Name: development of a cell co-culture model to mimic cardiac ischemia/reperfusion in vitro
Uploaded: 2021-10-13T14:00:00
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Ce travail a été soutenu, en partie, par le service de R&D du laboratoire biomédical du département des Anciens Combattants des États-Unis (I01 BX003482) et par des fonds institutionnels versés à M.L.R.

1. Préparation/placage expérimental
<ol><li>Entretenez les CM et les CE conformément aux instructions du fabricant.<ol>
<li>Décongelez les deux lignées cellulaires lorsqu’elles arrivent des fournisseurs. Plaque dans des flacons T25 après avoir été lavée avec du milieu frais. Il est recommandé d’acheter chaque milieu de culture cellulaire auprès des mêmes fournisseurs que ceux auprès desquels les cellules ont été achetées. Le lendemain, rafraîchissez les cellules avec un support et ...

<ol>
	<li>Hausenloy, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemic+conditioning+and+targeting+reperfusion+injury:+a+30+year+voyage+of+discovery.">Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery.</a> Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70 (2016).</li><li>Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+a+neglected+therapeutic+target.">Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 92-100 (2013).</li><li>Gottlieb, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+pathways+in+acute+ischemia/reperfusion+injury.">Cell death pathways in acute ischemia/reperfusion injury.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 233-238 (2011).</li><li>Colliva, A., Braga, L., Giacca, M., Zacchigna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-cardiomyocyte+crosstalk+in+heart+development+and+disease.">Endothelial cell-cardiomyocyte crosstalk in heart development and disease.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2923-2939 (2020).</li><li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cell-cell+communication+in+co-culture.">Studying cell-cell communication in co-culture.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 395-396 (2013).</li><li>Salzman, M. M., Bartos, J. A., Yannopoulos, D., Riess, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poloxamer+188+protects+isolated+adult+mouse+cardiomyocytes+from+reoxygenation+injury.">Poloxamer 188 protects isolated adult mouse cardiomyocytes from reoxygenation injury.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 8 (6), 00639 (2020).</li><li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+ischemia/reperfusion+injury.">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 298, 229-317 (2012).</li><li>Martindale, J. J., Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+of+increased+cellular+oxidative+stress+and+myocardial+ischemia+reperfusion+injury+by+directed+sarcolemma+stabilization.">Uncoupling of increased cellular oxidative stress and myocardial ischemia reperfusion injury by directed sarcolemma stabilization.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 26-37 (2014).</li><li>vander Meer, A. D., Orlova, V. V., ten Dijke, P., vanden Berg, A., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+co-cultures+of+human+endothelial+cells+and+embryonic+stem+cell-derived+pericytes+inside+a+microfluidic+device.">Three-dimensional co-cultures of human endothelial cells and embryonic stem cell-derived pericytes inside a microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 13, 3562-3568 (2013).</li><li>Bidarra, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+proliferative+modulation+of+human+mesenchymal+stem+cells+via+crosstalk+with+endothelial+cells.">Phenotypic and proliferative modulation of human mesenchymal stem cells via crosstalk with endothelial cells.</a> Stem Cell Research. 7, 186-197 (2011).</li><li>Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology.">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PloS One. 6, 25661 (2011).</li><li>Mehes, E., Mones, E., Nemeth, V., Vicsek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+motion+of+cells+mediates+segregation+and+pattern+formation+in+co-cultures.">Collective motion of cells mediates segregation and pattern formation in co-cultures.</a> PloS One. 7, 31711 (2012).</li><li>Miki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+of+co-culture+over+mono+cell+culture+in+simulating+in+vivo+environment.">The advantages of co-culture over mono cell culture in simulating in vivo environment.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 131 (3-5), 68-75 (2012).</li><li>Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-chip:+a+focus+on+compartmentalized+microdevices.">Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1211-1227 (2012).</li><li>Campbell, J., Davidenko, N., Caffarel, M., Cameron, R., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology.">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PLoS One. 6, 25661 (2011).</li><li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research.">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10, 939-956 (2010).</li></ol>

Étapes critiques du protocole Des modèles de co-culture cellulaire ont été utilisés pour étudier les mécanismes cellulaires de la cardioprotection. Comment créer deux couches distinctes avec une distance significative entre elles est donc crucial pour le développement d’un modèle de co-culture approprié. Un défi dans l’étude de la lésion simulée IR, c’est-à-dire HR, est que non seulement l’ischémie (hypoxie) elle-même, mais aussi la reperfusion (réoxygénation) aggravent le ...

Les cardiopathies ischémiques sont la principale cause de décès et d’invalidité dans le monde 1,2. Cependant, le processus de traitement de la reperfusion peut lui-même provoquer la mort des cardiomyocytes, connue sous le nom de lésion d’ischémie / reperfusion myocardique (IR), pour laquelle il n’existe toujours pas de remède efficace3. Les cellules endothéliales (CE) ont été suggérées pour protéger les cardiomyocytes (CM) par la sécrétion de signaux paracrines, ainsi que par des interactions de cellule à cellule4.
Les modèles de co-culture cellulaire ont été largement utilisés pour étudier le rôle des interactions cellule-cellule autocrine et/ou paracrine sur la fonction et la différenciation cellulaires. Parmi les modèles de co-culture, la co-culture mixte est la plus simple, où deux types différents de cellules sont en contact direct dans un seul compartiment de culture à un rapport cellulaire souhaité5. Cependant, des traitements distincts entre les types de cellules et l’analyse en aval d’un seul type de cellule ne sont pas facilement réalisables compte tenu de la population mixte.
Des études antérieures ont indiqué que les insultes hypoxiques et ischémiques causent des dommages importants à l’intégrité de la membrane cellulaire mesurée par la libération de lactate déshydrogénase (LDH). Cette blessure est aggravée lors de la réoxygénation, imitant la lésion de reperfusion 6,7,8. L’objectif du protocole actuel était de tester les hypothèses selon lesquelles la présence d’EC peut atténuer en fonction de la dose les fuites de membrane cellulaire des CM causées par l’hypoxie et la réoxygénation (HR) et que l’effet protecteur des CE peut être optimisé en faisant varier la distance de contact entre les deux lignées cellulaires. Ainsi, nous avons utilisé trois types d’inserts de culture cellulaire et des cellules endothéliales de l’artère coronaire primaire de souris et des cardiomyocytes de souris adultes. Les inserts, marqués par Corning, Merck Millipore et Greiner Bio-One, nous ont permis de créer trois conditions de diaphonie de culture cellulaire différentes avec des distances intercellulaires de 0,5, 1,0 et 2,0 mm, respectivement. 100 000 CE ont été plaqués par insert dans chaque cas.
De plus, afin de déterminer si la densité des CE en co-culture contribue à l’atténuation des lésions HR dans ce modèle, nous avons étudié la relation dose-réponse entre la concentration d’EC et la libération de LDH par les CM. Les EC ont été plaqués à 25 000, 50 000 et 100 000 par insert, respectivement, dans l’insert de 2,0 mm.
Le présent rapport offre aux enquêteurs une approche étape par étape pour qu’ils utilisent cet important modèle à leur avantage.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)</td>
			<td >Celprogen Inc</td>
			<td >11041-14</td>
			<td >Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Automated Cell Counter Countess II</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A27977</td>
			<td>Cell counting for calculating cell numbers</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bio-Safety Cabinet</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU425400</td>
			<td>Cell culture sterile hood</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6916</td>
			<td>Used for cell freezing for long term cell line storage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>Nu-5500</td>
			<td>To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37&#176;C, humidified)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Incubator Gas Tank</td>
			<td>A-L Compressed Gases</td>
			<td>UN1013</td>
			<td>Gas needed for cell culture incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts A (0.5 mm)</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>353095</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts B (1.0 mm)</td>
			<td>Millicell Millipore</td>
			<td>PIHP01250</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts C (2.0 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662640</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td>Anstel Enterprises Inc</td>
			<td>4235</td>
			<td>For cell culture plating and passaging</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Flasks T25</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>E11041-14</td>
			<td>Used for CMs regular culture, coated by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Medium Complete</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14S</td>
			<td>CMs culture complete medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14PN</td>
			<td>CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Plates 96 well</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>E11041-14-96well</td>
			<td>Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Hypoxia Cell Culture Medium</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14GFPN</td>
			<td>CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Countess cell counting chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Counting slides used for cell counter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cyquant LDH Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>C20301</td>
			<td>LDH measurement kit</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Flasks T25</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>FB012935</td>
			<td>Used for ECs regular culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Medium Complete</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>M1168</td>
			<td>ECs culture complete medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>M1168PF</td>
			<td>ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Plates 96 well</td>
			<td>Fisher Scientific (Costar)</td>
			<td>3370</td>
			<td>Used for experiments of LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6950</td>
			<td>Used for coating flasks and plates for ECs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Hypoxia Cell Culture Medium</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>GPF1168</td>
			<td>ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35011CV</td>
			<td>FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxia Chamber</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td>To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxia Chamber Flow Meter</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27311</td>
			<td>To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)</td>
			<td>A-L Compressed Gases</td>
			<td>UN1956</td>
			<td>Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TMS</td>
			<td>To observe cell condition</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>C57-6093</td>
			<td>Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NUNC 15ML CONICL Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565269</td>
			<td>For cell culture process, experiments, solution preparation etc.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NUNC 50ML CONICL Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565271</td>
			<td>For cell culture process, experiments, solution preparation etc.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>Used for cell washing during culture or experiments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plate Reader</td>
			<td>BioTek Instrument</td>
			<td>11120533</td>
			<td>Colorimetric or fluorometric plate reading</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reaction 96 Well Palte (clear no lid)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565226</td>
			<td>Used for LDH measurement plate reading</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA for CMs</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>T1509-014</td>
			<td>1 x sterile filtered and tissue culture tested</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA for ECs</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6914/0619</td>
			<td>0.25%, cell cuture-tested</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a cell co-culture model to mimic cardiac ischemia/reperfusion in vitro

Les cardiopathies ischémiques sont la principale cause de décès et d’invalidité dans le monde. La reperfusion provoque des blessures supplémentaires au-delà de l’ischémie. Les cellules endothéliales (CE) peuvent protéger les cardiomyocytes (CM) contre les lésions de reperfusion par le biais d’interactions cellule-cellule. Les co-cultures peuvent aider à étudier le rôle des interactions cellule-cellule. Une co-culture mixte est l’approche la plus simple, mais elle est limitée car les traitements isolés et les analyses en aval de types de cellules uniques ne sont pas réalisables. Pour déterminer si les CE peuvent atténuer les dommages aux cellules CM en fonction de la dose et si cette protection peut être encore optimisée en faisant varier la distance de contact entre les deux lignées cellulaires, nous avons utilisé des cellules endothéliales de l’artère coronaire primaire de souris et des cardiomyocytes de souris adultes pour tester trois types d’inserts de culture cellulaire qui variaient dans leur distance de couche intercellulaire à 0,5, 1,0 et 2,0 mm, respectivement. Dans les CM seulement, les lésions cellulaires évaluées par la libération de lactate déshydrogénase (LDH) ont augmenté de manière significative pendant l’hypoxie et plus loin lors de la réoxygénation lorsque la distance était de 2,0 mm par rapport à 0,5 et 1,0 mm. Lorsque les EC et les CM étaient en contact presque direct (0,5 mm), il n’y avait qu’une légère atténuation de la lésion de réoxygénation des CM après une hypoxie. Cette atténuation a été considérablement augmentée lorsque la distance spatiale était de 1,0 mm. Avec une distance de 2,0 mm, les CE atténuaient les lésions cm pendant l’hypoxie et l’hypoxie/réoxygénation, ce qui indique qu’une distance de culture suffisante est nécessaire pour que les CE puissent communiquer avec les CM, afin que les molécules de signal sécrétées puissent circuler et stimuler pleinement les voies protectrices. Nos résultats suggèrent, pour la première fois, que l’optimisation de l’environnement spatial de co-culture EC/CM est nécessaire pour fournir un modèle in vitro favorable pour tester le rôle des CE dans la protection contre la CM contre les lésions simulées d’ischémie / reperfusion. L’objectif de ce rapport est de fournir une approche étape par étape permettant aux enquêteurs d’utiliser cet important modèle à leur avantage.

Les trois types d’inserts (A, B, C) utilisés dans cette expérience ont la même taille de pores de 0,4 μm. La seule différence entre eux est la hauteur de l’insert à la base, qui permet aux distances entre les deux couches cellulaires co-cultivées d’être de 0,5, 1,0 et 2,0 mm, respectivement, (Figure 3) et qu’elles proviennent de fournisseurs différents (pour plus de détails, voir tableau des matériaux).
Pour établir un modèle ...

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Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

La distance spatiale est un paramètre clé dans l’évaluation des lésions d’hypoxie / réoxygénation dans un modèle de co-culture de couches cellulaires endothéliales et cardiomyocytaires séparées, suggérant, pour la première fois, que l’optimisation de l’environnement spatial de co-culture est nécessaire pour fournir un modèle in vitro favorable pour tester le rôle des cellules endothéliales dans la protection des cardiomyocytes.

Développement d’un modèle de co-culture cellulaire pour imiter l’ischémie cardiaque / reperfusion in vitro

Ischemic heart disease is the leading cause of death and disability worldwide. Reperfusion causes additional injury beyond ischemia. Endothelial cells ...

Notre découverte suggère que l’optimisation de l’environnement spatial de co-culture de cardiomyocytes des cellules endothéliales est nécessaire pour fournir un modèle in vitro favorable pour tester le rôle des cellules endothéliales dans la protection des cardiomyocytes contre les lésions simulées de reprofusion d’ischémie. Les modèles de co-culture cellulaire ont été largement utilisés pour étudier le rôle des interactions cellule-cellule sur la fonction et la différenciation cellulaires. Cependant, des traitements distincts entre les types de cellules et l’analyse en aval d’un seul type de cellule ne sont pas facilement réalisables dans la co-culture mixte.L’étude actuelle visait à créer deux couches cellulaires distinctes avec une distance significative entre elles où l’on peut induire une lésion de reprofusion d’hypoxie et étudier le résultat et les effets sur un seul type de cellule. Commencez la préparation en décongelant les deux lignées cellulaires. Plaquer les cellules dans des flacons de T25 après les avoir lavées avec des milieux frais.Le lendemain, rafraîchissez les cellules avec un support et utilisez-les lorsqu’elles sont confluentes. Maintenez l’incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius avec 21% d’oxygène, 5% de dioxyde de carbone et 74% d’azote. Gardez-le humidifié.Estimer la confluence de la lignée cellulaire des cardiomyocytes au microscope optique. Retirer le milieu des flacons contenant des cultures cellulaires confluentes et essayer avec trois à cinq millilitres de trypsine-EDTA par flacon. Agiter doucement la fiole et incuber à 37 degrés Celsius pendant deux à cinq minutes.Après cela, évaluez les progrès enzymatiques au microscope optique. Après le détachement, inactiver la solution de trypsine en ajoutant la trysine ou la solution cellulaire dans un tube de 50 millilitres contenant 10 millilitres de milieu par fiole T25. Centrifuger la suspension de la cellule à 120 x g pendant deux minutes pour obtenir une pastille de cellule molle.Après centrifugation, retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans cinq millilitres d’un support. Ensuite, effectuez le comptage des cellules et confirmez la viabilité des cellules. Mélanger et aliquoter 10 microlitres de cellules remises en suspension et 10 microlitres de colorant bleu trypan, puis compter les cellules vivantes à l’aide d’un compteur de cellules.Diluer les cellules avec des milieux frais réguliers pour obtenir les densités d’ensemencement souhaitées. Prenez une plaque de 24 puits pré-enrobée avec une matrice extracellulaire et des cardiomyocytes de plaque à des densités d’ensemencement de 300 000 par puits sur le fond de la plaque. Maintenez les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant la nuit.Après 24 heures, plaquer les cellules endothéliales dans des inserts à une densité de placage optimale de 100 000 par insert. Après 24 heures de placage de cellules endothéliales, placez des inserts de cellules endothéliales à l’intérieur des puits de cardiomyocytes et initiez la co-culture. Permettre aux cellules de co-cultiver pendant 12 à 24 heures avant d’effectuer les expériences.Préparez le milieu hypoxique en versant environ 25 millilitres de milieu dans un tube conique de 50 millilitres. Scellez le dessus à l’air avec une membrane en silicone et utilisez une pipette stérilisée pour percer un trou. Après cela, créez un autre trou et laissez environ 2/3 des pipettes immergées dans le média.Rincez le milieu avec du gaz hypoxique pendant cinq minutes à un débit de 30 litres par minute, puis jetez le milieu des plaques de 24 puits ou des inserts de culture contenant des cellules attachées. Lavez-les très doucement avec 100 microlitres de 10% PBS par puits, ajoutez 500 microlitres de milieux hypoxiques fraîchement préparés à chaque puits des plaques ou des inserts. Remplacer le milieu d’origine par un milieu normal frais contenant du glucose et du sérum dans le groupe témoin normoxique.Placez une boîte de Petri remplie d’eau stérile dans la chambre d’hypoxie pour humidifier la chambre. Placez ensuite les plaques contenant les groupes hypoxiques dans la chambre. Rincez la chambre d’hypoxie avec du gaz hypoxique pendant cinq minutes à un débit de 30 litres par minute.Après cela, placez la chambre à l’intérieur d’un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Après l’hypoxie, jetez les anciens milieux des plaques ou des inserts et ajoutez 500 microlitres de milieux normaux contenant du glucose et du sérum à chaque paroi des plaques, puis stockez les plaques à l’intérieur d’un incubateur dans des conditions de culture normales pendant deux heures pour imiter la reperfusion. Transférer le milieu de culture cellulaire de la plaque de 24 puits dans une plaque de 96 puits, puis prélever 200 microlitres de milieu de chaque puits de la plaque de 24 puits et répartir également dans quatre puits de la plaque de 96 puits.Mesurez l’absorbance de la LDH à l’aide d’un kit de dosage de cytotoxicité dans une plaque de 96 puits et suivez les instructions du fabricant pour déterminer le degré de lésion cellulaire. Dans cette étude, trois types d’inserts ont été évalués. Les trois inserts avaient la même taille de pores de 0,4 micromètre.La seule différence entre eux était l’insert à la hauteur de la base, permettant aux distances entre les deux couches cellulaires co-cultivées d’être de 0,5, 1,0 et 2,0 millimètres. En utilisant ce protocole, les cellules ont été cultivées dans des conditions normales d’oxygène, puis divisées en deux groupes, un groupe témoin normoxique et le groupe hypoxie. Après 24 heures, les deux groupes ont été rafraîchis avec un milieu et cultivés dans des conditions normales d’oxygène pendant deux autres heures avant d’effectuer les tests d’évaluation.Une comparaison des trois types d’inserts de culture dans l’évaluation de la libération de lactate déshydrogénase pour les cardiomyocytes seuls, les cellules endothéliales seules et la co-culture de cardiomyocytes avec des cellules endothéliales est présentée ici dans des conditions de réoxygénation normoxique, hypoxie uniquement et hypoxie. Avec une distance de 0,5 millimètre entre les couches cellulaires, l’hypoxie a entraîné une augmentation significative de la libération de LDH par rapport à la normoxie lorsque les cardiomyocytes étaient cultivés seuls. Cependant, la LDH n’a été que légèrement augmentée dans le groupe de réoxygénation de l’hypoxie par rapport au groupe d’hypoxie uniquement.Lorsque les cellules endothéliales et les cardiomyocytes ont été co-cultivés ensemble, l’augmentation de la libération de LDH dans les seules conditions d’hypoxie n’a pas été atténuée. Cela indique que les cellules endothéliales n’ont eu aucun effet protecteur par rapport au groupe des cardiomyocytes seuls dans les conditions d’hypoxie uniquement. Cependant, les cellules endothéliales ont exercé une protection légère mais significative sur les cardiomyocytes pendant la HR. Lorsque la distance entre les couches cellulaires était d’un millimètre, la libération de LDH était également significativement augmentée dans les cardiomyocytes uniquement dans la condition d’hypoxie.Cependant, contrairement à l’insert de 0,5 millimètre, l’augmentation de la LDH dans les cardiomyocytes seulement a été potentialisée par HR sur les conditions d’hypoxie seulement. Cette augmentation était encore plus prononcée avec l’insert de deux millimètres. La concentration de cellules endothéliales plaquées dans des inserts de deux millimètres a été titrée à 25 000, 50 000 et 100 000 cellules par insert, respectivement.il a été constaté que l’augmentation de l’intensité des cellules endothéliales dans la co-culture entraînait une atténuation dose-dépendante de la libération de LDH causée par hr. Cependant, aucun effet de ce type n’a été observé dans des conditions normoxiques. Cette méthodologie de co-culture ne se limite pas aux cellules endothéliales et aux cardiomyocytes. Ces méthodes devraient aider à étudier les interactions cellulaires spécifiques entre des lignées cellulaires variées dans plusieurs organes d’intérêt.

Research

JoVE Journal

Biology

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