Loss of tumorigenic potential upon transdifferentiation from keratinocytic into melanocytic lineage.</a> Scientific Reports. 6, 28891 (2016).</li><li>Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+extracting+RNA+and+genomic+DNA+from+archived+human+blood+and+muscle.">A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle.</a> Analytical Biochemistry. 474, 25-27 (2015).</li><li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-transcription+PCR+(RT-PCR).">Reverse-transcription PCR (RT-PCR).</a> Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).</li><li>Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+staining.">Immunofluorescence staining.</a> Current Protocols in Cell Biology. 69 (1), 1-7 (2015).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+vectors+for+gene-based+therapy.">Non-viral vectors for gene-based therapy.</a> Nature Reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).</li></ol>

Virusets kvalitet är avgörande för framgången med direkt omprogrammering till melanocyter i detta protokoll. Metoden för förpackning och koncentration av virus i detta protokoll är enkel och lätt att upprepa och är inte beroende av något annat extra koncentrerat reagens. Detta protokoll kan följas framgångsrikt i de flesta laboratorier. För att säkerställa kvaliteten på det koncentrerade viruset behöver följande punkter särskild uppmärksamhet. En är cellstatusen för HEK-293T. Även om HEK-293T-celle...

Vitiligo är en hudsjukdom som allvarligt påverkar den fysiska och psykiska hälsan hos de drabbade individerna. Av olika skäl, inklusive metaboliska abnormiteter, oxidativ stress, generering av inflammatoriska mediatorer, cellavlossning och autoimmunt svar, förloras de funktionella melanocyterna och utsöndringen av melanin stoppas, vilket leder till utveckling av vitiligo 1,2. Detta tillstånd förekommer i stor utsträckning och är särskilt problematiskt i ansiktet. Huvudbehandlingen är den systemiska användningen av kortikosteroider och immunmodulatorer. Fototerapi kan användas för systemiska eller lokala sjukdomar, och det finns kirurgiska behandlingar, såsom perforerad hudtransplantation och autolog melanocyttransplantation 3,4,5. Patienter som använder läkemedelsbehandling och fototerapi är dock benägna att återfalla, och dessa behandlingar har dåliga långsiktiga terapeutiska effekter. Kirurgisk behandling är traumatisk och endast måttligt effektiv 2,6. Därför behövs en ny och effektiv terapeutisk strategi för vitiligo.
Omprogrammeringen av inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) vänder dessa celler från deras terminala tillstånd till ett pluripotent tillstånd, en process som förmedlas av transkriptionsfaktorerna, Oct4, Sox2, Klf4 och c-Myc7. På grund av risken för tumorigenicitet och den långa produktionstiden har denna teknik dock mötts med skepsis när den tillämpas på kliniska inställningar8. Direkt omprogrammering är en teknik som gör att en typ av en terminalcell omvandlas till en annan typ av en terminalcell9. Denna process uppnås genom lämpliga transkriptionsfaktorer. Olika celler har redan omprogrammerats direkt framgångsrikt, inklusive kardiomyocyter10, neuroner11 och cochleära hårceller12. Vissa forskare har till och med omprogrammerat hudvävnad direkt in situ, som kan användas för sårreparation13. Fördelarna med direkt omprogrammering inkluderar minskade väntetider och kostnader, lägre risk för cancer, färre etiska problem och en bättre förståelse för mekanismen bakom bestämning av cellöden9.
Även om den direkta omprogrammeringsmetoden används i stor utsträckning finns det för närvarande ingen bestämd metod för direkt omprogrammering av hudceller till melanocyter, särskilt på grund av de många transkriptionsfaktorer som ska betraktas som14,15. Transkriptionsfaktorerna, Mitf, Sox10 och Pax3, har använts för direkt omprogrammering av hudceller till melanocyter14. Däremot har kombinationen av MITF, PAX3, SOX2 och SOX9 också använts för direkt omprogrammering av hudceller till humana melanocyter i en annan studie15. I detta protokoll, trots användningen av en annan screeningmetod, erhölls samma resultat med kombinationen av Mitf, Sox10 och Pax3 för direkt omprogrammering av hudceller till melanocyter som beskrivits tidigare14. Att utveckla ett system för att generera melanocyter från andra hudceller kan ge ett system för att omvandla andra hudceller av vitiligopatienter till melanocyter. Därför är det viktigt att konstruera en enkel och effektiv metod för denna direkta omprogrammering för att generera melanocyter framgångsrikt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-062</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;M filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHVR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene round bottom tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%/100% ethanol</td>
			<td>LANBAO</td>
			<td>210106</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2786</td>
			<td>Stock concentration 40 mg/mL 
			Final concentration 24 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Goat anti-Mouse IgG2a</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21137</td>
			<td>Dilution of 1:500 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics(Pen/Strep)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRP1/TYRP1 Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABC592</td>
			<td>Host/Isotype: Mouse IgG2a 
			Species reactivity: Mouse/Human 
			Dilution of 1:200 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TRP2/DCT Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab74073</td>
			<td>Host/Isotype: Rabbit IgG 
			Species reactivity: Mouse/Human Dilution of 1:200 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>Stock concentration 10 mM 
			Final concentration 3 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8052</td>
			<td>Stock concentration 0.3 mg/mL 
			Final concentration 20 pM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-165-144</td>
			<td>Dilution of 1:500 to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (High glucose)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C 
			Heat-inactivated before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-PURO plasmids (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 and Snai2)</td>
			<td>Hanheng Biological Technology Co., Ltd.</td>
			<td>pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab220365</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EDN3</td>
			<td>American-Peptide</td>
			<td>88-5-10A</td>
			<td>Stock concentration 100 &#956;M 
			Final concentration 0.1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0888</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/mL 
			Final concentration 0.5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-DOPA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9628</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Transfection reagent, stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson-Fontana staining kit</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G2032</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral balsam</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G8590</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (-)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C10010500BT</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Stock concentration 1 mM 
			Final concentration 200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268</td>
			<td>cationic polymeric transfection reagent; Stock concentration 8 &#956;g/&#181;L 
			Final concentration 4 ng/&#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A11138-03</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13256-029</td>
			<td>Stock concentration 4 &#956;g/mL 
			Final concentration 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human insulin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>I3536</td>
			<td>Stock concentration 10 mg/mL 
			Final concentration 5 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human SCF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>255-SC-010</td>
			<td>Stock concentration 200 &#956;g/mL 
			Final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1330-20-7</td>
			<td>Stored at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct reprogramming of mouse fibroblasts into melanocytes

Förlusten av melanocyternas funktion leder till vitiligo, vilket allvarligt påverkar de drabbade individernas fysiska och psykiska hälsa. För närvarande, Det finns ingen effektiv långsiktig behandling för vitiligo. Därför är det absolut nödvändigt att utveckla en bekväm och effektiv behandling för vitiligo. Regenerativ medicin teknik för direkt omprogrammering av hudceller till melanocyter verkar vara en lovande ny behandling av vitiligo. Detta innebär direkt omprogrammering av patientens hudceller till funktionella melanocyter för att förbättra förlusten av melanocyter hos patienter med vitiligo. Denna metod måste dock först testas på möss. Även om direkt omprogrammering används i stor utsträckning finns det inget tydligt protokoll för direkt omprogrammering till melanocyter. Dessutom är antalet tillgängliga transkriptionsfaktorer överväldigande. 
Här presenteras ett koncentrerat lentivirusförpackningssystemprotokoll för att producera transkriptionsfaktorer valda för omprogrammering av hudceller till melanocyter, inklusive Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9 och Snai2. Musembryonala fibroblaster (MEF) infekterades med det koncentrerade lentiviruset för alla dessa transkriptionsfaktorer för direkt omprogrammering av MEF till inducerade melanocyter (iMels) in vitro. Dessutom screenades dessa transkriptionsfaktorer och systemet optimerades för direkt omprogrammering till melanocyter. Uttrycket av de karakteristiska markörerna för melanin i iMels vid gen- eller proteinnivån ökade signifikant. Dessa resultat tyder på att direkt omprogrammering av fibroblaster till melanocyter kan vara en framgångsrik ny terapeutisk strategi för vitiligo och bekräfta mekanismen för melanocytutveckling, vilket kommer att ligga till grund för ytterligare direkt omprogrammering av fibroblaster till melanocyter in vivo.

Denna artikel innehåller protokollen för ett koncentrerat lentivirusförpackningssystem för att producera lentivirus av transkriptionsfaktorer för direkt omprogrammering av fibroblaster till melanocyter och protokoll för screening för transkriptionsfaktorer och direkt omprogrammering av melanocyter från MEF.
Framgången för koncentrerad lentivirusproduktion utvärderades genom att observera fluorescensintensiteten hos GFP (figur 1A) eller genom flödescyto...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes at JoVE.com

Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes

Här beskriver vi ett optimerat direkt omprogrammeringssystem för melanocyter och ett högeffektivt, koncentrerat virusförpackningssystem som säkerställer smidig direkt omprogrammering.

Direkt omprogrammering av musfibroblaster till melanocyter

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, ...

Direkt omprogrammering för att generera melanocyter har rapporterats. Olika transkriptionsfaktorer används dock i olika studier. I detta protokoll validerade och minskade vi transkriptionsfaktorantalet fortfarande med högre omprogrammeringseffektivitet.Vi etablerade ett direkt omprogrammeringssystem för att generera melanocyter med endast tre transkriptionsfaktorer, Mitf, Sox10 och PAX3, och modifierade odlingssystemet för att göra det mer stabilt och robust. Hur man regenererar funktionella melanocyter är en viktig fråga som kan hjälpa till att ta itu med terapibegränsningar för depigmentering sjukdomar som vitiligo. Rätt omprogrammering ger en prospektiv Vår teknik har egenskaperna bekvämlighet, stark användbarhet och stabilitet, vilket är lättare att marknadsföra och upprepa.För att börja producera det koncentrerade lentiviruset, platta 1,5 gånger 10 till 6 HEK-293T-cellerna i en 60-millimeter skål och odla cellerna med normalt medium vid 37 grader Celsius i en fuktad inkubator med 5% koldioxid. Efter 24 timmars inkubation, när HEK-293T-cellerna har nått 80 till 90% sammanflöde, ersätt mediet med 3,5 ml DMEM och inkubera sedan cellerna vid 37 grader Celsius i en fuktad inkubator med 5% koldioxid i två timmar. Efter att ha avlägsnat cellerna från inkubatorn, byt ut mediet med DMEM innehållande 2% FBS och tillsätt den nyberedda transfektionskomplexblandningen till cellerna på ett droppvis sätt.Blanda den flytande blandningen försiktigt. Vid slutet av åtta timmar, byt cellmediet med 3,5 ml normalt medium. Samla virussupernatanten vid 24 och 48 timmar.Blanda sedan virussupernatanterna som samlats upp vid två olika tidpunkter och centrifugera blandningen vid 200 xg i fem minuter vid fyra grader Celsius. För sedan den uppsamlade supernatanten genom 0,45 mikron filter för att samla filtratet i ett 50 ml sterilt koniskt rör. Koncentrera den filtrerade virussupernatanten genom centrifugering vid 6 000 xg vid fyra grader Celsius över natten.När du är klar, se till att viruspelleten är synlig längst ner på det koniska röret. Häll ut supernatanten långsamt. För upplösning av viruspelleten i det normala mediet med en x 100: e * volym av virussupernatanten.Använd en P1000-mikropipett för att pipettera försiktigt upp och ner tills en homogen 100x koncentrerad virusblandning erhålls. Dela det koncentrerade viruset i mikrocentrifugrören för att lagra vid 80 grader Celsius. Platta 1 gånger 10 till 5: e HEK-293T-cellerna i en brunn av en sexbrunnsplatta.Odla dessa celler med det normala mediet vid 37 grader Celsius i en fuktad inkubator med 5% koldioxid. Efter 24 timmar tillsätt 0,1 till 0,2 mikroliter av det 100x fluorescerande koncentrerade viruset till varje brunn. Följt av tillsats av fyra nanogram per mikroliter av det katjoniska polymera transfektionsreagenset till varje brunn.Cirka åtta till tolv timmar efter infektion med viruset, byt ut mediet med det normala mediet. Vid fyrtioåtta timmar efter infektion, tvätta skålen med 1 ml steril PBS för att avlägsna de döda cellerna. Trypsinisera sedan cellerna med 250 mikroliter av 0,05% trypsin-EDTA-lösning per brunn av en sexbrunnsplatta vid rumstemperatur.Centrifugera plattan vid 200 xg i fem minuter vid fyra grader Celsius. Efter avlägsnande av supernatanten, suspendera cellpelleten igen i en ml PBS och tillsätt cellsuspensionen till ett fem ml polystyrenrör med rund botten. Placera sedan röret i flödescytometern för att analysera provet.För direkt omprogrammering av fibroblaster, täck en brunn av en sexbrunnscellodlingsplatta med 1 ml 0,1% gelatinlösning vid rumstemperatur. Efter 15 till 30 minuter, när brunnen är helt täckt med gelatinet, aspirera 0,1% gelatinlösning. Därefter platta 5 gånger 10 till de 4: e musembryonala fibroblasterna, eller MEF, i en brunn av en sexbrunnsplatta belagd med 0,1% gelatin och odla cellerna över natten med det normala mediet vid 37 grader Celsius i en fuktad inkubator med 5% koldioxid.Efter 24 timmar, när MEF: erna har nått 40 till 50% sammanflöde, byt ut mediet med det normala mediet. Smält sedan det frusna, koncentrerade viruset på is. Beräkna volymen av viruset som ska tillsättas med hjälp av ekvation och lägg sedan till det koncentrerade viruset för de sex transkriptionsfaktorerna till varje brunn, enligt den beräknade volymen.Tillsätt fyra mikrogram per ml katjonisk polymer transfektionsagent till brunnen. Betrakta det som dag noll av lentivirusinfektionen. På dag ett, efter 8 till 12 timmars infektion, byt ut mediet som innehåller viruset med det färska normala mediet, samtidigt som du tillsätter 0,5 mikrogram per ml puromycin för att screena stabila infekterade cellinjer.På dag två, 48 timmar efter infektion, ersätt det supernatanta mediet gradvis med omprogrammeringsmediet. Ändra en fjärdedel av den totala medelvolymen innan du lägger till tre mikromolära CHIR99021. Från dag tre till dag sju, beroende på cellernas tillstånd, ändra mediet genom att gradvis ersätta det med en högre andel omprogrammeringsmedium för att byta till det fullständiga omprogrammeringsmediet inom fem dagar.Lossa sedan cellerna med 500 mikroliter av 0,05% trypsin-EDTA matsmältningsenzym i tre minuter vid rumstemperatur. När cirka sextio procent av cellerna har flytit upp, stoppa matsmältningen genom att tillsätta det normala mediet, två gånger volymen av matsmältningsenzymet. Samla upp cellsuspensionen i ett 15 ml sterilt koniskt rör för att centrifugera vid 200 xg i fem minuter vid fyra grader Celsius.Ta bort supernatanten innan du suspenderar cellpelleten igen med omprogrammeringsmediet. När du är klar, platta de återupphängda cellerna i en 60 millimeter steril skål. Odla cellerna vid 37 grader Celsius i en fuktad 5% koldioxidinkubator.Efter fyrtioåtta timmars lentivirusinfektion i HEK-293T-celler utvärderades framgången för koncentrerad lentivirusproduktion genom att observera fluorescensintensiteten hos GFP eller genom flödescytometri. Titer för det koncentrerade viruset visade sig vara hög vid 10 till 8: e TU / ml. Under den direkta omprogrammeringen av fibroblasterna förändrades cellmorfologin gradvis till långsträckt cellsynaps och förstorade cellkärnor.Men cellerna åldrades gradvis efter dag tjugo. Avlägsnande av transkriptionsfaktorerna, Mitf, Pax3 eller Sox10, resulterade i tystnaden av uttrycket av melanocytiska gener, Tyr, Tyrp1 och Mlana, vilket indikerar den största inverkan på fibroblastomvandling till melanocyter. Därför var uttrycket av melanocytiska gener inducerade av den direkta programmeringen med tre transkriptionsfaktorer högre jämfört med sex transkriptionsfaktorer.För att identifiera MEF-inducerade melanocyter, eller iMels, detekterades uttrycket av melanocytiska markörer, TYRP1 och DCT med immunofluorescerande färgning. Dessutom visade de melaninspecifika färgningsmetoderna såsom DOPA och Masson-Fontana-färgning positiva resultat. 293T-cellerna ska fördelas jämnt.Dessutom måste tillsatsen av transfektionsblandning till celler göras försiktigt för att förhindra att cellerna flyter. Protokollet är stabilt och praktiskt och det kan användas för att omprogrammera andra typer av celler. Det förväntar sig att ge en referens och en strategi för in vivo direkt omprogrammering vid melanocyterregenerering i framtida medicin.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Developmental Biology

Unit 1

The Integumentary System

SCIENTISTS IN ACTION

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Stabil och effektiv genetisk modifiering av celler i vuxen mus V-SVZ för analys av neurala stamceller autonoma och icke-självständiga effekter

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Metoder för Exakt Lokaliserad Överföring av celler eller DNA i tidig postimplantationsförlust musembryon

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-fria Derivering av Melanocyter från Human pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Kinetic Mätning och Real Time Visualisering av somatiska Omprogrammering

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Protokoll för direkt omvandling av Murina embryonala fibroblaster i trofoblaster stamceller

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Omprogrammering Mouse Embryonala fibroblasts med transkriptionsfaktorer att inducera en Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Etablering av proliferativ tetraploid celler från icke-transforme humanfibroblaster

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

Villkorlig Omprogrammering av Pediatric Human Esophageal epitelceller för användning i Tissue Engineering and Disease Investigation

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Uppskatta cardiomyocyte Subtyper Efter transkriptionsfaktor-medierad Omprogrammering av mus embryonala fibroblaster

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Omprogrammering primära fostervatten och membran celler att Pluripotency Xeno-fria förhållanden

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...