Name: development of a cell co-culture model to mimic cardiac ischemia/reperfusion in vitro
Uploaded: 2021-10-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato, in parte, dal servizio di ricerca e sviluppo del laboratorio biomedico del Dipartimento degli affari dei veterani degli Stati Uniti (I01 BX003482) e da fondi istituzionali a M.L.R.

1. Preparazione/placcatura sperimentale
<ol><li>Mantenere CM ed EC secondo le istruzioni del produttore.<ol>
<li>Scongelare entrambe le linee cellulari quando arrivano dai fornitori. Piastra in palloni T25 dopo essere stata lavata con mezzi freschi. Si consiglia di acquistare ogni terreno di coltura cellulare dagli stessi fornitori da cui sono state acquistate le cellule. Il giorno successivo, aggiornare le celle con i supporti e utilizzarle quando sono confluenti.</li>
		<li>Mantenere l'incubatore di ...

<ol>
	<li>Hausenloy, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemic+conditioning+and+targeting+reperfusion+injury:+a+30+year+voyage+of+discovery.">Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery.</a> Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70 (2016).</li><li>Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+a+neglected+therapeutic+target.">Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 92-100 (2013).</li><li>Gottlieb, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+pathways+in+acute+ischemia/reperfusion+injury.">Cell death pathways in acute ischemia/reperfusion injury.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 233-238 (2011).</li><li>Colliva, A., Braga, L., Giacca, M., Zacchigna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-cardiomyocyte+crosstalk+in+heart+development+and+disease.">Endothelial cell-cardiomyocyte crosstalk in heart development and disease.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2923-2939 (2020).</li><li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cell-cell+communication+in+co-culture.">Studying cell-cell communication in co-culture.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 395-396 (2013).</li><li>Salzman, M. M., Bartos, J. A., Yannopoulos, D., Riess, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poloxamer+188+protects+isolated+adult+mouse+cardiomyocytes+from+reoxygenation+injury.">Poloxamer 188 protects isolated adult mouse cardiomyocytes from reoxygenation injury.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 8 (6), 00639 (2020).</li><li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+ischemia/reperfusion+injury.">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 298, 229-317 (2012).</li><li>Martindale, J. J., Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+of+increased+cellular+oxidative+stress+and+myocardial+ischemia+reperfusion+injury+by+directed+sarcolemma+stabilization.">Uncoupling of increased cellular oxidative stress and myocardial ischemia reperfusion injury by directed sarcolemma stabilization.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 26-37 (2014).</li><li>vander Meer, A. D., Orlova, V. V., ten Dijke, P., vanden Berg, A., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+co-cultures+of+human+endothelial+cells+and+embryonic+stem+cell-derived+pericytes+inside+a+microfluidic+device.">Three-dimensional co-cultures of human endothelial cells and embryonic stem cell-derived pericytes inside a microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 13, 3562-3568 (2013).</li><li>Bidarra, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+proliferative+modulation+of+human+mesenchymal+stem+cells+via+crosstalk+with+endothelial+cells.">Phenotypic and proliferative modulation of human mesenchymal stem cells via crosstalk with endothelial cells.</a> Stem Cell Research. 7, 186-197 (2011).</li><li>Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology.">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PloS One. 6, 25661 (2011).</li><li>Mehes, E., Mones, E., Nemeth, V., Vicsek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+motion+of+cells+mediates+segregation+and+pattern+formation+in+co-cultures.">Collective motion of cells mediates segregation and pattern formation in co-cultures.</a> PloS One. 7, 31711 (2012).</li><li>Miki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+of+co-culture+over+mono+cell+culture+in+simulating+in+vivo+environment.">The advantages of co-culture over mono cell culture in simulating in vivo environment.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 131 (3-5), 68-75 (2012).</li><li>Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-chip:+a+focus+on+compartmentalized+microdevices.">Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1211-1227 (2012).</li><li>Campbell, J., Davidenko, N., Caffarel, M., Cameron, R., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology.">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PLoS One. 6, 25661 (2011).</li><li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research.">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10, 939-956 (2010).</li></ol>

Passaggi critici nel protocollo Modelli di co-coltura cellulare sono stati utilizzati per studiare i meccanismi cellulari di cardioprotezione. Come creare due strati separati con una distanza significativa tra loro è, quindi, cruciale per lo sviluppo di un modello di co-cultura adatto. Una sfida nello studio della lesione IR simulata, cioè HR, è che non solo l'ischemia (ipossia) stessa, ma anche la riperfusione (reossigenazione) aggrava la disfunzione cellulare. Pertanto, un modello realistico deve...

La cardiopatia ischemica è la principale causa di morte e disabilità in tutto il mondo 1,2. Tuttavia, il processo di trattamento della riperfusione può causare la morte dei cardiomiociti, nota come lesione da ischemia / riperfusione miocardica (IR), per la quale non esiste ancora un rimedio efficace3. Le cellule endoteliali (CE) sono state suggerite per proteggere i cardiomiociti (CM) attraverso la secrezione di segnali paracrini, nonché le interazioni cellula-cellula4.
I modelli di co-coltura cellulare sono stati ampiamente utilizzati per studiare il ruolo delle interazioni cellula-cellula autocrine e/o paracrine sulla funzione e la differenziazione cellulare. Tra i modelli di co-coltura, la co-coltura mista è la più semplice, in cui due diversi tipi di cellule sono in contatto diretto all'interno di un singolo compartimento di coltura con un rapporto cellulare desiderato5. Tuttavia, trattamenti separati tra tipi di cellule e analisi a valle di un singolo tipo di cellula non sono prontamente fattibili data la popolazione mista.
Studi precedenti hanno indicato che gli insulti ipossici e ischemici causano danni significativi all'integrità della membrana cellulare misurata dal rilascio di lattato deidrogenasi (LDH). Questa lesione è peggiorata con la riossigenazione, imitando la lesione da riperfusione 6,7,8. L'obiettivo dell'attuale protocollo era quello di testare le ipotesi che la presenza di EC possa attenuare in modo dose-dipendente la perdita di CM della membrana cellulare causata da ipossia e riossigenazione (HR) e che l'effetto protettivo degli EC possa essere ottimizzato variando la distanza di contatto tra le due linee cellulari. Pertanto, abbiamo impiegato tre tipi di inserti di coltura cellulare e cellule endoteliali coronariche primarie di topo e cardiomiociti di topo adulti. Gli inserti, marchiati da Corning, Merck Millipore e Greiner Bio-One, ci hanno permesso di creare tre diverse condizioni di diafonia della coltura cellulare con distanze intercellulari di 0,5, 1,0 e 2,0 mm, rispettivamente. 100.000 CE sono stati placcati per inserto in ciascun caso.
Inoltre, al fine di determinare se la densità delle CE in cocoltura contribuisca all'attenuazione del danno hr in questo modello, abbiamo studiato la relazione dose-risposta tra concentrazione CE e rilascio di LDH da parte dei CM. Le CE sono state placcate rispettivamente a 25.000, 50.000 e 100.000 per inserto, nell'inserto da 2,0 mm.
Questo rapporto fornisce un approccio passo-passo per gli investigatori per utilizzare questo importante modello a loro vantaggio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)</td>
			<td >Celprogen Inc</td>
			<td >11041-14</td>
			<td >Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Automated Cell Counter Countess II</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A27977</td>
			<td>Cell counting for calculating cell numbers</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bio-Safety Cabinet</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU425400</td>
			<td>Cell culture sterile hood</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6916</td>
			<td>Used for cell freezing for long term cell line storage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>Nu-5500</td>
			<td>To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37&#176;C, humidified)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Incubator Gas Tank</td>
			<td>A-L Compressed Gases</td>
			<td>UN1013</td>
			<td>Gas needed for cell culture incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts A (0.5 mm)</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>353095</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts B (1.0 mm)</td>
			<td>Millicell Millipore</td>
			<td>PIHP01250</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts C (2.0 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662640</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td>Anstel Enterprises Inc</td>
			<td>4235</td>
			<td>For cell culture plating and passaging</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Flasks T25</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>E11041-14</td>
			<td>Used for CMs regular culture, coated by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Medium Complete</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14S</td>
			<td>CMs culture complete medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14PN</td>
			<td>CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Plates 96 well</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>E11041-14-96well</td>
			<td>Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Hypoxia Cell Culture Medium</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14GFPN</td>
			<td>CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Countess cell counting chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Counting slides used for cell counter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cyquant LDH Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>C20301</td>
			<td>LDH measurement kit</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Flasks T25</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>FB012935</td>
			<td>Used for ECs regular culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Medium Complete</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>M1168</td>
			<td>ECs culture complete medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>M1168PF</td>
			<td>ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Plates 96 well</td>
			<td>Fisher Scientific (Costar)</td>
			<td>3370</td>
			<td>Used for experiments of LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6950</td>
			<td>Used for coating flasks and plates for ECs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Hypoxia Cell Culture Medium</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>GPF1168</td>
			<td>ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35011CV</td>
			<td>FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxia Chamber</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td>To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxia Chamber Flow Meter</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27311</td>
			<td>To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)</td>
			<td>A-L Compressed Gases</td>
			<td>UN1956</td>
			<td>Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TMS</td>
			<td>To observe cell condition</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>C57-6093</td>
			<td>Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NUNC 15ML CONICL Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565269</td>
			<td>For cell culture process, experiments, solution preparation etc.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NUNC 50ML CONICL Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565271</td>
			<td>For cell culture process, experiments, solution preparation etc.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>Used for cell washing during culture or experiments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plate Reader</td>
			<td>BioTek Instrument</td>
			<td>11120533</td>
			<td>Colorimetric or fluorometric plate reading</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reaction 96 Well Palte (clear no lid)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565226</td>
			<td>Used for LDH measurement plate reading</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA for CMs</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>T1509-014</td>
			<td>1 x sterile filtered and tissue culture tested</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA for ECs</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6914/0619</td>
			<td>0.25%, cell cuture-tested</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a cell co-culture model to mimic cardiac ischemia/reperfusion in vitro

La cardiopatia ischemica è la principale causa di morte e disabilità in tutto il mondo. La riperfusione provoca ulteriori lesioni oltre l'ischemia. Le cellule endoteliali (CE) possono proteggere i cardiomiociti (CM) dalle lesioni da riperfusione attraverso le interazioni cellula-cellula. Le co-colture possono aiutare a studiare il ruolo delle interazioni cellula-cellula. Una co-coltura mista è l'approccio più semplice, ma è limitata in quanto i trattamenti isolati e le analisi a valle di singoli tipi di cellule non sono fattibili. Per indagare se le CE possono attenuare in modo dose-dipendente il danno alle cellule CM e se questa protezione può essere ulteriormente ottimizzata variando la distanza di contatto tra le due linee cellulari, abbiamo utilizzato le cellule endoteliali dell'arteria coronaria primaria del topo e i cardiomiociti del topo adulto per testare tre tipi di inserti di coltura cellulare che variavano nella loro distanza dello strato intercellulare a 0,5, 1,0 e 2,0 mm, rispettivamente. Solo nelle CM, il danno cellulare valutato dal rilascio di lattato deidrogenasi (LDH) è aumentato significativamente durante l'ipossia e ulteriormente dopo la riossigenazione quando la distanza era di 2,0 mm rispetto a 0,5 e 1,0 mm. Quando le EC e le CM erano in contatto quasi diretto (0,5 mm), c'era solo una lieve attenuazione del danno da riossigenazione delle CM a seguito di ipossia. Questa attenuazione è stata significativamente aumentata quando la distanza spaziale era di 1,0 mm. Con una distanza di 2,0 mm, le CE hanno attenuato la lesione della CM sia durante l'ipossia che durante l'ipossia / riossigenazione, indicando che è necessario un sufficiente distanziamento di coltura per le CE per incrociare la diafonia con le CM, in modo che le molecole segnale secrete possano circolare e stimolare completamente le vie protettive. I nostri risultati suggeriscono, per la prima volta, che l'ottimizzazione dell'ambiente spaziale di co-coltura EC/CM è necessaria per fornire un modello in vitro favorevole per testare il ruolo degli EC nella protezione CM contro le lesioni da ischemia/riperfusione simulate. L'obiettivo di questo rapporto è quello di fornire un approccio passo-passo per gli investigatori per utilizzare questo importante modello a loro vantaggio.

Tutti e tre i tipi di inserti (A, B, C) utilizzati in questo esperimento hanno la stessa dimensione dei pori di 0,4 μm. L'unica differenza tra loro è l'altezza da inserto a base, che consente alle distanze tra i due strati cellulari co-coltivati di essere rispettivamente di 0,5, 1,0 e 2,0 mm (Figura 3) e che provengono da fornitori diversi (per i dettagli vedere Tabella dei materiali).
Per stabilire un modello di co-coltura in vitro con...

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Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

La distanza spaziale è un parametro chiave nella valutazione del danno da ipossia/riossigenazione in un modello di co-coltura di strati cellulari endoteliali e cardiomiociti separati, suggerendo, per la prima volta, che l'ottimizzazione dell'ambiente spaziale di co-coltura è necessaria per fornire un modello in vitro favorevole per testare il ruolo delle cellule endoteliali nella protezione dei cardiomiociti.

Sviluppo di un modello di co-coltura cellulare per imitare l'ischemia/riperfusione cardiaca in vitro

Ischemic heart disease is the leading cause of death and disability worldwide. Reperfusion causes additional injury beyond ischemia. Endothelial cells ...

La nostra scoperta suggerisce che l'ottimizzazione dell'ambiente spaziale di co-coltura di cardiomiociti a cellule endoteliali è necessaria per fornire un modello in vitro favorevole per testare il ruolo delle cellule endoteliali nella protezione dei cardiomiociti contro il danno simulato da rifonde di ischemia. I modelli di co-coltura cellulare sono stati ampiamente utilizzati per studiare il ruolo delle interazioni cellula-cellula sulla funzione e la differenziazione cellulare. Tuttavia, trattamenti separati tra tipi di cellule e analisi a valle di un singolo tipo di cellula non sono prontamente fattibili nella co-coltura mista.L'attuale studio mirava a creare due strati cellulari separati con una distanza significativa tra loro in cui si può indurre lesioni da riprofusione di ipossia e studiare il risultato e gli effetti su un singolo tipo di cellula. Inizia la preparazione scongelando entrambe le linee cellulari. Impiattare le cellule in palloni T25 dopo averle lavate con mezzi freschi.Il giorno successivo, aggiornare le celle con i supporti e utilizzarle quando confluenti. Mantenere l'incubatore di colture cellulari a 37 gradi Celsius con il 21% di ossigeno, il 5% di anidride carbonica e il 74% di azoto. Tenerlo umidificato.Stimare la confluenza della linea cellulare dei cardiomiociti al microscopio ottico. Rimuovere il materiale dai palloni contenenti colture cellulari confluenti e tripsinizzare con tre o cinque millilitri di tripsina-EDTA per pallone. Agitare delicatamente il pallone e incubare a 37 gradi Celsius per due o cinque minuti.Successivamente, valuta i progressi enzimatici al microscopio ottico. Dopo il distacco, inattivare la soluzione di tripsina aggiungendo la trysina o la soluzione cellulare a un tubo da 50 millilitri contenente 10 millilitri di media per pallone T25. Centrifugare la sospensione cellulare a 120 x g per due minuti per ottenere un pellet a cellule molli.Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e risospese il pellet in cinque millilitri di un mezzo. Quindi, eseguire il conteggio delle cellule e confermare la vitalità delle cellule. Mescolare e aliquotare 10 microlitri di cellule risospese e 10 microlitri di colorante blu di tripano, quindi contare le cellule viventi usando un contatore di cellule.Diluire le cellule con mezzi regolari freschi per ottenere le densità di semina desiderate. Prendi una piastra a 24 pozzetti pre-rivestirla con matrice extracellulare e cardiomiociti a piastra a densità di semina di 300.000 per pozzetto sul fondo della piastra. Mantenere le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica durante la notte.Dopo 24 ore, le cellule endoteliali a piastra in inserti ad una densità di placcatura ottimale di 100.000 per inserto. Dopo 24 ore di placcatura delle cellule endoteliali, posizionare gli inserti delle cellule endoteliali all'interno dei pozzetti dei cardiomiociti e avviare la co-coltura. Consentire alle cellule di co-coltivare per 12-24 ore prima di eseguire gli esperimenti.Preparare il mezzo ipossico versando circa 25 millilitri di media in un tubo conico da 50 millilitri. Sigillare ad aria la parte superiore con una membrana in silicone e utilizzare una pipetta sterilizzata per praticare un foro. Successivamente, creare un altro foro e lasciare circa 2/3 delle pipette immerse nel supporto.Lavare il fluido con gas ipossico per cinque minuti a una portata di 30 litri al minuto, quindi scartare il mezzo delle piastre a 24 pozzetti o degli inserti di coltura contenenti cellule attaccate. Lavali molto delicatamente con 100 microlitri del 10% PBS per pozzetto aggiungere 500 microlitri del mezzo ipossico appena preparato a ciascun pozzetto delle piastre o degli inserti. Sostituire il supporto originale con mezzi normali freschi contenenti glucosio e siero nel gruppo di controllo normossico.Posizionare una capsula di Petri piena di acqua sterile nella camera dell'ipossia per umidificare la camera. Quindi posizionare le piastre contenenti i gruppi ipossici nella camera. Lavare la camera dell'ipossia con gas ipossico per cinque minuti con un flusso di 30 litri al minuto.Successivamente, posizionare la camera all'interno di un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 24 ore. Dopo l'ipossia, scartare il vecchio mezzo delle piastre o degli inserti e aggiungere 500 microlitri di mezzi normali contenenti glucosio e siero a ciascuna parete delle piastre, quindi conservare le piastre all'interno di un incubatore in condizioni di coltura normali per due ore per imitare la riperfusione. Trasferire il terreno di coltura cellulare dalla piastra a 24 pozzetti in una piastra a 96 pozzetti, quindi prelevare 200 microlitri di terreno da ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti e distribuiti equamente in quattro pozzetti della piastra a 96 pozzetti.Misurare l'assorbanza per LDH utilizzando un kit di analisi di citotossicità in una piastra a 96 pozzetti e seguire le istruzioni del produttore per determinare il grado di lesione cellulare. In questo studio sono stati valutati tre tipi di inserti. Tutti e tre gli inserti avevano la stessa dimensione dei pori di 0,4 micrometri.L'unica differenza tra loro era l'inserto all'altezza di base, consentendo alle distanze tra i due strati cellulari co-coltivati di essere 0,5, 1,0 e 2,0 millimetri. Utilizzando questo protocollo, le cellule sono state coltivate in condizioni normali di ossigeno e poi divise in due gruppi: un gruppo di controllo normossico e il gruppo ipossia. Dopo 24 ore, entrambi i gruppi sono stati rinfrescati con i media e coltivati in condizioni normali di ossigeno per altre due ore prima di condurre i test finali.Un confronto dei tre tipi di inserti di coltura nella valutazione del rilascio di lattato deidrogenasi per cardiomiociti da soli, cellule endoteliali da sole e co-coltura di cardiomiociti con cellule endoteliali è mostrato qui in condizioni normossiche, solo ipossidiche e di riossigenazione dell'ipossia. Con una distanza di 0,5 millimetri tra gli strati cellulari, l'ipossia ha portato ad un aumento significativo del rilascio di LDH rispetto alla normossia quando i cardiomiociti sono stati coltivati da soli. Tuttavia, l'LDH è aumentato solo leggermente nel gruppo di riossigenazione dell'ipossia rispetto al solo gruppo dell'ipossia.Quando le cellule endoteliali e i cardiomiociti sono stati co-coltivati insieme, l'aumento del rilascio di LDH nelle sole condizioni di ipossia non è stato attenuato. Ciò indica che le cellule endoteliali non hanno avuto alcun effetto protettivo rispetto al gruppo dei cardiomiociti da soli nelle condizioni di ipossia. Tuttavia, le cellule endoteliali hanno esercitato una protezione lieve ma significativa sui cardiomiociti durante la hr. Quando la distanza tra gli strati cellulari era di un millimetro, il rilascio di LDH era anche significativamente aumentato nei cardiomiociti solo nella condizione di ipossia.Tuttavia, a differenza dell'inserto da 0,5 millimetri, l'aumento dell'LDH solo nei cardiomiociti è stato potenziato dall'HR rispetto alle sole condizioni di ipossia. Questo aumento è stato ancora più pronunciato con l'inserto di due millimetri. La concentrazione di cellule endoteliali placcate in inserti a due millimetri è stata titolata rispettivamente a 25.000, 50.000 e 100.000 cellule per inserto.è stato riscontrato che l'aumento dell'intensità delle cellule endoteliali nella co-coltura ha portato ad un'attenuazione dose-dipendente del rilascio di LDH causata da HR. Tuttavia, nessun effetto di questo tipo è stato osservato in condizioni normossiche. Questa metodologia di co-coltura non è limitata alle cellule endoteliali e ai cardiomiociti. Questi metodi dovrebbero aiutare a studiare specifiche interazioni cellula-cellula tra varie linee cellulari attraverso più organi di interesse.

Research

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