Name: development of a cell co-culture model to mimic cardiac ischemia/reperfusion in vitro
Uploaded: 2021-10-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis støttet av us Department of Veterans Affairs Biomedical Laboratory R&D Service (I01 BX003482) og av institusjonelle midler til M.L.R.

1. Eksperimentell forberedelse/plating
<ol><li>Vedlikehold CMer og ECer i henhold til produsentens instruksjoner.<ol>
<li>Tine begge cellelinjene når de kommer fra leverandører. Plate i T25 kolber etter å ha blitt vasket med friske medier. Det anbefales å kjøpe hvert cellekulturmedie fra de samme leverandørene som cellene ble kjøpt fra. Neste dag oppdaterer du cellene med medier og bruker dem sammen.</li>
		<li>Vedlikehold cellekulturinkubatoren ved 37 °C med 21 % O2, 5 % CO2</s...

<ol>
	<li>Hausenloy, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemic+conditioning+and+targeting+reperfusion+injury:+a+30+year+voyage+of+discovery.">Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery.</a> Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70 (2016).</li><li>Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+a+neglected+therapeutic+target.">Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 92-100 (2013).</li><li>Gottlieb, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+pathways+in+acute+ischemia/reperfusion+injury.">Cell death pathways in acute ischemia/reperfusion injury.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 233-238 (2011).</li><li>Colliva, A., Braga, L., Giacca, M., Zacchigna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-cardiomyocyte+crosstalk+in+heart+development+and+disease.">Endothelial cell-cardiomyocyte crosstalk in heart development and disease.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2923-2939 (2020).</li><li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cell-cell+communication+in+co-culture.">Studying cell-cell communication in co-culture.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 395-396 (2013).</li><li>Salzman, M. M., Bartos, J. A., Yannopoulos, D., Riess, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poloxamer+188+protects+isolated+adult+mouse+cardiomyocytes+from+reoxygenation+injury.">Poloxamer 188 protects isolated adult mouse cardiomyocytes from reoxygenation injury.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 8 (6), 00639 (2020).</li><li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+ischemia/reperfusion+injury.">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 298, 229-317 (2012).</li><li>Martindale, J. J., Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+of+increased+cellular+oxidative+stress+and+myocardial+ischemia+reperfusion+injury+by+directed+sarcolemma+stabilization.">Uncoupling of increased cellular oxidative stress and myocardial ischemia reperfusion injury by directed sarcolemma stabilization.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 26-37 (2014).</li><li>vander Meer, A. D., Orlova, V. V., ten Dijke, P., vanden Berg, A., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+co-cultures+of+human+endothelial+cells+and+embryonic+stem+cell-derived+pericytes+inside+a+microfluidic+device.">Three-dimensional co-cultures of human endothelial cells and embryonic stem cell-derived pericytes inside a microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 13, 3562-3568 (2013).</li><li>Bidarra, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+proliferative+modulation+of+human+mesenchymal+stem+cells+via+crosstalk+with+endothelial+cells.">Phenotypic and proliferative modulation of human mesenchymal stem cells via crosstalk with endothelial cells.</a> Stem Cell Research. 7, 186-197 (2011).</li><li>Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology.">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PloS One. 6, 25661 (2011).</li><li>Mehes, E., Mones, E., Nemeth, V., Vicsek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+motion+of+cells+mediates+segregation+and+pattern+formation+in+co-cultures.">Collective motion of cells mediates segregation and pattern formation in co-cultures.</a> PloS One. 7, 31711 (2012).</li><li>Miki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+of+co-culture+over+mono+cell+culture+in+simulating+in+vivo+environment.">The advantages of co-culture over mono cell culture in simulating in vivo environment.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 131 (3-5), 68-75 (2012).</li><li>Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-chip:+a+focus+on+compartmentalized+microdevices.">Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1211-1227 (2012).</li><li>Campbell, J., Davidenko, N., Caffarel, M., Cameron, R., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology.">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PLoS One. 6, 25661 (2011).</li><li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research.">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10, 939-956 (2010).</li></ol>

Kritiske trinn i protokollen Cellekokulturmodeller har blitt brukt til å studere cellulære mekanismer for kardiobeskyttelse. Hvordan lage to separate lag med en meningsfull avstand mellom dem er derfor avgjørende for utviklingen av en passende samkulturmodell. En utfordring med å studere simulert IR, det vil si HR, skade er at ikke bare iskemi (hypoksi) selv, men også reperfusjon (reoksygenering) forverrer cellulær dysfunksjon. Derfor må en realistisk modell reflektere disse egenskapene ved for...

Iskemisk hjertesykdom er den ledende dødsårsaken og funksjonshemmingen over hele verden 1,2. Imidlertid kan behandlingsprosessen for reperfusjon selv forårsake kardiomyocyttdød, kjent som myokardisk iskemi / reperfusjonsskade (IR), som det fortsatt ikke er noe effektivt middel3 for. Endotelceller (ECs) har blitt foreslått å beskytte kardiomyocytter (CMs) gjennom sekresjon av parakrine signaler, samt celle-til-celle interaksjoner4.
Cellekokulturmodeller har blitt brukt mye for å undersøke rollen som autocrine og / eller parakrine cellecelleinteraksjoner på cellefunksjon og differensiering. Blant samkulturmodeller er blandet samkultur den enkleste, der to forskjellige typer celler er i direkte kontakt i et enkelt kulturrom med ønsket celleforhold5. Separate behandlinger mellom celletyper og nedstrømsanalyse av en enkelt celletype er imidlertid ikke lett mulig gitt den blandede populasjonen.
Tidligere studier indikerte at hypoksiske og iskemiske fornærmelser forårsaker betydelig skade på integriteten til cellemembranen målt ved frigjøring av laktatdehydrogenase (LDH). Denne skaden forverres ved reoksygenering, og etterligner reperfusjonsskade 6,7,8. Målet med den nåværende protokollen var å teste hypotesene om at tilstedeværelsen av ECs kan doseavhengig dempe cellemembranlekkasje av CMs forårsaket av hypoksi og reoksygenering (HR) og at den beskyttende effekten av ECs kan optimaliseres ved å variere kontaktavstanden mellom de to cellelinjene. Dermed brukte vi tre typer cellekulturinnlegg og Mus Primær Koronar Arterie Endotelceller og Voksen Mus Kardiomyocytter. Innsatsene, merket av Corning, Merck Millipore og Greiner Bio-One tillot oss å lage tre forskjellige cellekultur-krysstaleforhold med intercellede linjeavstander på henholdsvis 0,5, 1,0 og 2,0 mm. 100 000 ECer ble belagt per innsats i hvert tilfelle.
For å finne ut om tettheten av ECs i samkultur bidrar til HR-skadedemping i denne modellen, studerte vi doseresponsforholdet mellom EC-konsentrasjon og LDH-frigjøring av CMs. ECs ble belagt med henholdsvis 25.000, 50.000 og 100.000 per innsats.
Denne rapporten gir en trinnvis tilnærming for etterforskere til å bruke denne viktige modellen til sin fordel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)</td>
			<td >Celprogen Inc</td>
			<td >11041-14</td>
			<td >Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Automated Cell Counter Countess II</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A27977</td>
			<td>Cell counting for calculating cell numbers</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bio-Safety Cabinet</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU425400</td>
			<td>Cell culture sterile hood</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6916</td>
			<td>Used for cell freezing for long term cell line storage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>Nu-5500</td>
			<td>To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37&#176;C, humidified)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Incubator Gas Tank</td>
			<td>A-L Compressed Gases</td>
			<td>UN1013</td>
			<td>Gas needed for cell culture incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts A (0.5 mm)</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>353095</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts B (1.0 mm)</td>
			<td>Millicell Millipore</td>
			<td>PIHP01250</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts C (2.0 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662640</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td>Anstel Enterprises Inc</td>
			<td>4235</td>
			<td>For cell culture plating and passaging</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Flasks T25</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>E11041-14</td>
			<td>Used for CMs regular culture, coated by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Medium Complete</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14S</td>
			<td>CMs culture complete medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14PN</td>
			<td>CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Plates 96 well</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>E11041-14-96well</td>
			<td>Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Hypoxia Cell Culture Medium</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14GFPN</td>
			<td>CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Countess cell counting chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Counting slides used for cell counter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cyquant LDH Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>C20301</td>
			<td>LDH measurement kit</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Flasks T25</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>FB012935</td>
			<td>Used for ECs regular culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Medium Complete</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>M1168</td>
			<td>ECs culture complete medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>M1168PF</td>
			<td>ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Plates 96 well</td>
			<td>Fisher Scientific (Costar)</td>
			<td>3370</td>
			<td>Used for experiments of LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6950</td>
			<td>Used for coating flasks and plates for ECs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Hypoxia Cell Culture Medium</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>GPF1168</td>
			<td>ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35011CV</td>
			<td>FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxia Chamber</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td>To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxia Chamber Flow Meter</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27311</td>
			<td>To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)</td>
			<td>A-L Compressed Gases</td>
			<td>UN1956</td>
			<td>Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TMS</td>
			<td>To observe cell condition</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>C57-6093</td>
			<td>Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NUNC 15ML CONICL Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565269</td>
			<td>For cell culture process, experiments, solution preparation etc.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NUNC 50ML CONICL Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565271</td>
			<td>For cell culture process, experiments, solution preparation etc.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>Used for cell washing during culture or experiments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plate Reader</td>
			<td>BioTek Instrument</td>
			<td>11120533</td>
			<td>Colorimetric or fluorometric plate reading</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reaction 96 Well Palte (clear no lid)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565226</td>
			<td>Used for LDH measurement plate reading</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA for CMs</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>T1509-014</td>
			<td>1 x sterile filtered and tissue culture tested</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA for ECs</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6914/0619</td>
			<td>0.25%, cell cuture-tested</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a cell co-culture model to mimic cardiac ischemia/reperfusion in vitro

Iskemisk hjertesykdom er den ledende årsaken til død og funksjonshemming over hele verden. Reperfusjon forårsaker ytterligere skade utover iskemi. Endotelceller (ECer) kan beskytte kardiomyocytter (CMs) mot reperfusjonsskade gjennom cellecelleinteraksjoner. Samkulturer kan bidra til å undersøke rollen som cellecelleinteraksjoner. En blandet samkultur er den enkleste tilnærmingen, men er begrenset ettersom isolerte behandlinger og nedstrømsanalyser av enkeltcelletyper ikke er gjennomførbare. For å undersøke om ECer kan doseavhengig dempe CM-celleskade og om denne beskyttelsen kan optimaliseres ytterligere ved å variere kontaktavstanden mellom de to cellelinjene, brukte vi Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells og Adult Mouse Cardiomyocytes for å teste tre typer cellekulturinnlegg som varierte i deres intercellede lagavstand ved 0,5, henholdsvis 1,0 og 2,0 mm. Kun ved CMs økte cellulær skade som vurdert ved laktat dehydrogenase (LDH) frigjøring betydelig under hypoksi og videre ved reoksygenering når avstanden var 2,0 mm sammenlignet med 0,5 og 1,0 mm. Når ECs og CMs var i nesten direkte kontakt (0,5 mm), var det bare en mild demping av reoksygeneringsskaden til CMs etter hypoksi. Denne dempingen ble betydelig økt når den romlige avstanden var 1,0 mm. Med 2,0 mm avstand svekket ECs CM-skade under både hypoksi og hypoksi/reoksygenering, noe som indikerer at tilstrekkelig kulturavstand er nødvendig for at ECs skal krysstale med CMs, slik at utskilte signalmolekyler kan sirkulere og fullt stimulere beskyttende veier. Våre funn tyder for første gang på at optimalisering av det romlige miljøet i EC/CM-kokulturen er nødvendig for å gi en gunstig in vitro-modell for å teste ECs rolle i CM-beskyttelse mot simulert iskemi/reperfusjonsskade. Målet med denne rapporten er å gi en trinnvis tilnærming for etterforskere å bruke denne viktige modellen til sin fordel.

Alle tre typer innsatser (A, B, C) som brukes i dette eksperimentet har samme porestørrelse på 0,4 μm. Den eneste forskjellen mellom dem er innsats-til-grunn-høyden, som gjør at avstandene mellom de to samkulturerte cellelagene er henholdsvis 0,5, 1,0 og 2,0 mm (figur 3) og at de er fra forskjellige leverandører (for detaljer se Tabell over materialer).
For å etablere en in vitro-samkulturmodell med separate lag med to cellelinjer ...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro at JoVE.com

Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

Romlig avstand er en nøkkelparameter for å vurdere hypoksi / reoksygeneringsskade i en samkulturmodell av separate endotel- og kardiomyocyttcellelag, noe som for første gang antyder at optimalisering av samkulturens romlige miljø er nødvendig for å gi en gunstig in vitro-modell for å teste rollen som endotelceller i kardiomyocyttbeskyttelse.

Utvikling av en celle co-kultur modell for å etterligne hjerte iskemi / reperfusjon in vitro

Ischemic heart disease is the leading cause of death and disability worldwide. Reperfusion causes additional injury beyond ischemia. Endothelial cells ...

Vårt funn antyder at optimalisering av endotelcellen kardiomyocytt samkulturelt romlig miljø er nødvendig for å gi en gunstig in vitro-modell for å teste rollen som endotelceller i kardiomyocyttbeskyttelse mot simulert iskemi reprofusjonsskade. Cellekokulturmodeller har blitt brukt mye for å undersøke rollen som cellecelleinteraksjoner på cellefunksjon og differensiering. Imidlertid er separate behandlinger mellom celletyper og nedstrømsanalyse av en enkelt celletype ikke lett mulig i den blandede samkulturen.Den nåværende studien hadde som mål å lage to separate cellelag med en meningsfull avstand mellom dem der man kan indusere hypoksi reprofusjonsskade og studere resultatet og effektene på en enkelt celletype. Begynn forberedelsen ved å tine begge cellelinjene. Plate cellene i T25 kolber etter å ha vasket dem med friske medier.På neste dag oppdaterer du cellene med medier og bruker når de er sammenfallende. Oppretthold cellekulturinkubatoren ved 37 grader Celsius med 21% oksygen, 5% karbondioksid og 74% nitrogen. Hold det fuktig.Beregn kardiomyocyttenes cellelinjesamstrømning under et lysmikroskop. Fjern mediet fra kolber som inneholder konfluente cellekulturer og prøv med tre til fem milliliter trypsin-EDTA per kolbe. Rør kolben forsiktig og inkuber ved 37 grader Celsius i to til fem minutter.Deretter vurderer du den enzymatiske fremgangen under et lysmikroskop. Etter løsrivelse, deaktiver trypsinoppløsningen ved å legge til trysin eller celleoppløsning til et 50 milliliter rør som inneholder 10 milliliter medier per T25 kolbe. Sentrifuger cellefjæringen ved 120 x g i to minutter for å få en myk cellepellet.Etter sentrifugering, fjern supernatanten og resuspend pellet i fem milliliter av et medium. Deretter utfører du celletelling og bekrefter celle levedyktighet. Bland og aliquot av 10 mikroliter resuspended celler og 10 mikroliter trypan blå fargestoff, og tell deretter levende celler ved hjelp av en celleteller.Fortynn cellene med friske vanlige medier for å oppnå ønsket såing tettheter. Ta en 24-brønns plate forbelegg den med ekstracellulær matrise og plate kardiomyocytter ved såddtettheter på 300.000 per brønn på bunnen av platen. Oppretthold cellene ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid over natten.Etter 24 timer settes plate endotelceller inn i innsatser med en optimal beleggtetthet på 100 000 per innsats. Etter 24 timer med endotelcellebelegg setter du endotelcelleinnlegg inne i kardiomyocyttbrønnene og initierer samkultur. Tillat celler å samkulturere i 12 til 24 timer før du utfører forsøkene.Forbered hypoksiske medier ved å helle ca 25 milliliter medier i et 50 milliliter konisk rør. Lufttetning av toppen med en silikonmembran og bruk en sterilisert pipette for å slå et hull. Deretter oppretter du et nytt hull og etterlater omtrent 2/3 av pipettene nedsenket i mediet.Skyll mediet med hypoksisk gass i fem minutter med en strømningshastighet på 30 liter per minutt, og kast deretter mediet til de 24-brønnsplatene eller kulturinnleggene som inneholder vedlagte celler. Vask dem veldig forsiktig med 100 mikroliter på 10% PBS per brønn tilsett 500 mikroliter av de nylagde hypoksiske mediene til hver brønn av platene eller innsatsene. Erstatt det opprinnelige mediet med friske normale medier som inneholder glukose og serum i den normoksiske kontrollgruppen.Legg en Petri-tallerken fylt med sterilt vann i hypoksikammeret for å fukte kammeret. Plasser deretter platene som inneholder de hypoksiske gruppene inn i kammeret. Skyll hypoksikammeret med hypoksisk gass i fem minutter med en strøm på 30 liter per minutt.Deretter plasserer du kammeret inne i en inkubator ved 37 grader Celsius i 24 timer. Etter hypoksi, kast det gamle mediet av platene eller innsatsene og legg til 500 mikroliter normale medier som inneholder glukose og serum til hver vegg av platene, og lagre deretter platene inne i en inkubator under normale kulturforhold i to timer for å etterligne reperfusjon. Overfør cellekulturmediene fra 24-brønnsplaten til en 96-brønnsplate, ta deretter 200 mikroliter medier fra hver brønn på 24-brønnsplaten og fordeles likt i fire brønner på 96-brønnsplaten.Mål absorbansen for LDH ved hjelp av et cytotoksisitetsanalysesett i en 96-brønnsplate og følg produsentens instruksjoner for å bestemme graden av cellulær skade. I denne studien ble tre typer innsatser evaluert. Alle tre innsatsene hadde samme porestørrelse på 0,4 mikrometer.Den eneste forskjellen mellom dem var innsatsen til grunnhøyde, slik at avstandene mellom de to samkulturerte cellelagene var 0,5, 1,0 og 2,0 millimeter. Ved hjelp av denne protokollen ble celler dyrket under normale oksygenforhold og deretter delt inn i to grupper en normoksisk kontrollgruppe og hypoksigruppen. Etter 24 timer ble begge gruppene oppdatert med media og dyrket under normale oksygenforhold i ytterligere to timer før de gjennomførte endepunktanalysene.En sammenligning av de tre typer kulturinnlegg i vurderingen av laktat dehydrogenase frigjøring for kardiomyocytt alene, endotelceller alene, og co-kultur av kardiomyocytt med endotelceller er vist her under normoksiske, hypoksi bare, og hypoksi reoksygeneringsforhold. Med en avstand på 0,5 millimeter mellom cellelagene førte hypoksi til en betydelig økt LDH-frigjøring sammenlignet med normoksi når kardiomyocytter ble dyrket alene. Imidlertid ble LDH bare økt litt i hypoksi reoksygeneringsgruppen sammenlignet med hypoksi bare gruppen.Når endotelceller og kardiomyocytter ble samkulturert sammen, ble økningen av LDH-frigjøring under hypoksi bare forhold ikke svekket. Dette indikerer at endotelcellene ikke hadde noen beskyttende effekt sammenlignet med kardiomyocyttene alene-gruppen under hypoksi bare forhold. Endotelceller utøvde imidlertid mild, men betydelig beskyttelse på kardiomyocytter under HR. Når avstanden mellom cellelagene var en millimeter, ble LDH-frigjøringen også betydelig økt i kardiomyocytter bare under hypoksi bare tilstand.Men i motsetning til i 0,5 millimeter innsatsen, ble LDH-økningen i kardiomyocytter bare forsterket av HR over hypoksi bare forhold. Denne økningen var enda tydeligere med de to millimeterne satt inn. Konsentrasjonen av endotelceller belagt i to millimeter innsatser ble titrert til henholdsvis 25.000, 50.000 og 100.000 celler per innsats.det ble funnet at økende endotelcelleintensitet i samkulturen førte til en doseavhengig demping av LDH-frigjøring forårsaket av HR. Imidlertid ble ingen slik effekt sett under normoksiske forhold. Denne co-kultur metodikken er ikke begrenset til endotelceller og kardiomyocytter. Disse metodene bør bidra til en undersøkelse av spesifikke cellecelleinteraksjoner blant varierte cellelinjer på tvers av flere organer av interesse.

Research

JoVE Journal

Biology

Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

Endotelcelle Co-kulturen formidler Modning av Human embryonale stamceller til Bukspyttkjertelen insulinproduserende celler i en Regissert Differensiering Approach

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

Isolering av brystkjertelen Epitelceller fra Tredimensjonal Mikset celle Spheroid Co, kultur

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Blastomere explants å teste for Cell Fate Commitment under embryonal utvikling

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

Intramikroskopi av mikrosirkulasjonen i mus Cremaster Muscle for analyse av perifer stamcelle Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

En Anoksi-sult Modell for iskemi / Reperfusjon i<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolasjon og kultur av voksne musen Cardiomyocytes for Cell Signaling og<em&gt; In vitro</em&gt; Cardiac Hypertrofi

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Syntese av Modified mRNA for Induksjon av Protein Expression i humane celler

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Validering av en musemodell for å forstyrre LINC Komplekser i en celle-spesifikk Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...