Name: development of a cell co-culture model to mimic cardiac ischemia/reperfusion in vitro
Uploaded: 2021-10-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist støttet af US Department of Veterans Affairs Biomedical Laboratory R&D Service (I01 BX003482) og af institutionelle midler til M.L.R.

1. Eksperimentel forberedelse/plettering
<ol><li>Vedligehold PM'er og PC'er i henhold til producentens anvisninger.<ol>
<li>Tø begge cellelinjer op, når de ankommer fra leverandører. Plade i T25-kolber efter at være blevet vasket med friske medier. Det anbefales at købe hvert cellekulturmedie fra de samme leverandører, som cellerne blev købt fra. Den næste dag skal du opdatere cellerne med medier og bruge dem, når de er sammenflydende.</li>
		<li>Oprethold cellekulturinkubatoren ved 37 ° C me...

<ol>
	<li>Hausenloy, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemic+conditioning+and+targeting+reperfusion+injury:+a+30+year+voyage+of+discovery.">Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery.</a> Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70 (2016).</li><li>Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+a+neglected+therapeutic+target.">Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 92-100 (2013).</li><li>Gottlieb, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+pathways+in+acute+ischemia/reperfusion+injury.">Cell death pathways in acute ischemia/reperfusion injury.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 233-238 (2011).</li><li>Colliva, A., Braga, L., Giacca, M., Zacchigna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-cardiomyocyte+crosstalk+in+heart+development+and+disease.">Endothelial cell-cardiomyocyte crosstalk in heart development and disease.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2923-2939 (2020).</li><li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cell-cell+communication+in+co-culture.">Studying cell-cell communication in co-culture.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 395-396 (2013).</li><li>Salzman, M. M., Bartos, J. A., Yannopoulos, D., Riess, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poloxamer+188+protects+isolated+adult+mouse+cardiomyocytes+from+reoxygenation+injury.">Poloxamer 188 protects isolated adult mouse cardiomyocytes from reoxygenation injury.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 8 (6), 00639 (2020).</li><li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+ischemia/reperfusion+injury.">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 298, 229-317 (2012).</li><li>Martindale, J. J., Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+of+increased+cellular+oxidative+stress+and+myocardial+ischemia+reperfusion+injury+by+directed+sarcolemma+stabilization.">Uncoupling of increased cellular oxidative stress and myocardial ischemia reperfusion injury by directed sarcolemma stabilization.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 26-37 (2014).</li><li>vander Meer, A. D., Orlova, V. V., ten Dijke, P., vanden Berg, A., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+co-cultures+of+human+endothelial+cells+and+embryonic+stem+cell-derived+pericytes+inside+a+microfluidic+device.">Three-dimensional co-cultures of human endothelial cells and embryonic stem cell-derived pericytes inside a microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 13, 3562-3568 (2013).</li><li>Bidarra, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+proliferative+modulation+of+human+mesenchymal+stem+cells+via+crosstalk+with+endothelial+cells.">Phenotypic and proliferative modulation of human mesenchymal stem cells via crosstalk with endothelial cells.</a> Stem Cell Research. 7, 186-197 (2011).</li><li>Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology.">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PloS One. 6, 25661 (2011).</li><li>Mehes, E., Mones, E., Nemeth, V., Vicsek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+motion+of+cells+mediates+segregation+and+pattern+formation+in+co-cultures.">Collective motion of cells mediates segregation and pattern formation in co-cultures.</a> PloS One. 7, 31711 (2012).</li><li>Miki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+of+co-culture+over+mono+cell+culture+in+simulating+in+vivo+environment.">The advantages of co-culture over mono cell culture in simulating in vivo environment.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 131 (3-5), 68-75 (2012).</li><li>Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-chip:+a+focus+on+compartmentalized+microdevices.">Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1211-1227 (2012).</li><li>Campbell, J., Davidenko, N., Caffarel, M., Cameron, R., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology.">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PLoS One. 6, 25661 (2011).</li><li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research.">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10, 939-956 (2010).</li></ol>

Kritiske trin i protokollen Celle co-kultur modeller er blevet brugt til at studere cellulære mekanismer for kardiobeskyttelse. Hvordan man skaber to separate lag med en meningsfuld afstand mellem dem, er således afgørende for udviklingen af en passende co-kulturmodel. En udfordring ved at studere simuleret IR, dvs. HR, skade er, at ikke kun iskæmi (hypoxi) selv, men også reperfusion (reoxygenering) forværrer cellulær dysfunktion. Derfor skal en realistisk model afspejle disse egenskaber ved f....

Iskæmisk hjertesygdom er den største dødsårsag og handicap på verdensplan 1,2. Imidlertid kan behandlingsprocessen for reperfusion i sig selv forårsage kardiomyocytdød, kendt som myokardieiskæmi / reperfusion (IR) skade, for hvilken der stadig ikke er noget effektivt middel3. Endotelceller (EC'er) er blevet foreslået at beskytte kardiomyocytter (PM'er) gennem udskillelse af parakrine signaler samt celle-til-celle-interaktioner4.
Celle-co-kultur modeller er blevet brugt i vid udstrækning til at undersøge rollen autokrine og / eller parakrine celle-celle interaktioner på cellefunktion og differentiering. Blandt co-kulturmodeller er blandet co-kultur den enkleste, hvor to forskellige typer celler er i direkte kontakt inden for et enkelt kulturrum ved et ønsket celleforhold5. Imidlertid er separate behandlinger mellem celletyper og downstream-analyse af en enkelt celletype ikke let gennemførlige i betragtning af den blandede population.
Tidligere undersøgelser viste, at hypoxiske og iskæmiske fornærmelser forårsager betydelig skade på cellemembranens integritet målt ved frigivelse af laktatdehydrogenase (LDH). Denne skade forværres ved reiltning, efterligner reperfusionsskade 6,7,8. Målet med den nuværende protokol var at teste hypoteserne om, at tilstedeværelsen af EC'er kan dosisafhængigt dæmpe cellemembranlækage af PM'er forårsaget af hypoxi og reoxygenering (HR), og at den beskyttende virkning af ECs kan optimeres ved at variere kontaktafstanden mellem de to cellelinjer. Således anvendte vi tre typer cellekulturindsatser og Musens primære koronararterieendotelceller og voksne muskardiomyocytter. Indsatserne, mærket af Corning, Merck Millipore og Greiner Bio-One, tillod os at skabe tre forskellige cellekultur crosstalk-betingelser med intercellelinjeafstande på henholdsvis 0,5, 1,0 og 2,0 mm. 100.000 PC'er blev belagt pr. indsats i hvert tilfælde.
For at afgøre, om tætheden af EC'er i co-kultur bidrager til hr-skadedæmpning i denne model, undersøgte vi desuden dosis-respons-forholdet mellem EF-koncentration og LDH-frigivelse ved CM'er. EC'er blev belagt med henholdsvis 25.000, 50.000 og 100.000 pr. indsats i 2,0 mm-indsatsen.
Denne rapport giver en trinvis tilgang for efterforskere til at bruge denne vigtige model til deres fordel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)</td>
			<td >Celprogen Inc</td>
			<td >11041-14</td>
			<td >Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Automated Cell Counter Countess II</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A27977</td>
			<td>Cell counting for calculating cell numbers</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bio-Safety Cabinet</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU425400</td>
			<td>Cell culture sterile hood</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6916</td>
			<td>Used for cell freezing for long term cell line storage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>Nu-5500</td>
			<td>To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37&#176;C, humidified)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Incubator Gas Tank</td>
			<td>A-L Compressed Gases</td>
			<td>UN1013</td>
			<td>Gas needed for cell culture incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts A (0.5 mm)</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>353095</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts B (1.0 mm)</td>
			<td>Millicell Millipore</td>
			<td>PIHP01250</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts C (2.0 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662640</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td>Anstel Enterprises Inc</td>
			<td>4235</td>
			<td>For cell culture plating and passaging</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Flasks T25</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>E11041-14</td>
			<td>Used for CMs regular culture, coated by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Medium Complete</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14S</td>
			<td>CMs culture complete medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14PN</td>
			<td>CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Plates 96 well</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>E11041-14-96well</td>
			<td>Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Hypoxia Cell Culture Medium</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14GFPN</td>
			<td>CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Countess cell counting chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Counting slides used for cell counter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cyquant LDH Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>C20301</td>
			<td>LDH measurement kit</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Flasks T25</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>FB012935</td>
			<td>Used for ECs regular culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Medium Complete</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>M1168</td>
			<td>ECs culture complete medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>M1168PF</td>
			<td>ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Plates 96 well</td>
			<td>Fisher Scientific (Costar)</td>
			<td>3370</td>
			<td>Used for experiments of LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6950</td>
			<td>Used for coating flasks and plates for ECs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Hypoxia Cell Culture Medium</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>GPF1168</td>
			<td>ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35011CV</td>
			<td>FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxia Chamber</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td>To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxia Chamber Flow Meter</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27311</td>
			<td>To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)</td>
			<td>A-L Compressed Gases</td>
			<td>UN1956</td>
			<td>Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TMS</td>
			<td>To observe cell condition</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>C57-6093</td>
			<td>Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NUNC 15ML CONICL Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565269</td>
			<td>For cell culture process, experiments, solution preparation etc.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NUNC 50ML CONICL Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565271</td>
			<td>For cell culture process, experiments, solution preparation etc.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>Used for cell washing during culture or experiments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plate Reader</td>
			<td>BioTek Instrument</td>
			<td>11120533</td>
			<td>Colorimetric or fluorometric plate reading</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reaction 96 Well Palte (clear no lid)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565226</td>
			<td>Used for LDH measurement plate reading</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA for CMs</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>T1509-014</td>
			<td>1 x sterile filtered and tissue culture tested</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA for ECs</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6914/0619</td>
			<td>0.25%, cell cuture-tested</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a cell co-culture model to mimic cardiac ischemia/reperfusion in vitro

Iskæmisk hjertesygdom er den førende dødsårsag og handicap på verdensplan. Reperfusion forårsager yderligere skade ud over iskæmi. Endotelceller (ECs) kan beskytte kardiomyocytter (PM'er) mod reperfusionsskade gennem celle-celleinteraktioner. Co-kulturer kan hjælpe med at undersøge rollen som celle-celle interaktioner. En blandet co-kultur er den enkleste tilgang, men er begrænset, da isolerede behandlinger og downstream-analyser af enkeltcelletyper ikke er mulige. For at undersøge, om EU'er kan dosisafhængigt dæmpe CM-celleskader, og om denne beskyttelse kan optimeres yderligere ved at variere kontaktafstanden mellem de to cellelinjer, brugte vi Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells og Adult Mouse Cardiomyocytes til at teste tre typer cellekulturindsatser, der varierede i deres intercellelagsafstand ved 0,5, Henholdsvis 1,0 og 2,0 mm. Kun ved CMs steg cellulær skade som vurderet ved laktatdehydrogenase (LDH) frigivelse signifikant under hypoxi og yderligere ved reoxygenering, når afstanden var 2,0 mm sammenlignet med 0,5 og 1,0 mm. Når EC'er og PM'er var i næsten direkte kontakt (0,5 mm), var der kun en mild dæmpning af CM'ernes reoxygeneringsskade efter hypoxi. Denne dæmpelse blev signifikant øget, når den rumlige afstand var 1,0 mm. Med en afstand på 2,0 mm dæmpede ECs CM-skade under både hypoxi og hypoxi/reoxygenering, hvilket indikerer, at tilstrækkelig kulturafstand er nødvendig for, at EC'er kan krydstale med CM'er, således at udskillede signalmolekyler kan cirkulere og fuldt ud stimulere beskyttelsesveje. Vores resultater tyder for første gang på, at optimering af EF/CM-samkulturens rumlige miljø er nødvendig for at tilvejebringe en gunstig in vitro-model til test af EC'ernes rolle i CM-beskyttelse mod simuleret iskæmi/reperfusionsskade. Målet med denne rapport er at give en trinvis tilgang for efterforskere til at bruge denne vigtige model til deres fordel.

Alle tre typer indsatser (A, B, C), der anvendes i dette eksperiment, har samme porestørrelse på 0,4 μm. Den eneste forskel mellem dem er insert-to-base-højden, som gør det muligt for afstande mellem de to samkulturelle cellelag at være henholdsvis 0,5, 1,0 og 2,0 mm (figur 3), og at de er fra forskellige leverandører (for detaljer se Tabel over materialer).
For at etablere en in vitro-co-kulturmodel med separate lag af to cellelin...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro at JoVE.com

Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

Rumlig afstand er en nøgleparameter i vurderingen af hypoxi / reoxygeneringsskade i en co-kulturmodel af separate endotel- og kardiomyocytcellelag, hvilket for første gang tyder på, at optimering af co-kulturens rumlige miljø er nødvendig for at tilvejebringe en gunstig in vitro-model til test af endotelcellernes rolle i kardiomyocytbeskyttelse.

Udvikling af en cellekokulturmodel til efterligning af hjerteiskæmi /reperfusion in vitro

Ischemic heart disease is the leading cause of death and disability worldwide. Reperfusion causes additional injury beyond ischemia. Endothelial cells ...

Vores fund tyder på, at optimering af endotelcellen kardiomyocyt co-kultur rumlige miljø er nødvendig for at tilvejebringe en gunstig in vitro-model til test af endotelcellernes rolle i kardiomyocytbeskyttelse mod simuleret iskæmireprofusionsskade. Celle-co-kultur modeller er blevet brugt i vid udstrækning til at undersøge rollen af celle-celle interaktioner på cellefunktion og differentiering. Imidlertid er separate behandlinger mellem celletyper og downstream-analyse af en enkelt celletype ikke let gennemførlige i den blandede co-kultur.Den nuværende undersøgelse havde til formål at skabe to separate cellelag med en meningsfuld afstand mellem dem, hvor man kan fremkalde hypoxi reprofusionsskade og studere resultatet og virkningerne på en enkelt celletype. Begynd præparatet ved at optø begge cellelinjer. Plader cellerne i T25-kolber efter vask med friske medier.Den næste dag skal du opdatere cellerne med medier og bruge dem, når de er sammenflydende. Oprethold cellekulturinkubatoren ved 37 grader Celsius med 21% ilt, 5% kuldioxid og 74% nitrogen. Hold det befugtet.Anslå kardiomyocytternes cellelinjesammenløb under et lysmikroskop. Mediet fjernes fra kolberne, der indeholder sammenflydende cellekulturer, og trypsiniseres med tre til fem ml trypsin-EDTA pr. kolbe. Kolben omrøres forsigtigt, og der inkuberes ved 37 grader Celsius i to til fem minutter.Derefter vurderes de enzymatiske fremskridt under et lysmikroskop. Efter løsrivelse inaktiveres trypsinopløsningen ved at tilsætte trysin- eller celleopløsningen til et 50 ml rør indeholdende 10 ml medier pr. T25-kolbe. Centrifugering af cellesuspensionen ved 120 x g i to minutter for at opnå en blød cellepille.Efter centrifugering skal du fjerne supernatanten og resuspend pelleten i fem milliliter af et medie. Udfør derefter celletælling og bekræft cellelevedygtighed. Bland og aliquot af 10 mikroliter resuspenderede celler og 10 mikroliter trypan blåt farvestof, tæl derefter de levende celler ved hjælp af en celletæller.Fortynd cellerne med friske regelmæssige medier for at opnå de ønskede såtætheder. Tag en 24-brønds plade forbetræk den med ekstracellulær matrix og pladekardiomyocytter ved såningstætheder på 300.000 pr. Brønd på bunden af pladen. Oprethold cellerne ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid natten over.Efter 24 timer pladeendotelceller i indsatser med en optimal belægningstæthed på 100.000 pr. Indsats. Efter 24 timers endotelcellebelægning skal endotelcelleindsatser placeres inde i kardiomyocytbrøndene og starte samkultur. Tillad celler at co-kultur i 12 til 24 timer, før de udfører eksperimenterne.Forbered det hypoxiske medie ved at hælde ca. 25 ml medier i et 50 ml konisk rør. Luftforsegl toppen med en silikonemembran og brug en steriliseret pipette til at slå et hul. Derefter oprettes et andet hul og efterlades ca. 2/3 af pipetterne nedsænket i medierne.Skyl mediet med hypoxisk gas i fem minutter med en strømningshastighed på 30 liter pr. Minut, og kassér derefter mediet af de 24-brønds plader eller kulturindsatser, der indeholder vedhæftede celler. Vask dem meget forsigtigt med 100 mikroliter 10% PBS pr. brønd tilsæt 500 mikroliter af det frisklavede hypoxiske medie til hver brønd af pladerne eller indsatserne. Udskift det originale medie med friske normale medier indeholdende glucose og serum i den normoxiske kontrolgruppe.Læg en petriskål fyldt med sterilt vand i hypoxikammeret for at befugte kammeret. Anbring derefter pladerne indeholdende de hypoxiske grupper i kammeret. Skyl hypoxikammeret med hypoxisk gas i fem minutter ved en strøm på 30 liter pr. Minut.Derefter placeres kammeret inde i en inkubator ved 37 grader Celsius i 24 timer. Efter hypoxi kasseres pladernes eller indsatsernes gamle medier og tilsættes 500 mikroliter normale medier indeholdende glucose og serum til hver væg af pladerne, og opbevar derefter pladerne inde i en inkubator under normale dyrkningsforhold i to timer for at efterligne reperfusion. Overfør cellekulturmediet fra pladen med 24 brønde til en plade med 96 brønde, og tag derefter 200 mikroliter medier fra hver brønd i pladen med 24 brønde og ligeligt fordelt i fire brønde på pladen med 96 brønde.Mål absorbansen for LDH ved hjælp af et cytotoksicitetsanalysesæt i en 96-brønds plade, og følg producentens anvisninger for at bestemme graden af cellulær skade. I denne undersøgelse blev tre typer indsatser evalueret. Alle tre skær havde samme porestørrelse på 0,4 mikrometer.Den eneste forskel mellem dem var indsatsen til basishøjde, hvilket lod afstanden mellem de to samkulturelle cellelag at være 0,5, 1,0 og 2,0 millimeter. Ved hjælp af denne protokol blev celler dyrket under normale iltforhold og derefter opdelt i to grupper en normoxisk kontrolgruppe og hypoxigruppen. Efter 24 timer blev begge grupper opdateret med medier og dyrket under normale iltforhold i yderligere to timer, før de udførte endepunktsanalyserne.En sammenligning af de tre typer kulturindsatser til vurdering af laktatdehydrogenasefrigivelse for kardiomyocyt alene, endotelceller alene og co-kultur af kardiomyocyt med endotelceller er vist her under normoxiske, hypoxi kun og hypoxi reoxygeneringsbetingelser. Med en afstand på 0,5 millimeter mellem cellelagene førte hypoxi til en signifikant øget LDH-frigivelse sammenlignet med normoxi, når kardiomyocytter blev dyrket alene. LDH blev dog kun øget en smule i hypoxi-reoxygeneringsgruppen sammenlignet med gruppen kun hypoxi.Når endotelceller og kardiomyocytter blev dyrket sammen, blev stigningen i LDH-frigivelse under hypoxi-betingelserne ikke svækket. Dette indikerer, at endotelcellerne ikke havde nogen beskyttende virkning sammenlignet med kardiomyocytterne alene under hypoxi-betingelserne. Imidlertid udøvede endotelceller mild, men signifikant beskyttelse af kardiomyocytter under HR. Når afstanden mellem cellelagene var en millimeter, blev LDH-frigivelsen også signifikant øget i kardiomyocytter kun under hypoxi-betingelsen.I modsætning til i 0,5 millimeter indsatsen blev LDH-stigningen i kardiomyocytter imidlertid kun forstærket af HR over hypoxi-betingelser. Denne stigning var endnu mere udtalt med de to millimeter indsats. Koncentrationen af endotelceller belagt i to millimeterindsatser blev titreret til henholdsvis 25.000, 50.000 og 100.000 celler pr. Indsats.det blev konstateret, at stigende endotelcelleintensitet i co-kulturen førte til en dosisafhængig dæmpning af LDH-frigivelse forårsaget af HR. En sådan effekt blev imidlertid ikke set under normoxiske forhold. Denne co-kultur metode er ikke begrænset til endotelceller og kardiomyocytter. Disse metoder bør hjælpe med en undersøgelse af specifikke celle-celle-interaktioner mellem forskellige cellelinjer på tværs af flere organer af interesse.

Research

JoVE Journal

Biology

Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

Endotel Cell Co-kultur formidler Modning af humane embryonale stamceller til pancreas-insulin-producerende celler i en rettet Differentiering Approach

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

Isolering af brystepitelceller celler fra tre-dimensionel Blandet-celle klumpformet Co-kultur

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Blastomer Eksplantater at teste for Cell Fate Commitment under fosterudviklingen

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

Intravital mikroskopi af mikrocirkulationen i Mouse Cremaster Muscle for Analyse af perifert Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

En Anoxia-sult Model for iskæmi / reperfusion i<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolering og dyrkning af Voksen Mouse kardiomyocytter for cellesignalering og<em&gt; In vitro</em&gt; Hjertehypertrofi

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In vitro-syntese af modificeret mRNA for Induktion af protein-ekspression i humane celler

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Validering af en musemodel at afbryde LINC komplekser i en celle-specifik måde

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...