Name: development of a cell co-culture model to mimic cardiac ischemia/reperfusion in vitro
Uploaded: 2021-10-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro at JoVE.com

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Us Department of Veterans Affairs Biomedical Laboratory R&D Service (I01 BX003482) en door institutionele fondsen aan M.L.R.

1. Experimentele voorbereiding/beplating
<ol><li>Onderhoud CM's en EC's volgens de instructies van de fabrikant.<ol>
<li>Ontdooi beide cellijnen wanneer ze van leveranciers komen. Plaat in T25-kolven na het wassen met verse media. Het wordt aanbevolen om elk celkweekmedium te kopen bij dezelfde leveranciers waar de cellen zijn gekocht. Ververs de volgende dag de cellen met media en gebruik deze bij confluent.</li>
		<li>Houd de celkweekincubator op 37 °C met 21% O2, 5% CO2, 74% N...

<ol>
	<li>Hausenloy, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemic+conditioning+and+targeting+reperfusion+injury:+a+30+year+voyage+of+discovery.">Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery.</a> Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70 (2016).</li><li>Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+a+neglected+therapeutic+target.">Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 92-100 (2013).</li><li>Gottlieb, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+pathways+in+acute+ischemia/reperfusion+injury.">Cell death pathways in acute ischemia/reperfusion injury.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 233-238 (2011).</li><li>Colliva, A., Braga, L., Giacca, M., Zacchigna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-cardiomyocyte+crosstalk+in+heart+development+and+disease.">Endothelial cell-cardiomyocyte crosstalk in heart development and disease.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2923-2939 (2020).</li><li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cell-cell+communication+in+co-culture.">Studying cell-cell communication in co-culture.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 395-396 (2013).</li><li>Salzman, M. M., Bartos, J. A., Yannopoulos, D., Riess, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poloxamer+188+protects+isolated+adult+mouse+cardiomyocytes+from+reoxygenation+injury.">Poloxamer 188 protects isolated adult mouse cardiomyocytes from reoxygenation injury.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 8 (6), 00639 (2020).</li><li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+ischemia/reperfusion+injury.">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 298, 229-317 (2012).</li><li>Martindale, J. J., Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+of+increased+cellular+oxidative+stress+and+myocardial+ischemia+reperfusion+injury+by+directed+sarcolemma+stabilization.">Uncoupling of increased cellular oxidative stress and myocardial ischemia reperfusion injury by directed sarcolemma stabilization.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 26-37 (2014).</li><li>vander Meer, A. D., Orlova, V. V., ten Dijke, P., vanden Berg, A., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+co-cultures+of+human+endothelial+cells+and+embryonic+stem+cell-derived+pericytes+inside+a+microfluidic+device.">Three-dimensional co-cultures of human endothelial cells and embryonic stem cell-derived pericytes inside a microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 13, 3562-3568 (2013).</li><li>Bidarra, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+proliferative+modulation+of+human+mesenchymal+stem+cells+via+crosstalk+with+endothelial+cells.">Phenotypic and proliferative modulation of human mesenchymal stem cells via crosstalk with endothelial cells.</a> Stem Cell Research. 7, 186-197 (2011).</li><li>Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology.">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PloS One. 6, 25661 (2011).</li><li>Mehes, E., Mones, E., Nemeth, V., Vicsek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+motion+of+cells+mediates+segregation+and+pattern+formation+in+co-cultures.">Collective motion of cells mediates segregation and pattern formation in co-cultures.</a> PloS One. 7, 31711 (2012).</li><li>Miki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+of+co-culture+over+mono+cell+culture+in+simulating+in+vivo+environment.">The advantages of co-culture over mono cell culture in simulating in vivo environment.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 131 (3-5), 68-75 (2012).</li><li>Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-chip:+a+focus+on+compartmentalized+microdevices.">Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1211-1227 (2012).</li><li>Campbell, J., Davidenko, N., Caffarel, M., Cameron, R., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology.">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PLoS One. 6, 25661 (2011).</li><li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research.">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10, 939-956 (2010).</li></ol>

Kritieke stappen in het protocol Celco-cultuurmodellen zijn gebruikt om cellulaire mechanismen van cardioprotectie te bestuderen. Het creëren van twee afzonderlijke lagen met een betekenisvolle afstand ertussen is dus cruciaal voor de ontwikkeling van een geschikt co-cultuurmodel. Een uitdaging bij het bestuderen van gesimuleerde IR, d.w.z. HR, letsel is dat niet alleen ischemie (hypoxie) zelf, maar ook reperfusie (reoxygenatie) cellulaire disfunctie verergert. Daarom moet een realistisch model deze ...

Ischemische hartziekte is wereldwijd de belangrijkste oorzaak van overlijden en invaliditeit 1,2. Het behandelingsproces van reperfusie kan echter zelf de dood van cardiomyocyten veroorzaken, bekend als myocardiale ischemie / reperfusie (IR) -letsel, waarvoor er nog steeds geen effectieve remedie is3. Er is gesuggereerd dat endotheelcellen (EC's) cardiomyocyten (CMs) beschermen door de secretie van paracriene signalen, evenals cel-tot-cel interacties4.
Celcocultuurmodellen zijn uitgebreid gebruikt om de rol van autocriene en /of paracriene cel-celinteracties op celfunctie en differentiatie te onderzoeken. Onder co-cultuurmodellen is gemengde co-cultuur de eenvoudigste, waarbij twee verschillende soorten cellen in direct contact staan binnen een enkel kweekcompartiment met een gewenste celverhouding5. Afzonderlijke behandelingen tussen celtypen en downstream-analyse van een enkel celtype zijn echter niet gemakkelijk haalbaar gezien de gemengde populatie.
Eerdere studies toonden aan dat hypoxische en ischemische beledigingen aanzienlijke schade toebrengen aan de integriteit van het celmembraan zoals gemeten door de afgifte van lactaatdehydrogenase (LDH). Dit letsel wordt verergerd bij reoxygenatie, waarbij reperfusieletselwordt nagebootst 6,7,8. Het doel van het huidige protocol was om de hypothesen te testen dat de aanwezigheid van EC's dosisafhankelijk celmembraanlekkage van CM's veroorzaakt door hypoxie en reoxygenatie (HR) kan dempen en dat het beschermende effect van EC's kan worden geoptimaliseerd door de contactafstand tussen de twee cellijnen te variëren. Daarom gebruikten we drie soorten celkweekinzetstukken en muis primaire coronaire endotheelcellen en cardiomyocyten van volwassen muizen. De inserts, gebrandmerkt door Corning, Merck Millipore en Greiner Bio-One, stelden ons in staat om drie verschillende celkweekkruisverwijzingen te creëren met intercellulaire afstanden van respectievelijk 0,5, 1,0 en 2,0 mm. Per inzetstuk werden telkens 100.000 EC's verguld.
Om te bepalen of de dichtheid van EC's in co-cultuur bijdraagt aan hr-letselverzwakking in dit model, bestudeerden we bovendien de dosis-responsrelatie tussen EC-concentratie en LDH-afgifte door CM's. EC's werden geplateerd op respectievelijk 25.000, 50.000 en 100.000 per insert in de insert van 2,0 mm.
Dit rapport biedt een stapsgewijze aanpak voor onderzoekers om dit belangrijke model in hun voordeel te gebruiken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)</td>
			<td >Celprogen Inc</td>
			<td >11041-14</td>
			<td >Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Automated Cell Counter Countess II</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A27977</td>
			<td>Cell counting for calculating cell numbers</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bio-Safety Cabinet</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU425400</td>
			<td>Cell culture sterile hood</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6916</td>
			<td>Used for cell freezing for long term cell line storage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>Nu-5500</td>
			<td>To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37&#176;C, humidified)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Incubator Gas Tank</td>
			<td>A-L Compressed Gases</td>
			<td>UN1013</td>
			<td>Gas needed for cell culture incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts A (0.5 mm)</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>353095</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts B (1.0 mm)</td>
			<td>Millicell Millipore</td>
			<td>PIHP01250</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts C (2.0 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662640</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td>Anstel Enterprises Inc</td>
			<td>4235</td>
			<td>For cell culture plating and passaging</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Flasks T25</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>E11041-14</td>
			<td>Used for CMs regular culture, coated by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Medium Complete</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14S</td>
			<td>CMs culture complete medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14PN</td>
			<td>CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Plates 96 well</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>E11041-14-96well</td>
			<td>Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Hypoxia Cell Culture Medium</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14GFPN</td>
			<td>CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Countess cell counting chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Counting slides used for cell counter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cyquant LDH Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>C20301</td>
			<td>LDH measurement kit</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Flasks T25</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>FB012935</td>
			<td>Used for ECs regular culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Medium Complete</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>M1168</td>
			<td>ECs culture complete medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>M1168PF</td>
			<td>ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Plates 96 well</td>
			<td>Fisher Scientific (Costar)</td>
			<td>3370</td>
			<td>Used for experiments of LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6950</td>
			<td>Used for coating flasks and plates for ECs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Hypoxia Cell Culture Medium</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>GPF1168</td>
			<td>ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35011CV</td>
			<td>FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxia Chamber</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td>To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxia Chamber Flow Meter</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27311</td>
			<td>To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)</td>
			<td>A-L Compressed Gases</td>
			<td>UN1956</td>
			<td>Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TMS</td>
			<td>To observe cell condition</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>C57-6093</td>
			<td>Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NUNC 15ML CONICL Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565269</td>
			<td>For cell culture process, experiments, solution preparation etc.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NUNC 50ML CONICL Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565271</td>
			<td>For cell culture process, experiments, solution preparation etc.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>Used for cell washing during culture or experiments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plate Reader</td>
			<td>BioTek Instrument</td>
			<td>11120533</td>
			<td>Colorimetric or fluorometric plate reading</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reaction 96 Well Palte (clear no lid)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565226</td>
			<td>Used for LDH measurement plate reading</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA for CMs</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>T1509-014</td>
			<td>1 x sterile filtered and tissue culture tested</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA for ECs</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6914/0619</td>
			<td>0.25%, cell cuture-tested</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a cell co-culture model to mimic cardiac ischemia/reperfusion in vitro

Ischemische hartziekte is wereldwijd de belangrijkste oorzaak van overlijden en invaliditeit. Reperfusie veroorzaakt extra letsel buiten ischemie. Endotheelcellen (EC's) kunnen cardiomyocyten (CM's) beschermen tegen reperfusieschade door cel-celinteracties. Coculturen kunnen helpen bij het onderzoeken van de rol van cel-cel interacties. Een gemengde co-kweek is de eenvoudigste benadering, maar is beperkt omdat geïsoleerde behandelingen en downstream-analyses van enkele celtypen niet haalbaar zijn. Om te onderzoeken of EC's dosisafhankelijk CM-celschade kunnen dempen en of deze bescherming verder kan worden geoptimaliseerd door de contactafstand tussen de twee cellijnen te variëren, gebruikten we muis primaire coronaire endotheelcellen en volwassen muis cardiomyocyten om drie soorten celkweekinzetstukken te testen die varieerden in hun intercellelijke laagafstand bij 0,5, Respectievelijk 1,0 en 2,0 mm. In CMs-only nam cellulair letsel zoals beoordeeld door lactaatdehydrogenase (LDH) afgifte significant toe tijdens hypoxie en verder na reoxygenatie wanneer de afstand 2,0 mm was in vergelijking met 0,5 en 1,0 mm. Wanneer EC's en CM's bijna direct contact hadden (0,5 mm), was er slechts een lichte demping van de reoxygenatieschade van CM's na hypoxie. Deze demping werd aanzienlijk verhoogd wanneer de ruimtelijke afstand 1,0 mm was. Met een afstand van 2,0 mm verzwakten EC's CM-letsel tijdens zowel hypoxie als hypoxie / reoxygenatie, wat aangeeft dat voldoende cultuurafstand nodig is voor EC's om te kruisverwijzingen met CM's, zodat uitgescheiden signaalmoleculen kunnen circuleren en beschermende paden volledig kunnen stimuleren. Onze bevindingen suggereren voor het eerst dat het optimaliseren van de EC / CM co-cultuur ruimtelijke omgeving noodzakelijk is om een gunstig in vitro model te bieden voor het testen van de rol van EC's in CM-bescherming tegen gesimuleerde ischemie / reperfusieletsel. Het doel van dit rapport is om onderzoekers een stapsgewijze aanpak te bieden om dit belangrijke model in hun voordeel te gebruiken.

Alle drie de soorten inserts (A, B, C) die in dit experiment worden gebruikt, hebben dezelfde poriegrootte van 0,4 μm. Het enige verschil tussen hen is de insert-to-base hoogte, waardoor afstanden tussen de twee samengekweekte cellagen respectievelijk 0,5, 1,0 en 2,0 mm kunnen zijn (figuur 3) en dat ze van verschillende leveranciers zijn (zie tabel met materialen voor details).
Om een in vitro co-kweekmodel op te zetten met afzonderlijke...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro at JoVE.com

Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

Ruimtelijke afstand is een belangrijke parameter bij het beoordelen van hypoxie / reoxygenatieletsel in een co-cultuurmodel van afzonderlijke endotheel- en cardiomyocytencellagen, wat voor het eerst suggereert dat het optimaliseren van de co-culturele ruimtelijke omgeving noodzakelijk is om een gunstig in vitro model te bieden voor het testen van de rol van endotheelcellen in cardiomyocytenbescherming.

Ontwikkeling van een celcocultuurmodel om cardiale ischemie /reperfusie in vitro na te bootsen

Ischemic heart disease is the leading cause of death and disability worldwide. Reperfusion causes additional injury beyond ischemia. Endothelial cells ...

Onze bevinding suggereert dat het optimaliseren van de endotheelcel cardiomyocyten co-cultuur ruimtelijke omgeving noodzakelijk is om een gunstig in vitro model te bieden voor het testen van de rol van endotheelcellen in cardiomyocytenbescherming tegen gesimuleerde ischemie reprofusieschade. Celcocultuurmodellen zijn uitgebreid gebruikt om de rol van cel-celinteracties op celfunctie en differentiatie te onderzoeken. Afzonderlijke behandelingen tussen celtypen en downstream-analyse van een enkel celtype zijn echter niet gemakkelijk haalbaar in de gemengde co-cultuur.De huidige studie was gericht op het creëren van twee afzonderlijke cellagen met een betekenisvolle afstand ertussen, waar men hypoxie-reprofusieschade kan induceren en het resultaat en de effecten op een enkel celtype kan bestuderen. Begin de voorbereiding door beide cellijnen te ontdooien. Verguld de cellen in T25-kolven na het wassen met verse media.Ververs de volgende dag de cellen met media en gebruik deze bij confluent. Houd de celkweekincubator op 37 graden Celsius met 21% zuurstof, 5% koolstofdioxide en 74% stikstof. Houd het bevochtigd.Schat de cardiomyocyten cellijnconfluentie onder een lichtmicroscoop. Verwijder de media uit de kolven met confluentcelculturen en trypsiniseren met drie tot vijf milliliter trypsine-EDTA per kolf. Roer de kolf voorzichtig en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende twee tot vijf minuten.Beoordeel daarna de enzymatische voortgang onder een lichtmicroscoop. Inactiveer na het losmaken de trypsine-oplossing door de trysin- of celoplossing toe te voegen aan een buis van 50 milliliter met 10 milliliter media per T25-kolf. Centrifugeer de celsuspensie gedurende twee minuten bij 120 x g om een zachte celkorrel te verkrijgen.Verwijder na het centrifugeren het supernatant en resuspend de pellet in vijf milliliter van een medium. Voer vervolgens het tellen van cellen uit en bevestig de levensvatbaarheid van de cel. Meng en aliquot van 10 microliter geresuspendeerde cellen en 10 microliter trypan blauwe kleurstof, tel vervolgens de levende cellen met behulp van een celteller.Verdun de cellen met verse reguliere media om de gewenste zaaidichtheden te bereiken. Neem een 24-well plaat voorbestemd met extracellulaire matrix en plaat cardiomyocyten bij zaaidichtheden van 300.000 per put op de bodem van de plaat. Houd de cellen 's nachts op 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.Na 24 uur worden endotheelcellen in inserts geplaatst met een optimale platingsdichtheid van 100.000 per insert. Plaats na 24 uur endotheelcelbeplating endotheelcelinzetstukken in de cardiomyocytenputten en start de co-kweek. Laat cellen 12 tot 24 uur meekleven voordat de experimenten worden uitgevoerd.Bereid de hypoxische media voor door ongeveer 25 milliliter media in een conische buis van 50 milliliter te gieten. Luchtdicht de bovenkant af met een siliconen membraan en gebruik een gesteriliseerde pipet om een gat te ponsen. Maak daarna nog een gat en laat ongeveer 2/3 van de pipetten ondergedompeld in de media.Spoel de media gedurende vijf minuten met hypoxisch gas met een stroomsnelheid van 30 liter per minuut en gooi vervolgens de media van de 24-putplaten of kweekinzetstukken met aangehechte cellen weg. Was ze heel voorzichtig met 100 microliter van 10% PBS per put voeg 500 microliter van de vers bereide hypoxische media toe aan elke put van de platen of inzetstukken. Vervang de oorspronkelijke media door verse normale media met glucose en serum in de normoxische controlegroep.Plaats een petrischaal gevuld met steriel water in de hypoxiekamer om de kamer te bevochtigen. Plaats vervolgens de platen met de hypoxische groepen in de kamer. Spoel de hypoxiekamer gedurende vijf minuten met hypoxisch gas bij een stroom van 30 liter per minuut.Plaats daarna de kamer in een couveuse bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur. Gooi na hypoxie de oude media van de platen of inserts weg en voeg 500 microliter normale media met glucose en serum toe aan elke wand van de platen en bewaar de platen vervolgens gedurende twee uur in een incubator onder normale kweekomstandigheden om reperfusie na te bootsen. Breng de celkweekmedia van de 24-well-plaat over in een 96-well-plaat, neem vervolgens 200 microliter media uit elke put van de 24-well-plaat en gelijkmatig verdeeld in vier putten van de 96-well-plaat.Meet de absorptie voor LDH met behulp van een cytotoxiciteitstestkit in een 96-well plaat en volg de instructies van de fabrikant om de mate van cellulair letsel te bepalen. In deze studie werden drie soorten inserts geëvalueerd. Alle drie de inserts hadden dezelfde poriegrootte van 0,4 micrometer.Het enige verschil tussen hen was de insert tot basishoogte, waardoor de afstanden tussen de twee samen gekweekte cellagen 0,5, 1,0 en 2,0 millimeter konden zijn. Met behulp van dit protocol werden cellen gekweekt onder normale zuurstofomstandigheden en vervolgens opgesplitst in twee groepen, een normoxische controlegroep en de hypoxiegroep. Na 24 uur werden beide groepen ververst met media en nog eens twee uur onder normale zuurstofomstandigheden gekweekt voordat de eindpunttests werden uitgevoerd.Een vergelijking van de drie soorten kweekinzetstukken bij het beoordelen van lactaatdehydrogenaseafgifte voor cardiomyocyten alleen, endotheelcellen alleen en co-cultuur van cardiomyocyten met endotheelcellen wordt hier getoond onder normoxische, hypoxie alleen en hypoxie reoxygenatie condities. Met een afstand van 0,5 millimeter tussen de cellagen leidde hypoxie tot een significant verhoogde LDH-afgifte in vergelijking met normoxie wanneer cardiomyocyten alleen werden gekweekt. De LDH was echter slechts licht verhoogd in de hypoxie-reoxygenatiegroep in vergelijking met de hypoxie-onlygroep.Wanneer endotheelcellen en cardiomyocyten samen werden gekweekt, werd de toename van LDH-afgifte onder de hypoxie-omstandigheden niet verzwakt. Dit geeft aan dat de endotheelcellen geen beschermend effect hadden in vergelijking met de cardiomyocyten alleen groep onder de hypoxie alleen voorwaarden. Endotheelcellen oefenden echter een milde maar significante bescherming uit op cardiomyocyten tijdens HR. Wanneer de afstand tussen de cellagen één millimeter was, was de LDH-afgifte ook significant verhoogd in cardiomyocyten alleen onder de hypoxie-voorwaarde.In tegenstelling tot de insert van 0,5 millimeter, werd de LDH-toename in cardiomyocyten echter alleen versterkt door HR over hypoxie-aandoeningen. Deze toename was nog meer uitgesproken met de insert van twee millimeter. De concentratie van endotheelcellen in inserts van twee millimeter werd getitreerd tot respectievelijk 25.000, 50.000 en 100.000 cellen per insert.het bleek dat toenemende endotheelcelintensiteit in de co-cultuur leidde tot een dosisafhankelijke verzwakking van LDH-afgifte veroorzaakt door HR. Een dergelijk effect werd echter niet waargenomen onder normoxische omstandigheden. Deze co-kweekmethode is niet beperkt tot endotheelcellen en cardiomyocyten. Deze methoden moeten helpen bij een onderzoek naar specifieke cel-celinteracties tussen verschillende cellijnen over meerdere organen van belang.

Research

JoVE Journal

Biology

Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Een Neuronale en astrocyte co-cultuur assay voor High Content Analysis van neurotoxiciteit

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

Een Multi-compartimenten CNS Neuron-glia Co-cultuur Microfluïdische Platform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

Endotheelcel Co-cultuur Bemiddelt Rijping van menselijke embryonale stamcellen te Pancreatic insuline producerende cellen in een Geregisseerd Differentiatie aanpak

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

Isolatie van Borst epitheelcellen van drie-dimensionale Mixed-cel Spheroid Co-cultuur

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Blastomeer Explantaten om te testen voor mobiele Fate Commitment tijdens de embryonale ontwikkeling

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

Intravitale Microscopie van de microcirculatie in de Muis cremasterspier voor de Analyse van de perifere stamcelmigratie

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Een Anoxia-verhongering Model voor ischemie / reperfusie in<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolatie en cultuur van de volwassen muis Cardiomyocytes voor mobiele Signalering en<em&gt; In vitro</em&gt; Hypertrofie

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In vitro Synthese van gemodificeerde mRNA voor inductie van eiwitexpressie in menselijke cellen

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Validatie van een muismodel voor LINC Complexen verstoren in een cel-specifieke manier

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...