Name: development of a cell co-culture model to mimic cardiac ischemia/reperfusion in vitro
Uploaded: 2021-10-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro at JoVE.com

Эта работа была поддержана, в частности, Службой исследований и разработок биомедицинской лаборатории Министерства по делам ветеранов США (I01 BX003482) и институциональными фондами M.L.R.

1. Экспериментальная подготовка/покрытие
<ol><li>Обслуживайте CM и EC в соответствии с инструкциями производителя.<ol>
<li>Оттаивайте обе клеточные линии, когда они поступают от поставщиков. Пластина в колбах Т25 после промывки свежей средой. Рекомендуется приобретать каждую среду дл?...

<ol>
	<li>Hausenloy, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemic+conditioning+and+targeting+reperfusion+injury:+a+30+year+voyage+of+discovery.">Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery.</a> Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70 (2016).</li><li>Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+a+neglected+therapeutic+target.">Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 92-100 (2013).</li><li>Gottlieb, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+pathways+in+acute+ischemia/reperfusion+injury.">Cell death pathways in acute ischemia/reperfusion injury.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 233-238 (2011).</li><li>Colliva, A., Braga, L., Giacca, M., Zacchigna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-cardiomyocyte+crosstalk+in+heart+development+and+disease.">Endothelial cell-cardiomyocyte crosstalk in heart development and disease.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2923-2939 (2020).</li><li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cell-cell+communication+in+co-culture.">Studying cell-cell communication in co-culture.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 395-396 (2013).</li><li>Salzman, M. M., Bartos, J. A., Yannopoulos, D., Riess, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poloxamer+188+protects+isolated+adult+mouse+cardiomyocytes+from+reoxygenation+injury.">Poloxamer 188 protects isolated adult mouse cardiomyocytes from reoxygenation injury.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 8 (6), 00639 (2020).</li><li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+ischemia/reperfusion+injury.">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 298, 229-317 (2012).</li><li>Martindale, J. J., Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+of+increased+cellular+oxidative+stress+and+myocardial+ischemia+reperfusion+injury+by+directed+sarcolemma+stabilization.">Uncoupling of increased cellular oxidative stress and myocardial ischemia reperfusion injury by directed sarcolemma stabilization.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 26-37 (2014).</li><li>vander Meer, A. D., Orlova, V. V., ten Dijke, P., vanden Berg, A., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+co-cultures+of+human+endothelial+cells+and+embryonic+stem+cell-derived+pericytes+inside+a+microfluidic+device.">Three-dimensional co-cultures of human endothelial cells and embryonic stem cell-derived pericytes inside a microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 13, 3562-3568 (2013).</li><li>Bidarra, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+proliferative+modulation+of+human+mesenchymal+stem+cells+via+crosstalk+with+endothelial+cells.">Phenotypic and proliferative modulation of human mesenchymal stem cells via crosstalk with endothelial cells.</a> Stem Cell Research. 7, 186-197 (2011).</li><li>Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology.">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PloS One. 6, 25661 (2011).</li><li>Mehes, E., Mones, E., Nemeth, V., Vicsek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+motion+of+cells+mediates+segregation+and+pattern+formation+in+co-cultures.">Collective motion of cells mediates segregation and pattern formation in co-cultures.</a> PloS One. 7, 31711 (2012).</li><li>Miki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+of+co-culture+over+mono+cell+culture+in+simulating+in+vivo+environment.">The advantages of co-culture over mono cell culture in simulating in vivo environment.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 131 (3-5), 68-75 (2012).</li><li>Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-chip:+a+focus+on+compartmentalized+microdevices.">Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1211-1227 (2012).</li><li>Campbell, J., Davidenko, N., Caffarel, M., Cameron, R., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology.">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PLoS One. 6, 25661 (2011).</li><li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research.">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10, 939-956 (2010).</li></ol>

Критические шаги в протоколе Модели клеточной кокультуры были использованы для изучения клеточных механизмов кардиопротекции. Таким образом, способ создания двух отдельных слоев со значимым расстоянием между ними имеет решающее значение для разработки подходящей модели ?...

Ишемическая болезнь сердца является основной причиной смерти и инвалидности во всем мире 1,2. Тем не менее, процесс лечения реперфузии сам по себе может вызвать гибель кардиомиоцитов, известную как травма ишемии / реперфузии миокарда (ИК), для которой до сих пор нет эффективного средства3. Было предложено, чтобы эндотелиальные клетки (ЭК) защищали кардиомиоциты (КМ) посредством секреции паракринных сигналов, а также межклеточных взаимодействий4.
Модели клеточных кокультур широко использовались для исследования роли аутокринных и/или паракринных клеточно-клеточных взаимодействий в функции и дифференцировке клеток. Среди кокультурных моделей смешанная кокультура является самой простой, где два разных типа клеток находятся в прямом контакте в пределах одного культурального отсека при желаемом соотношении клеток5. Тем не менее, раздельное лечение между типами клеток и последующий анализ одного типа клеток неосуществимы, учитывая смешанную популяцию.
Предыдущие исследования показали, что гипоксические и ишемические инсульты вызывают значительное повреждение целостности клеточной мембраны, измеряемое высвобождением лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Эта травма усугубляется при реоксигенации, имитируя реперфузионную травму 6,7,8. Целью текущего протокола была проверка гипотез о том, что присутствие EC может дозозависимо ослаблять утечку CM клеточной мембраны, вызванную гипоксией и реоксигенацией (HR), и что защитный эффект EC может быть оптимизирован путем изменения расстояния контакта между двумя клеточными линиями. Таким образом, мы использовали три типа вставок клеточной культуры: эндотелиальные клетки первичной коронарной артерии мыши и кардиомиоциты взрослых мышей. Вставки под брендом Corning, Merck Millipore и Greiner Bio-One позволили нам создать три различных условия перекрестных помех клеточной культуры с расстояниями между клеточными линиями 0,5, 1,0 и 2,0 мм соответственно. В каждом случае на каждую вставку было нанесено 100 000 ЭК.
Кроме того, чтобы определить, способствует ли плотность ЭК в кокультуре ослаблению повреждения ЧСС в этой модели, мы изучили зависимость доза-реакция между концентрацией ЕС и высвобождением НРС КМ. ЭК были покрыты на 25 000, 50 000 и 100 000 на вставку, соответственно, во вставке 2,0 мм.
В этом отчете представлен поэтапный подход для исследователей, чтобы использовать эту важную модель в своих интересах.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)</td>
			<td >Celprogen Inc</td>
			<td >11041-14</td>
			<td >Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Automated Cell Counter Countess II</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A27977</td>
			<td>Cell counting for calculating cell numbers</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bio-Safety Cabinet</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU425400</td>
			<td>Cell culture sterile hood</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6916</td>
			<td>Used for cell freezing for long term cell line storage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>Nu-5500</td>
			<td>To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37&#176;C, humidified)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Incubator Gas Tank</td>
			<td>A-L Compressed Gases</td>
			<td>UN1013</td>
			<td>Gas needed for cell culture incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts A (0.5 mm)</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>353095</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts B (1.0 mm)</td>
			<td>Millicell Millipore</td>
			<td>PIHP01250</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts C (2.0 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662640</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td>Anstel Enterprises Inc</td>
			<td>4235</td>
			<td>For cell culture plating and passaging</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Flasks T25</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>E11041-14</td>
			<td>Used for CMs regular culture, coated by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Medium Complete</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14S</td>
			<td>CMs culture complete medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14PN</td>
			<td>CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Plates 96 well</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>E11041-14-96well</td>
			<td>Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Hypoxia Cell Culture Medium</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14GFPN</td>
			<td>CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Countess cell counting chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Counting slides used for cell counter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cyquant LDH Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>C20301</td>
			<td>LDH measurement kit</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Flasks T25</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>FB012935</td>
			<td>Used for ECs regular culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Medium Complete</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>M1168</td>
			<td>ECs culture complete medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>M1168PF</td>
			<td>ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Plates 96 well</td>
			<td>Fisher Scientific (Costar)</td>
			<td>3370</td>
			<td>Used for experiments of LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6950</td>
			<td>Used for coating flasks and plates for ECs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Hypoxia Cell Culture Medium</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>GPF1168</td>
			<td>ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35011CV</td>
			<td>FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxia Chamber</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td>To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxia Chamber Flow Meter</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27311</td>
			<td>To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)</td>
			<td>A-L Compressed Gases</td>
			<td>UN1956</td>
			<td>Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TMS</td>
			<td>To observe cell condition</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>C57-6093</td>
			<td>Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NUNC 15ML CONICL Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565269</td>
			<td>For cell culture process, experiments, solution preparation etc.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NUNC 50ML CONICL Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565271</td>
			<td>For cell culture process, experiments, solution preparation etc.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>Used for cell washing during culture or experiments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plate Reader</td>
			<td>BioTek Instrument</td>
			<td>11120533</td>
			<td>Colorimetric or fluorometric plate reading</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reaction 96 Well Palte (clear no lid)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565226</td>
			<td>Used for LDH measurement plate reading</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA for CMs</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>T1509-014</td>
			<td>1 x sterile filtered and tissue culture tested</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA for ECs</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6914/0619</td>
			<td>0.25%, cell cuture-tested</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a cell co-culture model to mimic cardiac ischemia/reperfusion in vitro

Ишемическая болезнь сердца является основной причиной смерти и инвалидности во всем мире. Реперфузия вызывает дополнительные травмы, помимо ишемии. Эндотелиальные клетки (ЭК) могут защищать кардиомиоциты (КМ) от реперфузионного повреждения посредством клеточных взаимодействий. Кокультуры могут помочь исследовать роль клеточно-клеточных взаимодействий. Смешанная кокультура является простейшим подходом, но ограничена, поскольку изолированные методы лечения и последующие анализы отдельных типов клеток невозможны. Чтобы выяснить, могут ли ЭК дозозависимо ослаблять повреждение клеток СМ и может ли эта защита быть дополнительно оптимизирована путем изменения расстояния контакта между двумя клеточными линиями, мы использовали эндотелиальные клетки первичной коронарной артерии мыши и кардиомиоциты взрослой мыши для тестирования трех типов вставок клеточной культуры, которые варьировались в их межклеточном слое на расстоянии 0,5, 1,0 мм и 2,0 мм соответственно. При только КМ клеточное повреждение, оцениваемое высвобождением лактатдегидрогеназы (ЛДГ), значительно увеличивалось во время гипоксии и далее при реоксигенации, когда расстояние составляло 2,0 мм по сравнению с 0,5 и 1,0 мм. Когда ЭК и КМ находились в почти прямом контакте (0,5 мм), наблюдалось лишь легкое ослабление повреждения реоксигенации КМ после гипоксии. Это затухание было значительно увеличено, когда пространственное расстояние составляло 1,0 мм. С расстоянием 2,0 мм ЕС ослабляли повреждение СМ как во время гипоксии, так и гипоксии / реоксигенации, что указывает на то, что для эк необходимы достаточные культурные дистанцирования для перекрестных помех с КМ, так что секретируемые сигнальные молекулы могут циркулировать и полностью стимулировать защитные пути. Наши результаты впервые показывают, что оптимизация пространственной среды кокультуры ЕС / СМ необходима для обеспечения благоприятной модели in vitro для тестирования роли ЭК в CM-защите от моделируемой ишемии / реперфузионного повреждения. Цель настоящего доклада состоит в том, чтобы предоставить исследователям поэтапный подход к использованию этой важной модели в своих интересах.

Все три типа вставок (A, B, C), используемые в этом эксперименте, имеют одинаковый размер пор 0,4 мкм. Единственным различием между ними является высота вставки до основания, которая позволяет расстояниям между двумя совместно культивируемыми слоями клеток составлять 0,5, 1,0 и 2,0 мм соответст?...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro at JoVE.com

Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

Пространственное расстояние является ключевым параметром при оценке повреждения гипоксией/реоксигенацией в кокультурной модели отдельных эндотелиальных и кардиомиоцитарных клеточных слоев, впервые предполагая, что оптимизация пространственной среды кокультуры необходима для обеспечения благоприятной модели in vitro для тестирования роли эндотелиальных клеток в защите кардиомиоцитов.

Разработка модели клеточной кокультуры для имитации ишемии сердца/реперфузии in vitro

Ischemic heart disease is the leading cause of death and disability worldwide. Reperfusion causes additional injury beyond ischemia. Endothelial cells ...

Наши результаты показывают, что оптимизация пространственной среды кокультуры эндотелиальных клеток кардиомиоцитов необходима для обеспечения благоприятной модели in vitro для тестирования роли эндотелиальных клеток в защите кардиомиоцитов от моделируемого повреждения репрофузии ишемии. Модели клеточной кокультуры широко использовались для исследования роли клеточно-клеточных взаимодействий в функции и дифференцировке клеток. Тем не менее, раздельное лечение между типами клеток и последующий анализ одного типа клеток не всегда осуществимы в смешанной кокультуре.Текущее исследование было направлено на создание двух отдельных клеточных слоев со значимым расстоянием между ними, где можно вызвать повреждение репрофузии гипоксией и изучить результат и влияние на один тип клеток. Начните подготовку с размораживания обеих клеточных линий. Обложите ячейки колбами Т25 после промывки их свежими средами.На следующий день освежите клетки средой и используйте при слиянии. Поддерживайте инкубатор клеточных культур при температуре 37 градусов по Цельсию с 21% кислорода, 5% углекислого газа и 74% азота. Держите его увлажненным.Оцените слияние клеточных линий кардиомиоцитов под световым микроскопом. Удалите среду из колб, содержащих сливающиеся клеточные культуры, и попробуйте три-пять миллилитров трипсина-ЭДТА на колбу. Осторожно перемешайте колбу и высиживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух-пяти минут.После этого оцените ферментативный прогресс под световым микроскопом. После отслоения инактивируют раствор трипсина, добавляя тризин или клеточный раствор в 50-миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров среды на колбу T25. Центрифугируют клеточную суспензию при 120 х г в течение двух минут до получения мягкой клеточной гранулы.После центрифугирования удаляют супернатант и повторно суспендируют гранулу в пяти миллилитрах среды. Затем выполните подсчет клеток и подтвердите жизнеспособность клеток. Смешайте и аликвоту из 10 микролитров повторно суспендированных клеток и 10 микролитров трипан-синего красителя, затем подсчитайте живые клетки с помощью счетчика клеток.Разбавьте клетки свежими обычными средами для достижения желаемой плотности посева. Возьмите 24-луночную пластину, предварительно покройте ее внеклеточным матриксом и пластинчатыми кардиомиоцитами при плотности посева 300 000 на лунку на дно пластины. Поддерживайте клетки на уровне 37 градусов по Цельсию с 5% углекислого газа в течение ночи.Через 24 часа пластинчатые эндотелиальные клетки вставляют во вставки с оптимальной плотностью покрытия 100 000 на вставку. После 24 часов покрытия эндотелиальных клеток поместите вставки эндотелиальных клеток внутрь колодцев кардиомиоцитов и начните кокультуру. Позвольте клеткам совместно культивировать в течение 12-24 часов перед проведением экспериментов.Подготовьте гипоксическую среду, налив примерно 25 миллилитров среды в коническую трубку объемом 50 миллилитров. Запечатайте верхнюю часть силиконовой мембраной и используйте стерилизованную пипетку, чтобы пробить отверстие. После этого создайте еще одно отверстие и оставьте примерно 2/3 пипеток погруженными в носитель.Промывайте среду гипоксическим газом в течение пяти минут со скоростью потока 30 литров в минуту, затем выбрасывайте среду из 24-луночных пластин или культуральных вкладышей, содержащих прикрепленные ячейки. Мойте их очень аккуратно со 100 микролитрами 10% PBS на лунку, добавьте 500 микролитров свежеприготовленной гипоксической среды в каждый колодец пластин или вкладышей. Заменить исходные среды свежими нормальными средами, содержащими глюкозу и сыворотку в нормоксической контрольной группе.Поместите чашку Петри, наполненную стерильной водой, в камеру гипоксии, чтобы увлажнить камеру. Затем поместите пластины, содержащие гипоксические группы, в камеру. Промывайте гипоксическую камеру гипоксическим газом в течение пяти минут при расходе 30 литров в минуту.После этого поместите камеру внутри инкубатора при температуре 37 градусов Цельсия на 24 часа. После гипоксии отбросьте старые носители пластин или вкладышей и добавьте 500 микролитров нормальных сред, содержащих глюкозу и сыворотку, к каждой стенке пластин, затем храните пластины внутри инкубатора в нормальных условиях культивирования в течение двух часов, чтобы имитировать реперфузию. Перенесите среду клеточного культуры с 24-луночной пластины в 96-луночную пластину, затем возьмите 200 микролитров среды из каждой лунки 24-луночной пластины и равномерно распределите по четырем скважинам 96-луночной пластины.Измерьте абсорбцию ЛДГ с помощью набора для анализа цитотоксичности в 96-луночной пластине и следуйте инструкциям производителя для определения степени повреждения клеток. В этом исследовании оценивались три типа вкладышей. Все три вставки имели одинаковый размер пор 0,4 микрометра.Единственным отличием между ними была вставка до высоты основания, позволяющая расстояниям между двумя совместно культивируемыми слоями клеток составлять 0,5, 1,0 и 2,0 миллиметра. Используя этот протокол, клетки культивировали в нормальных кислородных условиях, а затем разделили на две группы: нормоксическую контрольную группу и группу гипоксии. Через 24 часа обе группы обновляли средой и культивировали в нормальных кислородных условиях еще два часа, прежде чем проводить анализы конечных точек.Сравнение трех типов культуральных вставок при оценке высвобождения лактатдегидрогеназы только для кардиомиоцитов, только эндотелиальных клеток и кокультуры кардиомиоцитов с эндотелиальными клетками показано здесь в условиях нормоксической, гипоксии и гипоксигенации. При расстоянии 0,5 миллиметра между клеточными слоями гипоксия привела к значительному увеличению высвобождения ЛДГ по сравнению с нормоксией, когда кардиомиоциты культивировались в одиночку. Тем не менее, ЛДГ был лишь незначительно повышен в группе реоксигенации гипоксии по сравнению с группой только гипоксии.Когда эндотелиальные клетки и кардиомиоциты совместно культивировали вместе, увеличение высвобождения ЛДГ только в условиях гипоксии не ослаблялось. Это указывает на то, что эндотелиальные клетки не оказывали никакого защитного эффекта по сравнению с группой кардиомиоцитов в условиях только гипоксии. Тем не менее, эндотелиальные клетки оказывали мягкую, но значительную защиту на кардиомиоциты во время ЧСС. Когда расстояние между клеточными слоями составляло один миллиметр, высвобождение ЛДГ также значительно увеличивалось в кардиомиоцитах только при условии гипоксии.Однако, в отличие от 0,5-миллиметровой вставки, увеличение ЛДГ в кардиомиоцитах потенцировалось только ЧСС над состояниями гипоксии. Это увеличение было еще более выраженным с двухмиллиметровой вставкой. Концентрацию эндотелиальных клеток, покрытых двумя миллиметровыми вставками, титровали до 25 000, 50 000 и 100 000 клеток на вставку соответственно.было установлено, что увеличение интенсивности эндотелиальных клеток в кокультуре приводило к дозозависимому ослаблению высвобождения ЛДГ, вызванному ЧСС. Однако в нормоксических условиях такого эффекта не наблюдалось. Эта методология кокультурирования не ограничивается эндотелиальными клетками и кардиомиоцитами. Эти методы должны помочь в исследовании специфических клеточных взаимодействий между различными клеточными линиями в нескольких органах, представляющих интерес.

Research

JoVE Journal

Biology

Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Нейронов и астроцитов сотрудничеству культуры Пробирной высоких Анализ содержания Нейротоксичность

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

Multi-купе ЦНС Нейрон-глии сотрудничеству культуры микрожидкостных платформы

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

Эндотелиальных клеток со-культуры посредником Созревание эмбриональных стволовых клеток человека в поджелудочной железы инсулин продуцирующих клеток в направленной дифференцировки подход

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

Выделение молочной эпителиальные клетки трехмерных смешанных клеток сфероид Co-культуры

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Бластомеров эксплантов для тестирования для сотовых приверженности судьбы во время эмбрионального развития

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

Прижизненные микроскопия микроциркуляцию в мышцах мыши Кремастер для анализа периферических стволовых клеток миграции

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Аноксия-голодание модель ишемии / реперфузии в<em&gt; С. Элеганс</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Выделение и Культура взрослой мыши кардиомиоцитов для клеточной сигнализации и<em&gt; В пробирке</em&gt; Гипертрофия сердца

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

Экстракорпоральное синтеза модифицированных мРНК для индукции экспрессии белка в клетках человека

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Валидация модели мышей, чтобы сорвать ЛИНК Комплексы в манере соты

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...