Name: development of a cell co-culture model to mimic cardiac ischemia/reperfusion in vitro
Uploaded: 2021-10-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro at JoVE.com

עבודה זו נתמכה, בין היתר, על ידי המחלקה האמריקאית לענייני יוצאי צבא שירות מו"פ מעבדה ביו-רפואית (I01 BX003482) ועל ידי קרנות מוסדיות ל- M.L.R.

1. הכנה/ציפוי ניסיוני
<ol><li>שמור על CMs ו- ECs בהתאם להוראות היצרן.<ol>
<li>להפשיר את שני קווי התא כאשר הם מגיעים מספקים. צלחת בבקבוקונים T25 לאחר שטף עם מדיה טרייה. מומלץ לרכוש כל מדיה של תרבית תאים מאותם ספקים שמהם נרכשו התאים. למחרת, רענן את התאים עם מדיה והשתמש כאשר הם נפגשים.</li>
		<li>לשמור ע...

<ol>
	<li>Hausenloy, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemic+conditioning+and+targeting+reperfusion+injury:+a+30+year+voyage+of+discovery.">Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery.</a> Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70 (2016).</li><li>Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+a+neglected+therapeutic+target.">Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 92-100 (2013).</li><li>Gottlieb, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+pathways+in+acute+ischemia/reperfusion+injury.">Cell death pathways in acute ischemia/reperfusion injury.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 233-238 (2011).</li><li>Colliva, A., Braga, L., Giacca, M., Zacchigna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-cardiomyocyte+crosstalk+in+heart+development+and+disease.">Endothelial cell-cardiomyocyte crosstalk in heart development and disease.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2923-2939 (2020).</li><li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cell-cell+communication+in+co-culture.">Studying cell-cell communication in co-culture.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 395-396 (2013).</li><li>Salzman, M. M., Bartos, J. A., Yannopoulos, D., Riess, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poloxamer+188+protects+isolated+adult+mouse+cardiomyocytes+from+reoxygenation+injury.">Poloxamer 188 protects isolated adult mouse cardiomyocytes from reoxygenation injury.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 8 (6), 00639 (2020).</li><li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+ischemia/reperfusion+injury.">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 298, 229-317 (2012).</li><li>Martindale, J. J., Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+of+increased+cellular+oxidative+stress+and+myocardial+ischemia+reperfusion+injury+by+directed+sarcolemma+stabilization.">Uncoupling of increased cellular oxidative stress and myocardial ischemia reperfusion injury by directed sarcolemma stabilization.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 26-37 (2014).</li><li>vander Meer, A. D., Orlova, V. V., ten Dijke, P., vanden Berg, A., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+co-cultures+of+human+endothelial+cells+and+embryonic+stem+cell-derived+pericytes+inside+a+microfluidic+device.">Three-dimensional co-cultures of human endothelial cells and embryonic stem cell-derived pericytes inside a microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 13, 3562-3568 (2013).</li><li>Bidarra, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+proliferative+modulation+of+human+mesenchymal+stem+cells+via+crosstalk+with+endothelial+cells.">Phenotypic and proliferative modulation of human mesenchymal stem cells via crosstalk with endothelial cells.</a> Stem Cell Research. 7, 186-197 (2011).</li><li>Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology.">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PloS One. 6, 25661 (2011).</li><li>Mehes, E., Mones, E., Nemeth, V., Vicsek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+motion+of+cells+mediates+segregation+and+pattern+formation+in+co-cultures.">Collective motion of cells mediates segregation and pattern formation in co-cultures.</a> PloS One. 7, 31711 (2012).</li><li>Miki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+of+co-culture+over+mono+cell+culture+in+simulating+in+vivo+environment.">The advantages of co-culture over mono cell culture in simulating in vivo environment.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 131 (3-5), 68-75 (2012).</li><li>Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-chip:+a+focus+on+compartmentalized+microdevices.">Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1211-1227 (2012).</li><li>Campbell, J., Davidenko, N., Caffarel, M., Cameron, R., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology.">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PLoS One. 6, 25661 (2011).</li><li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research.">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10, 939-956 (2010).</li></ol>

שלבים קריטיים בפרוטוקול מודלים של תרבות משותפת של תאים שימשו לחקר מנגנונים תאיים של cardioprotection. כיצד ליצור שתי שכבות נפרדות עם מרחק משמעותי ביניהן הוא, אם כן, חיוני לפיתוח מודל תרבות משותפת מתאים. אתגר בחקר IR מדומה, כלומר, משאבי אנוש, פגיעה הוא כי לא רק איסכמיה (היפוקסיה) עצמה, אלא ג?...

מחלת לב איסכמית היא הגורם המוביל למוות ונכות ברחבי העולם 1,2. עם זאת, תהליך הטיפול של רפרטפוזיה יכול עצמו לגרום למוות cardiomyocyte, המכונה איסכמיה שריר הלב / רפרטפוזיה (IR) פגיעה, אשר עדיין אין תרופה יעילה3. תאי אנדותל (ECs) הוצעו להגן על cardiomyocytes (CMs) באמצעות הפרשת אותות paracrine, כמו גם אינטראקציות תא לתא4.
מודלים של תרבות משותפת של תאים שימשו בהרחבה כדי לחקור את התפקיד של אינטראקציות אוטוקרין ו/או פראקרין תא-תא על תפקוד התא וההבחנה. בין מודלים של תרבות משותפת, תרבות משותפת מעורבת היא הפשוטה ביותר, שבה שני סוגים שונים של תאים נמצאים במגע ישיר בתוך תא תרבות יחיד ביחס התא הרצוי5. עם זאת, טיפולים נפרדים בין סוגי תאים וניתוח במורד הזרם של סוג תא יחיד אינם אפשריים בקלות בהתחשב באוכלוסייה המעורבת.
מחקרים קודמים הצביעו על כך עלבונות היפוקסיים ואיסכמיים לגרום נזק משמעותי לשלמות של קרום התא כפי שנמדד על ידי שחרורו של לקטט דהידרוגנאז (LDH). פציעה זו מחמירה עם reoxygenation, מחקה פגיעה reperfusion 6,7,8. מטרת הפרוטוקול הנוכחי הייתה לבדוק את ההשערות כי נוכחותם של רדיקלים אלקטרוניים יכולה להחליש באופן תלוי במינון דליפת קרום התא של CMs הנגרמת על ידי היפוקסיה ו reoxygenation (HR) וכי ההשפעה המגנה של ECs ניתן למטב על ידי שינוי מרחק המגע בין שני קווי התא. לכן, העסקנו שלושה סוגים של תוספות תרבית תאים ותאי אנדותל עורקים כליליים עיקריים עכבר ו Cardiomyocytes עכבר מבוגר. התוספות, ממותגות על ידי קורנינג, מרק מיליפור, ו Greiner Bio-One אפשרו לנו ליצור שלושה תנאים שונים של תרבית תאים צולבת עם מרחקי קו בין תאים של 0.5, 1.0 ו -2.0 מ"מ, בהתאמה. 100,000 ECs היו מצופים לכל הוספה בכל מקרה.
בנוסף, על מנת לקבוע אם הצפיפות של ECs בתרבות משותפת תורמת להחלשת פגיעה במשאבי אנוש במודל זה, חקרנו את יחסי תגובת המינון בין ריכוז EC לשחרור LDH על ידי CMs. ECs היו מצופים ב 25,000, 50,000 ו 100,000 לכל הוספה, בהתאמה, בתוספת 2.0 מ"מ.
דו"ח זה מספק גישה צעד אחר צעד לחוקרים להשתמש במודל חשוב זה לטובתם.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)</td>
			<td >Celprogen Inc</td>
			<td >11041-14</td>
			<td >Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Automated Cell Counter Countess II</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A27977</td>
			<td>Cell counting for calculating cell numbers</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bio-Safety Cabinet</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU425400</td>
			<td>Cell culture sterile hood</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6916</td>
			<td>Used for cell freezing for long term cell line storage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>Nu-5500</td>
			<td>To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37&#176;C, humidified)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Incubator Gas Tank</td>
			<td>A-L Compressed Gases</td>
			<td>UN1013</td>
			<td>Gas needed for cell culture incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts A (0.5 mm)</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>353095</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts B (1.0 mm)</td>
			<td>Millicell Millipore</td>
			<td>PIHP01250</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts C (2.0 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662640</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td>Anstel Enterprises Inc</td>
			<td>4235</td>
			<td>For cell culture plating and passaging</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Flasks T25</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>E11041-14</td>
			<td>Used for CMs regular culture, coated by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Medium Complete</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14S</td>
			<td>CMs culture complete medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14PN</td>
			<td>CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Plates 96 well</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>E11041-14-96well</td>
			<td>Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Hypoxia Cell Culture Medium</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14GFPN</td>
			<td>CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Countess cell counting chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Counting slides used for cell counter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cyquant LDH Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>C20301</td>
			<td>LDH measurement kit</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Flasks T25</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>FB012935</td>
			<td>Used for ECs regular culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Medium Complete</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>M1168</td>
			<td>ECs culture complete medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>M1168PF</td>
			<td>ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Plates 96 well</td>
			<td>Fisher Scientific (Costar)</td>
			<td>3370</td>
			<td>Used for experiments of LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6950</td>
			<td>Used for coating flasks and plates for ECs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Hypoxia Cell Culture Medium</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>GPF1168</td>
			<td>ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35011CV</td>
			<td>FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxia Chamber</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td>To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxia Chamber Flow Meter</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27311</td>
			<td>To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)</td>
			<td>A-L Compressed Gases</td>
			<td>UN1956</td>
			<td>Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TMS</td>
			<td>To observe cell condition</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>C57-6093</td>
			<td>Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NUNC 15ML CONICL Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565269</td>
			<td>For cell culture process, experiments, solution preparation etc.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NUNC 50ML CONICL Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565271</td>
			<td>For cell culture process, experiments, solution preparation etc.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>Used for cell washing during culture or experiments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plate Reader</td>
			<td>BioTek Instrument</td>
			<td>11120533</td>
			<td>Colorimetric or fluorometric plate reading</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reaction 96 Well Palte (clear no lid)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565226</td>
			<td>Used for LDH measurement plate reading</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA for CMs</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>T1509-014</td>
			<td>1 x sterile filtered and tissue culture tested</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA for ECs</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6914/0619</td>
			<td>0.25%, cell cuture-tested</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a cell co-culture model to mimic cardiac ischemia/reperfusion in vitro

מחלת לב איסכמית היא הגורם המוביל למוות ולמוגבלות ברחבי העולם. רפרטפוזיה גורמת לפציעה נוספת מעבר לאיסכמיה. תאי אנדותל (ECs) יכולים להגן על קרדיומיוציטים (CMs) מפני פגיעה ברפרטוזיה באמצעות אינטראקציות בין תאים לתאים. תרבויות משותפות יכולות לעזור לחקור את התפקיד של אינטראקציות בין תאים לתאים. תרבות משותפת מעורבת היא הגישה הפשוטה ביותר, אך מוגבלת מכיוון שטיפולים מבודדים וניתוחים במורד הזרם של סוגי תאים בודדים אינם אפשריים. כדי לחקור אם ECs יכול למנות תלוי מינון להחליש נזק לתאי CM והאם הגנה זו יכולה להיות ממוטבת עוד יותר על ידי שינוי מרחק המגע בין שני קווי התאים, השתמשנו בתאי אנדותל עורק הכלילי הראשי של העכבר הראשי ובקרדיומיוציטים של עכבר בוגר כדי לבדוק שלושה סוגים של תוספות תרבית תאים שהשתנו במרחק השכבה הבין-תאית שלהם ב- 0.5, 1.0, ו 2.0 מ"מ, בהתאמה. ב- CMs בלבד, פגיעה תאית כפי שהוערכה על ידי שחרור לקטט דהידרוגנאז (LDH) גדלה באופן משמעותי במהלך היפוקסיה ובהמשך על reoxygenation כאשר המרחק היה 2.0 מ"מ לעומת 0.5 ו 1.0 מ"מ. כאשר ECs וCMs היו במגע כמעט ישיר (0.5 מ"מ), היה רק החלקה קלה של פגיעה reoxygenation של CMs בעקבות היפוקסיה. הנחתה זו הוגדלה באופן משמעותי כאשר המרחק המרחבי היה 1.0 מ"מ. עם מרחק של 2.0 מ"מ, ECs החלישו פגיעת CM במהלך היפוקסיה והיפוקסיה / reoxygenation, המציין כי התרחקות תרבותית מספקת נחוצה עבור ECs כדי להצליב עם CMs, כך מולקולות אות מופרש יכול להסתובב ולעורר באופן מלא מסלולי הגנה. הממצאים שלנו מראים, בפעם הראשונה, כי אופטימיזציה של הסביבה המרחבית של תרבות משותפת EC / CM נחוצה כדי לספק מודל הפריה חוץ גופית חיובי לבדיקת התפקיד של ECs בהגנה CM מפני איסכמיה מדומה / פגיעה reperfusion. מטרתו של דו"ח זה היא לספק גישה צעד אחר צעד לחוקרים להשתמש במודל חשוב זה לטובתם.

כל שלושת סוגי התוספות (A, B, C) המשמשים בניסוי זה הם בעלי גודל נקבוביות זהה של 0.4 מיקרומטר. ההבדל היחיד ביניהם הוא גובה ההוספה לבסיס, המאפשר למרחקים בין שתי שכבות התאים בתרבית משותפת להיות 0.5, 1.0 ו-2.0 מ"מ, בהתאמה, (איור 3) ושהם מספקים שונים (לפרטים ראו טבלת חומרים).
<p class="jov...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro at JoVE.com

Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

מרחק מרחבי הוא פרמטר מרכזי בהערכת פגיעה היפוקסיה/ראוקסיגניה במודל של תרבות משותפת של שכבות תאי אנדותל וקרדיומיוציטים נפרדות, מה שמרמז, לראשונה, כי אופטימיזציה של הסביבה המרחבית של תרבות משותפת נחוצה כדי לספק מודל הפריה חוץ גופית חיובי לבדיקת התפקיד של תאי אנדותל בהגנה על קרדיומיוציטים.

פיתוח מודל של תרבות משותפת של תאים כדי לחקות איסכמיה לב/רפרטפוזיה במבחנה במבחנה

Ischemic heart disease is the leading cause of death and disability worldwide. Reperfusion causes additional injury beyond ischemia. Endothelial cells ...

הממצאים שלנו מראים כי אופטימיזציה של הסביבה המרחבית של קרדיומיוציטים של תאי אנדותל יש צורך לספק מודל הפריה חוץ גופית חיובי לבדיקת התפקיד של תאי אנדותל בהגנה על קרדיומיוציטים מפני פגיעה מדומה של איסכמיה. מודלים של תרבית משותפת של תאים שימשו בהרחבה כדי לחקור את התפקיד של אינטראקציות תא-תא על תפקוד התא ובידול. עם זאת, טיפולים נפרדים בין סוגי תאים וניתוח במורד הזרם של סוג תא יחיד אינם אפשריים בקלות בתרבות המשותפת המעורבת.המחקר הנוכחי נועד ליצור שתי שכבות תאים נפרדות עם מרחק משמעותי ביניהן שבו ניתן לגרום לפגיעה בהיפוקסיה ולחקור את התוצאה וההשפעות על סוג תא יחיד. התחל את ההכנה על ידי הפשרת שני קווי התא. צלחת את התאים בבקבוקונים T25 לאחר שטיפת אותם עם מדיה טרייה.למחרת, רענן את התאים במדיה והשתמש בהם כאשר הם נפגשים. לשמור על אינקובטור תרבית התא ב 37 מעלות צלזיוס עם 21% חמצן, 5% פחמן דו חמצני, ו 74% חנקן. שמור את זה לח.הערך את צפיפות קו התאים של קרדיומיוציטים תחת מיקרוסקופ אור. הסר את המדיה מהבקבוקונים המכילים תרביות תאים משולבות ו trypsinize עם שלושה עד חמישה מיליליטרים של טריפסין-EDTA לכל בקבוקון. להסעיר את הבקבוק בעדינות ודגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שתיים עד חמש דקות.לאחר מכן, להעריך את ההתקדמות אנזימטית תחת מיקרוסקופ אור. לאחר ניתוק, להשבית את פתרון טריפסין על ידי הוספת פתרון trysin או תא לצינור 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של מדיה לכל בקבוק T25. צנטריפוגה השעיית התא ב 120 x g במשך שתי דקות כדי לקבל גלולה תא רך.לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant ו resuspend את הכדור בחמישה מיליליטר של מדיה. לאחר מכן, בצע ספירת תאים ואשר את הכדאיות של התא. מערבבים ו aliquot של 10 מיקרוליטרים של תאים resuspended ו 10 microliters של צבע כחול טריפאן, ולאחר מכן לספור את התאים החיים באמצעות מונה תאים.לדלל את התאים עם מדיה רגילה טרייה כדי להשיג את צפיפות הזריעה הרצויה. קח צלחת 24-well מראש לצפות אותו עם מטריצה חוץ תאית ו cardiomyocytes צלחת בצפיפות זריעה של 300, 000 לכל באר על החלק התחתון של הצלחת. לשמור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% דו תחמוצת הפחמן בן לילה.לאחר 24 שעות, תאי אנדותל צלחת לתוך תוספות בצפיפות ציפוי אופטימלית של 100, 000 לכל הוספה. לאחר 24 שעות של ציפוי תאי אנדותל, הניחו את תאי האנדותל בתוך בארות הקרדיומיוציטים ויזמו תרבות משותפת. אפשר לתאים לתרבות משותפת במשך 12 עד 24 שעות לפני ביצוע הניסויים.הכן את התקשורת ההיפוקסית על ידי שפיכת כ -25 מיליליטר של מדיה בצינור חרוטי 50 מיליליטר. האוויר אוטם את החלק העליון עם קרום סיליקון ומשתמש בפיפטה מעוקרת כדי לנקב חור. לאחר מכן, ליצור חור נוסף ולהשאיר כ 2/3 של פיפטות שקועות בתקשורת.יש לשטוף את המדיה בגז היפוקסי למשך חמש דקות בקצב זרימה של 30 ליטר לדקה, ולאחר מכן להשליך את המדיה של הלוחות או תוספות התרבות של 24 הבארות המכילות תאים מצורפים. לשטוף אותם בעדינות רבה עם 100 microliters של 10% PBS לכל היטב להוסיף 500 מיקרוליטרים של מדיה היפוקסית מוכן טרי לכל באר של הצלחות או תוספות. החלף את המדיה המקורית במדיה רגילה ורעננה המכילה גלוקוז וסרום בקבוצת הביקורת הנורמוקסלית.מניחים צלחת פטרי מלאה במים סטריליים לתוך תא היפוקסיה כדי לח את התא. לאחר מכן מניחים את הלוחות המכילים את הקבוצות ההיפוקסיות לתוך התא. לשטוף את תא היפוקסיה עם גז היפוקסי במשך חמש דקות בזרימה של 30 ליטר לדקה.לאחר מכן, מניחים את התא בתוך אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. לאחר היפוקסיה, השליכו את המדיה הישנה של הצלחות או התוספות והוסיפו 500 מיקרוליטרים של מדיה רגילה המכילה גלוקוז וסרום לכל קיר של הצלחות, ולאחר מכן אחסנו את הצלחות בתוך אינקובטור בתנאי תרבות רגילים במשך שעתיים כדי לחקות רפרטפוזיה. העבירו את מדיית תרבית התאים מהצלחת בת 24 הבאר לצלחת של 96 בארות, ואז קחו 200 מיקרוליטרים של מדיה מכל באר של הצלחת בת 24 הבאר ומחולקים באופן שווה לארבע בארות של צלחת 96 הבאר.מדוד את הספיגה עבור LDH באמצעות ערכת בדיקת ציטוטוקסיות בצלחת של 96 בארות ובצע את הוראות היצרן כדי לקבוע את מידת הפגיעה התאית. במחקר זה, שלושה סוגים של תוספות הוערכו. כל שלושת התוספות היו באותו גודל נקבוביות של 0.4 מיקרומטר.ההבדל היחיד ביניהם היה התוספת לגובה הבסיס, המאפשרת את המרחקים בין שתי שכבות התאים בתרבית משותפת להיות 0.5, 1.0 ו 2.0 מילימטרים. באמצעות פרוטוקול זה, תאים היו בתרבית בתנאי חמצן רגילים ולאחר מכן לפצל לשתי קבוצות קבוצת בקרה נורמוקסית וקבוצת היפוקסיה. לאחר 24 שעות, שתי הקבוצות התרעננו עם מדיה ותרבית בתנאי חמצן רגילים במשך שעתיים נוספות לפני ביצוע בדיקות נקודת הקצה.השוואה של שלושת סוגי תרבית מוסיף בהערכת שחרור dehydrogenase לקטט עבור cardiomyocyte לבד, תאי אנדותל לבד, ותרבות משותפת של cardiomyocyte עם תאי אנדותל מוצג כאן תחת נורמוקסיק, היפוקסיה בלבד, היפוקסיה בלבד, היפוקסיה, היפוקסיה reoxygenation תנאים. עם מרחק של 0.5 מילימטר בין שכבות התא, היפוקסיה הובילה לשחרור LDH מוגבר באופן משמעותי בהשוואה לנורמוקסיה כאשר קרדיומיוציטים היו מתורבתים לבד. עם זאת, LDH היה רק גדל מעט בקבוצת reoxygenation היפוקסיה בהשוואה לקבוצת היפוקסיה בלבד.כאשר תאי אנדותל וקרדיומיוציטים היו בתרבית משותפת יחד, העלייה של שחרור LDH תחת התנאים היפוקסיה בלבד לא נחלש. זה מצביע על כך שלתאי האנדותל לא הייתה השפעה מגנה בהשוואה לקבוצת הקרדיומיוציטים בלבד תחת תנאי היפוקסיה בלבד. עם זאת, תאי אנדותל הפעילו הגנה קלה אך משמעותית על קרדיומיוציטים במהלך משאבי אנוש. כאשר המרחק בין שכבות התא היה מילימטר אחד, שחרור LDH היה גם גדל באופן משמעותי קרדיומיוציטים רק תחת מצב היפוקסיה בלבד.עם זאת, שלא כמו בהכנסת 0.5 מילימטר, העלייה LDH קרדיומיוציטים רק היה potentiated על ידי משאבי אנוש על פני היפוקסיה בלבד תנאים. עלייה זו הייתה בולטת עוד יותר עם הכנסת שני מילימטרים. הריכוז של תאי אנדותל מצופה תוספות שני מילימטר היה titrated ל 25, 000, 50, 000 ו 100, 000 תאים לכל הוספה, בהתאמה.נמצא כי הגדלת עוצמת התא האנדותל בתרבות המשותפת הובילה להחלשה תלוית מינון של שחרור LDH הנגרמת על ידי משאבי אנוש. עם זאת, לא נראה אפקט כזה בתנאים נורמוקסליים. מתודולוגיית תרבות משותפת זו אינה מוגבלת לתאי אנדותל וקרדיומיוציטים. שיטות אלה אמורות לסייע בחקירה של אינטראקציות תאיות ספציפיות בין קווי תאים מגוונים על פני איברים מרובים של עניין.

Research

JoVE Journal

Biology

Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

תא Multi-CNS-Neuron גליה שותף תרבות Microfluidic רציף

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

תא האנדותל שיתוף תרבות מתווכת ההבשלה של עובריים אנושיים לתאי גזע לאינסולין בתאי לבלב הפקת בגישה הבחנה בימוי

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

בידוד של תאים אפיתל החלב של תלת ממדי תאים משולבים תרבות משותפת אליפטית

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Explants Blastomere לבדיקת מחויבות גורל תא במהלך התפתחות עוברית

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

מיקרוסקופית Intravital של זרימת הדם בשריר העכבר Cremaster לניתוח של נדידת תאי גזע היקפי

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

דגם אנוקסיה רעב לאיסכמיה / reperfusion ב<em&gt; ג elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

בידוד והתרבות של שריר לב מאוס למבוגרים לתא איתות ו<em&gt; במבחנה</em&gt; לב היפרטרופיה

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

במבחנת הסינתזה של mRNA השתנה לאינדוקציה של ביטוי חלבון בתאים אנושיים

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

אימות של מודל עכבר לשבש מכלולי LINC באופן ספציפי בתא

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...