Name: development of a cell co-culture model to mimic cardiac ischemia/reperfusion in vitro
Uploaded: 2021-10-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro at JoVE.com

Diese Arbeit wurde zum Teil vom US Department of Veterans Affairs Biomedical Laboratory R&D Service (I01 BX003482) und von institutionellen Mitteln an M.L.R.

1. Versuchsvorbereitung/-beschichtung
<ol><li>Pflegen Sie CMs und ECs gemäß den Anweisungen des Herstellers.<ol>
<li>Tauen Sie beide Zelllinien auf, wenn sie von Lieferanten ankommen. Platte in T25-Kolben nach dem Waschen mit frischen Medien. Es wird empfohlen, jedes Zellkulturmedium von den gleichen Anbietern zu kaufen, von denen die Zellen gekauft wurden. Erfrischen Sie am nächsten Tag die Zellen mit Medien und verwenden Sie sie, wenn sie zusammenfließen.</li>
		<li>Halten Sie den Zellkultur-Inku...

<ol>
	<li>Hausenloy, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemic+conditioning+and+targeting+reperfusion+injury:+a+30+year+voyage+of+discovery.">Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery.</a> Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70 (2016).</li><li>Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+a+neglected+therapeutic+target.">Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 92-100 (2013).</li><li>Gottlieb, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+pathways+in+acute+ischemia/reperfusion+injury.">Cell death pathways in acute ischemia/reperfusion injury.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 233-238 (2011).</li><li>Colliva, A., Braga, L., Giacca, M., Zacchigna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-cardiomyocyte+crosstalk+in+heart+development+and+disease.">Endothelial cell-cardiomyocyte crosstalk in heart development and disease.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2923-2939 (2020).</li><li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cell-cell+communication+in+co-culture.">Studying cell-cell communication in co-culture.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 395-396 (2013).</li><li>Salzman, M. M., Bartos, J. A., Yannopoulos, D., Riess, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poloxamer+188+protects+isolated+adult+mouse+cardiomyocytes+from+reoxygenation+injury.">Poloxamer 188 protects isolated adult mouse cardiomyocytes from reoxygenation injury.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 8 (6), 00639 (2020).</li><li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+ischemia/reperfusion+injury.">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 298, 229-317 (2012).</li><li>Martindale, J. J., Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+of+increased+cellular+oxidative+stress+and+myocardial+ischemia+reperfusion+injury+by+directed+sarcolemma+stabilization.">Uncoupling of increased cellular oxidative stress and myocardial ischemia reperfusion injury by directed sarcolemma stabilization.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 26-37 (2014).</li><li>vander Meer, A. D., Orlova, V. V., ten Dijke, P., vanden Berg, A., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+co-cultures+of+human+endothelial+cells+and+embryonic+stem+cell-derived+pericytes+inside+a+microfluidic+device.">Three-dimensional co-cultures of human endothelial cells and embryonic stem cell-derived pericytes inside a microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 13, 3562-3568 (2013).</li><li>Bidarra, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+proliferative+modulation+of+human+mesenchymal+stem+cells+via+crosstalk+with+endothelial+cells.">Phenotypic and proliferative modulation of human mesenchymal stem cells via crosstalk with endothelial cells.</a> Stem Cell Research. 7, 186-197 (2011).</li><li>Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology.">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PloS One. 6, 25661 (2011).</li><li>Mehes, E., Mones, E., Nemeth, V., Vicsek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+motion+of+cells+mediates+segregation+and+pattern+formation+in+co-cultures.">Collective motion of cells mediates segregation and pattern formation in co-cultures.</a> PloS One. 7, 31711 (2012).</li><li>Miki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+of+co-culture+over+mono+cell+culture+in+simulating+in+vivo+environment.">The advantages of co-culture over mono cell culture in simulating in vivo environment.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 131 (3-5), 68-75 (2012).</li><li>Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-chip:+a+focus+on+compartmentalized+microdevices.">Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1211-1227 (2012).</li><li>Campbell, J., Davidenko, N., Caffarel, M., Cameron, R., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology.">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PLoS One. 6, 25661 (2011).</li><li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research.">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10, 939-956 (2010).</li></ol>

Kritische Schritte im Protokoll Zellkokulturmodelle wurden verwendet, um zelluläre Mechanismen der Kardioprotektion zu untersuchen. Wie man zwei getrennte Schichten mit einem sinnvollen Abstand zwischen ihnen schafft, ist daher entscheidend für die Entwicklung eines geeigneten Co-Kultur-Modells. Eine Herausforderung bei der Untersuchung simulierter IR-, d.h. HR-Verletzungen besteht darin, dass nicht nur Ischämie (Hypoxie) selbst, sondern auch Reperfusion (Reoxygenierung) die zelluläre Dysfunktion ...

Die ischämische Herzkrankheit ist weltweit die häufigste Ursache für Tod und Behinderung 1,2. Der Behandlungsprozess der Reperfusion kann jedoch selbst zum Tod des Kardiomyozyten führen, der als Myokardischämie / Reperfusionsverletzung (IR) bekannt ist und für die es immer noch kein wirksames Mittel gibt3. Es wurde vorgeschlagen, dass Endothelzellen (ECs) Kardiomyozyten (CMs) durch die Sekretion parakriner Signale sowie Zell-zu-Zell-Interaktionenschützen 4.
Zell-Co-Kultur-Modelle wurden ausgiebig verwendet, um die Rolle autokriner und / oder parakriner Zell-Zell-Interaktionen auf die Zellfunktion und -differenzierung zu untersuchen. Unter den Kokulturmodellen ist die gemischte Kokultur die einfachste, bei der zwei verschiedene Zelltypen in direktem Kontakt innerhalb eines einzigen Kulturkompartiments mit einem gewünschten Zellverhältnisstehen 5. Getrennte Behandlungen zwischen Zelltypen und nachgelagerte Analysen eines einzelnen Zelltyps sind jedoch angesichts der gemischten Population nicht ohne weiteres durchführbar.
Frühere Studien zeigten, dass hypoxische und ischämische Beleidigungen die Integrität der Zellmembran signifikant schädigen, gemessen an der Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH). Diese Verletzung wird bei der Reoxygenierung verschlimmert und ahmt die Reperfusionsverletzung 6,7,8 nach. Ziel des aktuellen Protokolls war es, die Hypothesen zu testen, dass das Vorhandensein von ECs dosisabhängig das durch Hypoxie und Reoxygenierung (HR) verursachte Zellmembranleckage von CMs abschwächen kann und dass die Schutzwirkung von ECs durch Variation des Kontaktabstands zwischen den beiden Zelllinien optimiert werden kann. Daher verwendeten wir drei Arten von Zellkultureinsätzen und Maus-Primär-Koronararterien-Endothelzellen und adulte Maus-Kardiomyozyten. Die von Corning, Merck Millipore und Greiner Bio-One gebrandeten Einsätze ermöglichten es uns, drei verschiedene Zellkultur-Übersprechbedingungen mit Abständen zwischen den Zelllinien von 0,5, 1,0 bzw. 2,0 mm zu erzeugen. Pro Einsatz wurden jeweils 100.000 ECs plattiert.
Um festzustellen, ob die Dichte von ECs in der Kokultur in diesem Modell zur Dämpfung von HR-Verletzungen beiträgt, untersuchten wir außerdem die Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen der EC-Konzentration und der LDH-Freisetzung durch CMs. ECs wurden mit 25.000, 50.000 bzw. 100.000 pro Einsatz im 2,0-mm-Einsatz plattiert.
Dieser Bericht bietet einen schrittweisen Ansatz für Ermittler, um dieses wichtige Modell zu ihrem Vorteil zu nutzen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)</td>
			<td >Celprogen Inc</td>
			<td >11041-14</td>
			<td >Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Automated Cell Counter Countess II</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A27977</td>
			<td>Cell counting for calculating cell numbers</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bio-Safety Cabinet</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU425400</td>
			<td>Cell culture sterile hood</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6916</td>
			<td>Used for cell freezing for long term cell line storage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>Nu-5500</td>
			<td>To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37&#176;C, humidified)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Incubator Gas Tank</td>
			<td>A-L Compressed Gases</td>
			<td>UN1013</td>
			<td>Gas needed for cell culture incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts A (0.5 mm)</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>353095</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts B (1.0 mm)</td>
			<td>Millicell Millipore</td>
			<td>PIHP01250</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts C (2.0 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662640</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td>Anstel Enterprises Inc</td>
			<td>4235</td>
			<td>For cell culture plating and passaging</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Flasks T25</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>E11041-14</td>
			<td>Used for CMs regular culture, coated by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Medium Complete</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14S</td>
			<td>CMs culture complete medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14PN</td>
			<td>CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Plates 96 well</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>E11041-14-96well</td>
			<td>Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Hypoxia Cell Culture Medium</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14GFPN</td>
			<td>CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Countess cell counting chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Counting slides used for cell counter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cyquant LDH Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>C20301</td>
			<td>LDH measurement kit</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Flasks T25</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>FB012935</td>
			<td>Used for ECs regular culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Medium Complete</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>M1168</td>
			<td>ECs culture complete medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>M1168PF</td>
			<td>ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Plates 96 well</td>
			<td>Fisher Scientific (Costar)</td>
			<td>3370</td>
			<td>Used for experiments of LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6950</td>
			<td>Used for coating flasks and plates for ECs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Hypoxia Cell Culture Medium</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>GPF1168</td>
			<td>ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35011CV</td>
			<td>FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxia Chamber</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td>To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxia Chamber Flow Meter</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27311</td>
			<td>To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)</td>
			<td>A-L Compressed Gases</td>
			<td>UN1956</td>
			<td>Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TMS</td>
			<td>To observe cell condition</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>C57-6093</td>
			<td>Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NUNC 15ML CONICL Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565269</td>
			<td>For cell culture process, experiments, solution preparation etc.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NUNC 50ML CONICL Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565271</td>
			<td>For cell culture process, experiments, solution preparation etc.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>Used for cell washing during culture or experiments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plate Reader</td>
			<td>BioTek Instrument</td>
			<td>11120533</td>
			<td>Colorimetric or fluorometric plate reading</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reaction 96 Well Palte (clear no lid)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565226</td>
			<td>Used for LDH measurement plate reading</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA for CMs</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>T1509-014</td>
			<td>1 x sterile filtered and tissue culture tested</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA for ECs</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6914/0619</td>
			<td>0.25%, cell cuture-tested</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a cell co-culture model to mimic cardiac ischemia/reperfusion in vitro

Die ischämische Herzkrankheit ist weltweit die häufigste Ursache für Tod und Behinderung. Reperfusion verursacht zusätzliche Verletzungen über die Ischämie hinaus. Endothelzellen (ECs) können Kardiomyozyten (CMs) durch Zell-Zell-Interaktionen vor Reperfusionsverletzungen schützen. Kokulturen können helfen, die Rolle von Zell-Zell-Interaktionen zu untersuchen. Eine gemischte Kokultur ist der einfachste Ansatz, aber begrenzt, da isolierte Behandlungen und nachgelagerte Analysen einzelner Zelltypen nicht möglich sind. Um zu untersuchen, ob ECs dosisabhängig CM-Zellschäden abschwächen können und ob dieser Schutz durch Variation des Kontaktabstands zwischen den beiden Zelllinien weiter optimiert werden kann, haben wir Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells und Adult Mouse Cardiomyocytes verwendet, um drei Arten von Zellkultureinsätzen zu testen, die in ihrem Abstand zwischen den Zellschichten bei 0,5 variierten. 1,0 bzw. 2,0 mm. Nur bei CMs nahm die Zellschädigung, wie sie durch die Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH) beurteilt wurde, während der Hypoxie und weiter bei der Reoxygenierung signifikant zu, wenn der Abstand 2,0 mm im Vergleich zu 0,5 und 1,0 mm betrug. Wenn ECs und CMs in nahezu direktem Kontakt standen (0,5 mm), gab es nur eine leichte Abschwächung der Reoxygenierungsverletzung von CMs nach Hypoxie. Diese Dämpfung war signifikant erhöht, wenn der räumliche Abstand 1,0 mm betrug. Mit einem Abstand von 2,0 mm schwächten ECs die CM-Verletzung sowohl während der Hypoxie als auch der Hypoxie/Reoxygenierung ab, was darauf hindeutet, dass eine ausreichende Kulturdistanzierung notwendig ist, damit ECs mit CMs übersprechen können, so dass sezernierte Signalmoleküle zirkulieren und Schutzwege vollständig stimulieren können. Unsere Ergebnisse deuten zum ersten Mal darauf hin, dass die Optimierung der räumlichen Umgebung der EC/CM-Kokultur notwendig ist, um ein günstiges In-vitro-Modell für die Prüfung der Rolle von ECs beim CM-Schutz gegen simulierte Ischämie/Reperfusionsverletzung bereitzustellen. Ziel dieses Berichts ist es, den Ermittlern einen schrittweisen Ansatz zu bieten, um dieses wichtige Modell zu ihrem Vorteil zu nutzen.

Alle drei Arten von Einsätzen (A, B, C), die in diesem Experiment verwendet wurden, haben die gleiche Porengröße von 0,4 μm. Der einzige Unterschied zwischen ihnen ist die Insert-to-Base-Höhe, die es ermöglicht, dass die Abstände zwischen den beiden kokultivierten Zellschichten 0,5, 1,0 bzw. 2,0 mm betragen (Abbildung 3) und dass sie von verschiedenen Anbietern stammen (Details siehe Materialtabelle).
Um ein In-vitro-Co-Kulturmodell mit sep...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro at JoVE.com

Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

Die räumliche Entfernung ist ein Schlüsselparameter bei der Beurteilung von Hypoxie- / Reoxygenierungsverletzungen in einem Kokulturmodell separater Endothel- und Kardiomyozytenzellschichten, was zum ersten Mal darauf hindeutet, dass die Optimierung der räumlichen Umgebung der Kokultur notwendig ist, um ein günstiges In-vitro-Modell für die Prüfung der Rolle von Endothelzellen beim Schutz von Kardiomyozyten bereitzustellen.

Entwicklung eines Zell-Co-Kultur-Modells zur Nachahmung von kardialer Ischämie/Reperfusion in vitro

Ischemic heart disease is the leading cause of death and disability worldwide. Reperfusion causes additional injury beyond ischemia. Endothelial cells ...

Unser Ergebnis legt nahe, dass die Optimierung der räumlichen Umgebung der Endothelzell-Kardiomyozyten-Kokultur notwendig ist, um ein günstiges In-vitro-Modell für die Untersuchung der Rolle von Endothelzellen beim Kardiomyozytenschutz gegen simulierte Ischämie-Reproduktionsverletzungen bereitzustellen. Zell-Kokultur-Modelle wurden ausgiebig verwendet, um die Rolle von Zell-Zell-Interaktionen auf die Zellfunktion und -differenzierung zu untersuchen. Getrennte Behandlungen zwischen Zelltypen und nachgelagerte Analysen eines einzelnen Zelltyps sind in der gemischten Kokultur jedoch nicht ohne weiteres durchführbar.Die aktuelle Studie zielte darauf ab, zwei separate Zellschichten mit einem signifikanten Abstand zwischen ihnen zu schaffen, wo man eine Hypoxie-Reproduktionsverletzung induzieren und das Ergebnis und die Auswirkungen auf einen einzelnen Zelltyp untersuchen kann. Beginnen Sie die Vorbereitung, indem Sie beide Zelllinien auftauen. Beschichten Sie die Zellen in T25-Kolben, nachdem Sie sie mit frischen Medien gewaschen haben.Erfrischen Sie am nächsten Tag die Zellen mit Medien und verwenden Sie sie, wenn sie konfluent sind. Halten Sie den Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 21% Sauerstoff, 5% Kohlendioxid und 74% Stickstoff. Halten Sie es befeuchtet.Schätzen Sie den Zusammenfluss der Kardiomyozytenzelllinie unter einem Lichtmikroskop. Entfernen Sie das Medium aus den Kolben, die konfluierende Zellkulturen enthalten, und trypsinisieren Sie mit drei bis fünf Millilitern Trypsin-EDTA pro Kolben. Den Kolben vorsichtig rühren und bei 37 Grad Celsius zwei bis fünf Minuten inkubieren.Danach beurteilen Sie den enzymatischen Fortschritt unter einem Lichtmikroskop. Nach dem Ablösen die Trypsinlösung inaktivieren, indem das Trysin oder die Zelllösung in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern Medien pro T25-Kolben gegeben wird. Zentrifen Sie die Zellsuspension bei 120 x g für zwei Minuten, um ein weiches Zellpellet zu erhalten.Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern eines Mediums. Führen Sie als Nächstes die Zellzählung durch und bestätigen Sie die Zelllebensfähigkeit. Mischen und aliquot von 10 Mikrolitern resuspendierten Zellen und 10 Mikrolitern trypanblauem Farbstoff, dann zählen Sie die lebenden Zellen mit einem Zellzähler.Verdünnen Sie die Zellen mit frischen regulären Medien, um die gewünschten Aussaatdichten zu erreichen. Nehmen Sie eine 24-Well-Platte vorbeschichtet mit extrazellulärer Matrix und Plattenkardiomyozyten bei Aussaatdichten von 300.000 pro Vertiefung auf den Boden der Platte. Halten Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid über Nacht.Nach 24 Stunden werden Endothelzellen mit einer optimalen Beschichtungsdichte von 100.000 pro Einsatz in Einsätze gesteckt. Platzieren Sie nach 24 Stunden Endothelzellplattierung Endothelzelleinsätze in den Kardiomyozytenvertiefungen und initiieren Sie die Kokultur. Lassen Sie die Zellen 12 bis 24 Stunden lang kokultivieren, bevor Sie die Experimente durchführen.Bereiten Sie die hypoxischen Medien vor, indem Sie etwa 25 Milliliter Medien in ein konisches 50-Milliliter-Rohr gießen. Versiegeln Sie die Oberseite mit einer Silikonmembran und verwenden Sie eine sterilisierte Pipette, um ein Loch zu stanzen. Danach erzeugen Sie ein weiteres Loch und lassen Sie etwa 2/3 der Pipetten in das Medium eingetaucht.Spülen Sie das Medium fünf Minuten lang mit hypoxischem Gas bei einer Durchflussrate von 30 Litern pro Minute und entsorgen Sie dann die Medien der 24-Well-Platten oder Kultureinsätze, die angeschlossene Zellen enthalten. Waschen Sie sie sehr vorsichtig mit 100 Mikrolitern von 10% PBS pro Well, fügen Sie 500 Mikroliter der frisch zubereiteten hypoxischen Medien zu jeder Vertiefung der Platten oder Einsätze hinzu. Ersetzen Sie das Originalmedium durch frische, normale Medien, die Glukose und Serum in der normoxischen Kontrollgruppe enthalten.Legen Sie eine mit sterilem Wasser gefüllte Petrischale in die Hypoxiekammer, um die Kammer zu befeuchten. Legen Sie dann die Platten mit den hypoxischen Gruppen in die Kammer. Spülen Sie die Hypoxiekammer fünf Minuten lang mit hypoxischem Gas bei einem Durchfluss von 30 Litern pro Minute.Danach stellen Sie die Kammer für 24 Stunden in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Nach der Hypoxie entsorgen Sie das alte Medium der Platten oder Einsätze und fügen Sie 500 Mikroliter normaler Medien hinzu, die Glukose und Serum enthalten, zu jeder Wand der Platten, dann lagern Sie die Platten in einem Inkubator unter normalen Kulturbedingungen für zwei Stunden, um die Reperfusion nachzuahmen. Übertragen Sie die Zellkulturmedien von der 24-Well-Platte in eine 96-Well-Platte, nehmen Sie dann 200 Mikroliter Medien aus jeder Vertiefung der 24-Well-Platte und verteilen Sie sie gleichmäßig auf vier Wells der 96-Well-Platte.Messen Sie die Absorption für LDH mit einem Zytotoxizitäts-Assay-Kit in einer 96-Well-Platte und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um den Grad der Zellverletzung zu bestimmen. In dieser Studie wurden drei Arten von Einsätzen evaluiert. Alle drei Einsätze hatten die gleiche Porengröße von 0,4 Mikrometern.Der einzige Unterschied zwischen ihnen war der Einsatz zur Basishöhe, so dass die Abstände zwischen den beiden kokultivierten Zellschichten 0,5, 1,0 und 2,0 Millimeter betragen konnten. Unter Verwendung dieses Protokolls wurden die Zellen unter normalen Sauerstoffbedingungen kultiviert und dann in zwei Gruppen aufgeteilt, eine normoxische Kontrollgruppe und die Hypoxiegruppe. Nach 24 Stunden wurden beide Gruppen mit Medien aufgefrischt und unter normalen Sauerstoffbedingungen für weitere zwei Stunden kultiviert, bevor die Endpunktassays durchgeführt wurden.Ein Vergleich der drei Arten von Kultureinsätzen bei der Beurteilung der Laktatdehydrogenasefreisetzung für Kardiomyozyten allein, Endothelzellen allein und Kokultur von Kardiomyozyten mit Endothelzellen wird hier unter normoxischen, nur Hypoxie- und Hypoxie-Reoxygenierungsbedingungen gezeigt. Bei einem Abstand von 0,5 Millimetern zwischen den Zellschichten führte die Hypoxie zu einer signifikant erhöhten LDH-Freisetzung im Vergleich zur Normoxie, wenn Kardiomyozyten allein kultiviert wurden. LDH war jedoch in der Hypoxie-Reoxygenierungsgruppe im Vergleich zur reinen Hypoxie-Gruppe nur geringfügig erhöht.Wenn Endothelzellen und Kardiomyozyten zusammen kultiviert wurden, wurde der Anstieg der LDH-Freisetzung unter den reinen Hypoxie-Bedingungen nicht abgeschwächt. Dies deutet darauf hin, dass die Endothelzellen im Vergleich zur Gruppe der Kardiomyozyten allein unter den Hypoxie-Bedingungen keine schützende Wirkung hatten. Endothelzellen übten jedoch während der HR einen milden, aber signifikanten Schutz auf Kardiomyozyten aus. Wenn der Abstand zwischen den Zellschichten einen Millimeter betrug, war die LDH-Freisetzung auch in Kardiomyozyten nur unter der Nur-Hypoxie-Bedingung signifikant erhöht.Im Gegensatz zum 0,5-Millimeter-Einsatz wurde der LDH-Anstieg der Kardiomyozyten jedoch nur durch HR gegenüber Hypoxie-Bedingungen potenziert. Dieser Anstieg war mit dem Zwei-Millimeter-Einsatz noch ausgeprägter. Die Konzentration der Endothelzellen, die in Zwei-Millimeter-Einsätzen plattiert waren, wurde auf 25.000, 50.000 bzw. 100.000 Zellen pro Einsatz titriert.Es wurde festgestellt, dass eine Erhöhung der Endothelzellintensität in der Kokultur zu einer dosisabhängigen Abschwächung der LDH-Freisetzung durch HR führte. Unter normoxischen Bedingungen wurde jedoch kein solcher Effekt beobachtet. Diese Co-Kultur-Methodik ist nicht auf Endothelzellen und Kardiomyozyten beschränkt. Diese Methoden sollten eine Untersuchung spezifischer Zell-Zell-Interaktionen zwischen verschiedenen Zelllinien über mehrere interessante Organe hinweg unterstützen.

Research

JoVE Journal

Biology

Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Forschung

Biologie

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

Ein Multi-Kompartiment-ZNS-Neuron-Glia-Co-Kultur mikrofluidischen Plattform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

Endothelial Cell Co-Kultur Vermittelt Reifung von humanen embryonalen Stammzellen zu Pankreas-Insulin-produzierenden Zellen in einer gerichteten Differenzierung Ansatz

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

Isolierung von Brustepithelzellen aus dreidimensionalen Mixed-Zelle Spheroid Co-Kultur

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Blastomere Explantate für das Schicksal der Zelle Engagement während der embryonalen Entwicklung Testen

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

Intravitalmikroskopie der Mikrozirkulation in der Maus Cremaster-Muskel für die Analyse der peripheren Stammzell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Ein Anoxia-Hunger-Modell für Ischämie / Reperfusion in<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation und Kultur der erwachsenen Maus Kardiomyozyten für Cell Signaling und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Herzhypertrophie

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In vitro Synthese von modifizierten mRNA zur Induktion der Proteinexpression in menschlichen Zellen

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Validierung eines Maus-Modell zu LINC Komplexe Disrupt in einem zellspezifisch

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...