Name: development of a cell co-culture model to mimic cardiac ischemia/reperfusion in vitro
Uploaded: 2021-10-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro at JoVE.com

이 작업은 부분적으로 미국 재향 군인 사무국 생물 의학 실험실 R & D 서비스 (I01 BX003482)와 M.L.R.에 대한 기관 기금에 의해 지원되었습니다.

1. 실험 준비/도금
<ol><li>제조업체의 지침에 따라 CM 및 EC를 유지 관리합니다.<ol>
<li>두 세포주가 공급 업체에서 도착하면 해동하십시오. 신선한 배지로 세척 한 후 T25 플라스크에 접시를 넣으십시오. 세포를 구입 한 동일한 공급 업체로부터 각 세포 배양 배지를 구입하는 것이 좋습니다. 다음날 배지로 세포를 새로 고치고 합류 할 때 사용하십시오.</li>
		<li>세포 배양 인큐베이터를 21%...

<ol>
	<li>Hausenloy, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemic+conditioning+and+targeting+reperfusion+injury:+a+30+year+voyage+of+discovery.">Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery.</a> Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70 (2016).</li><li>Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+a+neglected+therapeutic+target.">Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 92-100 (2013).</li><li>Gottlieb, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+pathways+in+acute+ischemia/reperfusion+injury.">Cell death pathways in acute ischemia/reperfusion injury.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 233-238 (2011).</li><li>Colliva, A., Braga, L., Giacca, M., Zacchigna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-cardiomyocyte+crosstalk+in+heart+development+and+disease.">Endothelial cell-cardiomyocyte crosstalk in heart development and disease.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2923-2939 (2020).</li><li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cell-cell+communication+in+co-culture.">Studying cell-cell communication in co-culture.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 395-396 (2013).</li><li>Salzman, M. M., Bartos, J. A., Yannopoulos, D., Riess, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poloxamer+188+protects+isolated+adult+mouse+cardiomyocytes+from+reoxygenation+injury.">Poloxamer 188 protects isolated adult mouse cardiomyocytes from reoxygenation injury.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 8 (6), 00639 (2020).</li><li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+ischemia/reperfusion+injury.">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 298, 229-317 (2012).</li><li>Martindale, J. J., Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+of+increased+cellular+oxidative+stress+and+myocardial+ischemia+reperfusion+injury+by+directed+sarcolemma+stabilization.">Uncoupling of increased cellular oxidative stress and myocardial ischemia reperfusion injury by directed sarcolemma stabilization.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 26-37 (2014).</li><li>vander Meer, A. D., Orlova, V. V., ten Dijke, P., vanden Berg, A., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+co-cultures+of+human+endothelial+cells+and+embryonic+stem+cell-derived+pericytes+inside+a+microfluidic+device.">Three-dimensional co-cultures of human endothelial cells and embryonic stem cell-derived pericytes inside a microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 13, 3562-3568 (2013).</li><li>Bidarra, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+proliferative+modulation+of+human+mesenchymal+stem+cells+via+crosstalk+with+endothelial+cells.">Phenotypic and proliferative modulation of human mesenchymal stem cells via crosstalk with endothelial cells.</a> Stem Cell Research. 7, 186-197 (2011).</li><li>Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology.">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PloS One. 6, 25661 (2011).</li><li>Mehes, E., Mones, E., Nemeth, V., Vicsek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+motion+of+cells+mediates+segregation+and+pattern+formation+in+co-cultures.">Collective motion of cells mediates segregation and pattern formation in co-cultures.</a> PloS One. 7, 31711 (2012).</li><li>Miki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+of+co-culture+over+mono+cell+culture+in+simulating+in+vivo+environment.">The advantages of co-culture over mono cell culture in simulating in vivo environment.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 131 (3-5), 68-75 (2012).</li><li>Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-chip:+a+focus+on+compartmentalized+microdevices.">Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1211-1227 (2012).</li><li>Campbell, J., Davidenko, N., Caffarel, M., Cameron, R., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology.">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PLoS One. 6, 25661 (2011).</li><li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research.">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10, 939-956 (2010).</li></ol>

프로토콜의 중요한 단계 세포 공동 배양 모델은 심장 보호의 세포 메커니즘을 연구하기 위해 사용되어 왔습니다. 따라서 두 개의 서로 의미있는 거리를 가진 두 개의 개별 레이어를 만드는 방법은 적절한 공동 문화 모델을 개발하는 데 중요합니다. 시뮬레이션 된 IR, 즉 HR을 연구 할 때의 도전은 허혈 (저산소증) 자체뿐만 아니라 재관류 (재 산소화)가 세포 기능 장애를 악화시킨다는...

허혈성 심장 질환은 전 세계적으로 사망 및 장애의 주요 원인입니다 1,2. 그러나 재관류의 치료 과정 자체가 심근 허혈 / 재관류 (IR) 손상으로 알려진 심근 세포 사망을 유발할 수 있으며 여전히 효과적인 치료법이 없습니다3. 내피 세포 (ECs)는 파라크린 신호의 분비뿐만 아니라 세포 간 상호 작용을 통해 심근 세포 (CMs)를 보호하기 위해 제안되었습니다4.
세포 공동 배양 모델은 세포 기능 및 분화에 대한 자가분비 및/또는 파라크린 세포-세포 상호작용의 역할을 조사하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다. 공동 배양 모델 중에서, 혼합 공동 배양은 가장 간단하며, 여기서 두 가지 유형의 세포가 원하는 세포 비율5로 단일 배양 구획 내에서 직접 접촉합니다. 그러나, 세포 유형 사이의 분리된 처리와 단일 세포 유형의 하류 분석은 혼합 집단을 고려할 때 쉽게 실현 가능하지 않다.
이전의 연구에 따르면 저산소 및 허혈성 모욕은 젖산 탈수소 효소 (LDH)의 방출에 의해 측정 된 세포막의 완전성에 심각한 손상을 일으킨다. 이 부상은 재관류 손상6,7,8을 모방하여 재산소화시 악화됩니다. 현재 프로토콜의 목표는 EC의 존재가 저산소증 및 재산소화 (HR)로 인한 CM의 세포막 누출을 용량 의존적으로 감쇠시킬 수 있고 두 세포주 간의 접촉 거리를 변화시킴으로써 EC의 보호 효과를 최적화 할 수 있다는 가설을 테스트하는 것이 었습니다. 따라서 우리는 세 가지 유형의 세포 배양 삽입물과 마우스 일차 관상 동맥 내피 세포 및 성인 마우스 심근 세포를 사용했습니다. Corning, Merck Millipore 및 Greiner Bio-One이 브랜드 한 인서트를 통해 세포주 간 거리가 각각 0.5, 1.0 및 2.0mm인 세 가지 세포 배양 누화 조건을 만들 수있었습니다. 각 경우에 인서트당 100,000개의 EC를 도금하였다.
또한, 공동 배양에서 EC의 밀도가 이 모델에서 HR 손상 감쇠에 기여하는지 여부를 결정하기 위해, CMs에 의한 EC 농도와 LDH 방출 사이의 용량-반응 관계를 연구하였다. ECs는 2.0 mm 인서트에서 인서트당 각각 25,000, 50,000 및 100,000으로 플레이팅되었다.
이 보고서는 조사관이이 중요한 모델을 유리하게 사용할 수있는 단계별 접근 방식을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)</td>
			<td >Celprogen Inc</td>
			<td >11041-14</td>
			<td >Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Automated Cell Counter Countess II</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A27977</td>
			<td>Cell counting for calculating cell numbers</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bio-Safety Cabinet</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU425400</td>
			<td>Cell culture sterile hood</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6916</td>
			<td>Used for cell freezing for long term cell line storage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>Nu-5500</td>
			<td>To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37&#176;C, humidified)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Incubator Gas Tank</td>
			<td>A-L Compressed Gases</td>
			<td>UN1013</td>
			<td>Gas needed for cell culture incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts A (0.5 mm)</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>353095</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts B (1.0 mm)</td>
			<td>Millicell Millipore</td>
			<td>PIHP01250</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts C (2.0 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662640</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td>Anstel Enterprises Inc</td>
			<td>4235</td>
			<td>For cell culture plating and passaging</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Flasks T25</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>E11041-14</td>
			<td>Used for CMs regular culture, coated by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Medium Complete</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14S</td>
			<td>CMs culture complete medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14PN</td>
			<td>CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Plates 96 well</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>E11041-14-96well</td>
			<td>Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Hypoxia Cell Culture Medium</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14GFPN</td>
			<td>CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Countess cell counting chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Counting slides used for cell counter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cyquant LDH Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>C20301</td>
			<td>LDH measurement kit</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Flasks T25</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>FB012935</td>
			<td>Used for ECs regular culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Medium Complete</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>M1168</td>
			<td>ECs culture complete medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>M1168PF</td>
			<td>ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Plates 96 well</td>
			<td>Fisher Scientific (Costar)</td>
			<td>3370</td>
			<td>Used for experiments of LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6950</td>
			<td>Used for coating flasks and plates for ECs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Hypoxia Cell Culture Medium</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>GPF1168</td>
			<td>ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35011CV</td>
			<td>FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxia Chamber</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td>To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxia Chamber Flow Meter</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27311</td>
			<td>To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)</td>
			<td>A-L Compressed Gases</td>
			<td>UN1956</td>
			<td>Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TMS</td>
			<td>To observe cell condition</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>C57-6093</td>
			<td>Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NUNC 15ML CONICL Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565269</td>
			<td>For cell culture process, experiments, solution preparation etc.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NUNC 50ML CONICL Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565271</td>
			<td>For cell culture process, experiments, solution preparation etc.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>Used for cell washing during culture or experiments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plate Reader</td>
			<td>BioTek Instrument</td>
			<td>11120533</td>
			<td>Colorimetric or fluorometric plate reading</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reaction 96 Well Palte (clear no lid)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565226</td>
			<td>Used for LDH measurement plate reading</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA for CMs</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>T1509-014</td>
			<td>1 x sterile filtered and tissue culture tested</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA for ECs</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6914/0619</td>
			<td>0.25%, cell cuture-tested</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a cell co-culture model to mimic cardiac ischemia/reperfusion in vitro

허혈성 심장 질환은 전 세계적으로 사망 및 장애의 주요 원인입니다. 재관류는 허혈을 넘어 추가적인 부상을 일으킨다. 내피 세포 (ECs)는 세포 - 세포 상호 작용을 통해 재관류 손상으로부터 심근 세포 (CM)를 보호 할 수 있습니다. 공동 배양은 세포 - 세포 상호 작용의 역할을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다. 혼합 공동 배양은 가장 간단한 접근법이지만 단리 처리 및 단일 세포 유형의 하류 분석이 가능하지 않기 때문에 제한됩니다. ECs가 용량 의존적으로 CM 세포 손상을 감쇠시킬 수 있는지 여부와 두 세포주 사이의 접촉 거리를 변화시킴으로써 이러한 보호가 더욱 최적화될 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 우리는 마우스 일차 관상동맥 내피 세포와 성인 마우스 심근세포를 사용하여 0.5에서 세포간 층간 거리가 변화한 세 가지 유형의 세포 배양 삽입물을 테스트했습니다. 각각 1.0 및 2.0 mm. CMs-전용에서, 락테이트 데하이드로게나제 (LDH) 방출에 의해 평가된 바와 같은 세포 손상은 저산소증 동안 그리고 거리가 0.5 및 1.0 mm에 비해 2.0 mm일 때 재산소화 시에 유의하게 증가하였다. EC와 CM이 거의 직접 접촉했을 때 (0.5mm), 저산소증에 따른 CM의 재 산소 부상의 경미한 감쇠 만있었습니다. 공간 거리가 1.0mm일 때 이러한 감쇠가 크게 증가하였다. 2.0mm 거리에서, ECs는 저산소증과 저산소증/재산소화 둘 동안 CM 손상을 감쇠시켰으며, 이는 EC가 CM과 교차하는 데 충분한 배양 거리두기가 필요함을 나타내므로, 분비된 신호 분자가 순환하고 보호 경로를 완전히 자극할 수 있다. 우리의 연구 결과는 시뮬레이션 된 허혈 / 재관류 손상에 대한 CM 보호에서 EC의 역할을 테스트하기위한 유리한 시험관 내 모델을 제공하기 위해 EC / CM 공동 배양 공간 환경을 최적화하는 것이 필요하다는 것을 처음으로 시사합니다. 이 보고서의 목표는 조사관이이 중요한 모델을 유리하게 사용할 수있는 단계별 접근 방식을 제공하는 것입니다.

이 실험에 사용된 세 가지 유형의 삽입물(A, B, C)은 모두 0.4 μm의 동일한 기공 크기를 갖는다. 이들 사이의 유일한 차이점은 인서트-베이스 높이인데, 이는 두 공동 배양된 세포층 사이의 거리가 각각 0.5, 1.0 및 2.0mm가 되도록 허용하고(그림 3), 서로 다른 공급업체에서 온 것이라는 점입니다(자세한 내용은 재료 표 참조).
IR 손상을 시뮬레이션?...

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Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

공간 거리는 별도의 내피 및 심근 세포 세포층의 공동 배양 모델에서 저산소증 / 재 산소화 손상을 평가하는 핵심 매개 변수이며, 처음으로 공동 배양 공간 환경을 최적화하여 심근 세포 보호에서 내피 세포의 역할을 테스트하기위한 유리한 시험관 내 모델을 제공 할 필요가 있음을 시사합니다.

체외에서 심장 허혈/재관류를 모방하기 위한 세포 공동 배양 모델 개발

Ischemic heart disease is the leading cause of death and disability worldwide. Reperfusion causes additional injury beyond ischemia. Endothelial cells ...

우리의 발견은 시뮬레이션 허혈 재증식 손상에 대한 심근 세포 보호에서 내피 세포의 역할을 테스트하기위한 유리한 시험관 내 모델을 제공하기 위해 내피 세포 심근 세포 공동 배양 공간 환경을 최적화하는 것이 필요하다는 것을 시사한다. 세포 공동 배양 모델은 세포 기능 및 분화에 대한 세포-세포 상호작용의 역할을 조사하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다. 그러나, 세포 유형 간의 분리된 처리와 단일 세포 유형의 하류 분석은 혼합 공동 배양에서 쉽게 실현가능하지 않다.현재의 연구는 저산소증 재증식 손상을 유발할 수있는 의미있는 거리를 가진 두 개의 분리 된 세포층을 만들고 단일 세포 유형에 대한 결과와 효과를 연구하는 것을 목표로했습니다. 두 세포주를 모두 해동시켜 준비를 시작한다. 세포를 T25 플라스크에 플레이트한 후 신선한 배지로 세척한다.다음 날에는 배지로 세포를 새로 고치고 합류 할 때 사용하십시오. 세포 배양 배양기를 섭씨 37도에서 21%산소, 5%이산화탄소 및 74%질소로 유지한다. 가습 상태로 유지하십시오.심근세포 세포주 컨플루언시를 광학 현미경으로 추정한다. 합류성 세포 배양물을 함유하는 플라스크로부터 배지를 제거하고, 플라스크 당 삼내지 오밀리리터의 트립신-EDTA로 트립신화한다. 플라스크를 부드럽게 교반하고 섭씨 37도에서 두 분에서 5 분 동안 배양하십시오.그 후, 효소 진행을 광학 현미경으로 평가한다. 분리 후, 트립신 또는 세포 용액을 T25 플라스크 당 10 밀리리터의 배지를 함유하는 50 밀리리터 튜브에 첨가하여 트립신 용액을 불활성화시킨다. 세포 현탁액을 120 x g에서 2분 동안 원심분리하여 연질 세포 펠렛을 얻었다.원심분리 후, 상청액을 제거하고 펠렛을 다섯 밀리리터의 배지에 재현탁시킨다. 다음으로, 세포 계수를 수행하고 세포 생존율을 확인하십시오. 재현탁된 세포 10 마이크로리터와 트리판 블루 염료 10 마이크로리터의 분취량을 혼합한 다음, 세포 계수기를 사용하여 살아있는 세포를 계수한다.원하는 파종 밀도를 얻기 위해 세포를 신선한 일반 배지로 희석하십시오. 24-웰 플레이트를 세포외 매트릭스로 프리코트하고 플레이트 심근세포를 플레이트 바닥에 웰 당 300, 000의 시딩 밀도로 취하십시오. 하룻밤 사이에 5 % 이산화탄소로 세포를 섭씨 37도에서 유지하십시오.24시간 후, 플레이트 내피 세포를 인서트 당 100, 000의 최적 도금 밀도로 인서트에 넣는다. 내피 세포 플레이팅의 24시간 후에, 심근세포 웰 내부에 내피 세포 삽입물을 놓고 공동 배양을 개시한다. 실험을 수행하기 전에 세포를 12 내지 24시간 동안 공동배양하도록 허용한다.50 밀리리터 원뿔형 튜브에 약 25 밀리리터의 매체를 부어 저산소 매체를 준비하십시오. 공기 밀봉은 실리콘 멤브레인으로 상단을 밀봉하고 멸균 된 피펫을 사용하여 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 다른 구멍을 만들고 피펫의 약 2/3을 미디어에 잠깁니다.배지를 분당 30리터의 유속으로 5분 동안 저산소 가스로 플러시한 다음, 부착된 세포가 포함된 24웰 플레이트 또는 배양 인서트의 배지를 버린다. 웰 당 10 % PBS의 100 마이크로 리터로 매우 부드럽게 씻고 새로 준비된 저산소 배지 500 마이크로 리터를 플레이트 또는 인서트의 각 웰에 추가하십시오. 원래의 배지를 노목산 대조군에서 포도당과 혈청을 함유하는 신선한 정상 배지로 대체하십시오.멸균 된 물로 채워진 페트리 접시를 저산소증 챔버에 넣어 챔버를 가습하십시오. 그런 다음 저산소 그룹을 포함하는 플레이트를 챔버에 넣으십시오. 저산소증 챔버를 저산소 가스로 분당 30 리터의 흐름으로 5 분 동안 플러시하십시오.그 후, 챔버를 섭씨 37도의 인큐베이터 안에 24 시간 동안 두십시오. 저산소증 후, 플레이트 또는 인서트의 오래된 배지를 버리고 포도당과 혈청이 포함 된 정상 배지 500 마이크로 리터를 플레이트의 각 벽에 첨가 한 다음 플레이트를 재관류를 모방하기 위해 두 시간 동안 정상 배양 조건 하에서 배양기 내부에 보관하십시오. 세포 배양 배지를 24-웰 플레이트에서 96-웰 플레이트로 옮긴 다음, 24-웰 플레이트의 각 웰에서 200 마이크로리터의 배지를 취하여 96-웰 플레이트의 네 웰에 균등하게 분배한다.96-웰 플레이트의 세포독성 분석 키트를 사용하여 LDH에 대한 흡광도를 측정하고 제조업체의 지침에 따라 세포 손상 정도를 확인합니다. 이 연구에서는 세 가지 유형의 삽입물을 평가했습니다. 세 인서트 모두 0.4 마이크로미터의 동일한 기공 크기를 가졌다.그들 사이의 유일한 차이점은 두 개의 공동 배양 된 세포층 사이의 거리가 0.5, 1.0 및 2.0 밀리미터가되도록 허용했다. 이 프로토콜을 사용하여, 세포를 정상 산소 조건 하에서 배양한 다음, 노목성 대조군과 저산소증 그룹의 두 그룹으로 나눴다. 24시간 후, 두 그룹 모두 배지로 상쾌하고 종점 분석을 수행하기 전에 또 다른 두 시간 동안 정상 산소 조건하에서 배양하였다.심근세포 단독, 내피 세포 단독, 심근세포와 내피 세포의 공동 배양에 대한 젖산 탈수소효소 방출을 평가하는 세 가지 유형의 배양 삽입물의 비교는 노르녹시, 저산소증만, 저산소증 재산소화 조건 하에서 여기에 제시된다. 세포층 사이의 0.5 밀리미터 거리에서, 저산소증은 심근 세포가 단독으로 배양되었을 때 노르 목시아에 비해 LDH 방출을 유의하게 증가시켰다. 그러나, LDH는 저산소증 전용 그룹에 비해 저산소화 그룹에서 단지 약간 증가하였다.내피 세포와 심근 세포가 함께 공동 배양되었을 때, 저산소증 전용 조건 하에서의 LDH 방출의 증가는 감쇠되지 않았다. 이는 내피 세포가 저산소증 전용 조건하에서 심근세포 단독군에 비해 어떠한 보호 효과도 갖지 않았음을 나타낸다. 그러나, 내피 세포는 HR 동안 심근세포에 경미하지만 유의한 보호를 발휘했다. 세포층 사이의 거리가 한 밀리미터였을 때, LDH 방출은 또한 저산소증 전용 조건 하에서만 심근세포에서 유의하게 증가하였다.그러나, 0.5 밀리미터 삽입물에서와 달리, 심근세포의 LDH 증가는 저산소증 전용 조건에 걸쳐 HR에 의해서만 강화되었다. 이 증가는 두 밀리미터 인서트로 더욱 두드러졌습니다. 2밀리미터 인서트에 플레이팅된 내피 세포의 농도를 인서트 당 각각 25, 000, 50, 000 및 100, 000 세포로 적정하였다.공동 배양물에서 내피 세포 강도의 증가가 HR에 의한 LDH 방출의 용량 의존적 감쇠를 유도한다는 것이 발견되었다. 그러나 규범 적 조건 하에서는 그러한 효과가 나타나지 않았습니다. 이러한 공동-배양 방법론은 내피 세포 및 심근세포에 한정되지 않는다. 이러한 방법은 관심의 여러 기관에 걸쳐 다양한 세포주 사이의 특정 세포 - 세포 상호 작용의 조사를 원조해야한다.

Research

JoVE Journal

Biology

Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

연구

생물학

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

다중 구획 CNS 뉴런 - glia 공동 문화 Microfluidic 플랫폼

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

인간 배아의 내피 세포 공동 배양 Mediates의 성숙은 감독 차별화 접근법에서 췌장 인슐린 생산 세포로 세포를 줄기

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

세 가지 차원 혼합 셀 회전 타원체 공동 문화에서 Mammary 상피 세포의 분리

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Blastomere Explants는 배아 개발하는 동안 세포 운명의 헌신에 대해 테스트 할

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

주변 줄기 세포 이주의 분석을위한 마우스 Cremaster 근육에있는 미세 혈관의의 intravital 현미경

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

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허혈 / 재관류에 대한 산소 결핍 - 기아 모델<em&gt; C. 엘레</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

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분리 및 문화 성인 마우스 세포 신호 전달 용의 Cardiomyocytes과의<em&gt; 시험관</em&gt; 심장 비대

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

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체외 합성에 인간의 세포에서 단백질 발현 유도의 mRNA를 수정의

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

마우스 모델의 유효성 검사는 세포 고유의 방식으로 LINC 단지를 방해

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...