Name: development of a cell co-culture model to mimic cardiac ischemia/reperfusion in vitro
Uploaded: 2021-10-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro at JoVE.com

Detta arbete stöddes delvis av US Department of Veterans Affairs Biomedical Laboratory R&D Service (I01 BX003482) och av institutionella medel till M.L.R.

1. Experimentell beredning/plätering
<ol><li>Underhåll CM och EM enligt tillverkarens instruktioner.<ol>
<li>Tina båda cellinjerna när de kommer från leverantörer. Platta i T25-kolvar efter att ha tvättats med färska medier. Det rekommenderas att köpa varje cellodlingsmedia från samma leverantörer som cellerna köptes från. Nästa dag, uppdatera cellerna med media och använd när de är sammanflytande.</li>
		<li>Håll cellodlingsinkubatorn vid 37 °C med 21 %O2, 5 %CO2</su...

<ol>
	<li>Hausenloy, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemic+conditioning+and+targeting+reperfusion+injury:+a+30+year+voyage+of+discovery.">Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery.</a> Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70 (2016).</li><li>Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+a+neglected+therapeutic+target.">Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 92-100 (2013).</li><li>Gottlieb, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+pathways+in+acute+ischemia/reperfusion+injury.">Cell death pathways in acute ischemia/reperfusion injury.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 233-238 (2011).</li><li>Colliva, A., Braga, L., Giacca, M., Zacchigna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-cardiomyocyte+crosstalk+in+heart+development+and+disease.">Endothelial cell-cardiomyocyte crosstalk in heart development and disease.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2923-2939 (2020).</li><li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cell-cell+communication+in+co-culture.">Studying cell-cell communication in co-culture.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 395-396 (2013).</li><li>Salzman, M. M., Bartos, J. A., Yannopoulos, D., Riess, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poloxamer+188+protects+isolated+adult+mouse+cardiomyocytes+from+reoxygenation+injury.">Poloxamer 188 protects isolated adult mouse cardiomyocytes from reoxygenation injury.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 8 (6), 00639 (2020).</li><li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+ischemia/reperfusion+injury.">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 298, 229-317 (2012).</li><li>Martindale, J. J., Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+of+increased+cellular+oxidative+stress+and+myocardial+ischemia+reperfusion+injury+by+directed+sarcolemma+stabilization.">Uncoupling of increased cellular oxidative stress and myocardial ischemia reperfusion injury by directed sarcolemma stabilization.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 26-37 (2014).</li><li>vander Meer, A. D., Orlova, V. V., ten Dijke, P., vanden Berg, A., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+co-cultures+of+human+endothelial+cells+and+embryonic+stem+cell-derived+pericytes+inside+a+microfluidic+device.">Three-dimensional co-cultures of human endothelial cells and embryonic stem cell-derived pericytes inside a microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 13, 3562-3568 (2013).</li><li>Bidarra, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+proliferative+modulation+of+human+mesenchymal+stem+cells+via+crosstalk+with+endothelial+cells.">Phenotypic and proliferative modulation of human mesenchymal stem cells via crosstalk with endothelial cells.</a> Stem Cell Research. 7, 186-197 (2011).</li><li>Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology.">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PloS One. 6, 25661 (2011).</li><li>Mehes, E., Mones, E., Nemeth, V., Vicsek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+motion+of+cells+mediates+segregation+and+pattern+formation+in+co-cultures.">Collective motion of cells mediates segregation and pattern formation in co-cultures.</a> PloS One. 7, 31711 (2012).</li><li>Miki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+of+co-culture+over+mono+cell+culture+in+simulating+in+vivo+environment.">The advantages of co-culture over mono cell culture in simulating in vivo environment.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 131 (3-5), 68-75 (2012).</li><li>Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-chip:+a+focus+on+compartmentalized+microdevices.">Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1211-1227 (2012).</li><li>Campbell, J., Davidenko, N., Caffarel, M., Cameron, R., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology.">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PLoS One. 6, 25661 (2011).</li><li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research.">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10, 939-956 (2010).</li></ol>

Kritiska steg i protokollet Cellkokulturmodeller har använts för att studera cellulära mekanismer för hjärtskydd. Hur man skapar två separata lager med ett meningsfullt avstånd mellan dem är därför avgörande för utvecklingen av en lämplig samkulturmodell. En utmaning med att studera simulerad IR, dvs HR, skada är att inte bara ischemi (hypoxi) i sig utan också reperfusion (reoxygenering) förvärrar cellulär dysfunktion. Därför måste en realistisk modell återspegla dessa egenskaper...

Ischemisk hjärtsjukdom är den främsta orsaken till dödsfall och funktionshinder över hela världen 1,2. Behandlingsprocessen för reperfusion kan emellertid i sig orsaka kardiomyocytdöd, känd som myokardiell ischemi / reperfusion (IR) skada, för vilken det fortfarande inte finns något effektivt botemedel3. Endotelceller (EK) har föreslagits skydda kardiomyocyter (CM) genom utsöndring av parakrin signaler, liksom cell-till-cell-interaktioner4.
Cellodlingsmodeller har använts i stor utsträckning för att undersöka rollen av autokrina och / eller parakrina cell-cellinteraktioner på cellfunktion och differentiering. Bland samodlingsmodeller är blandad samodling den enklaste, där två olika typer av celler är i direktkontakt inom ett enda odlingsfack vid ett önskat cellförhållande5. Separata behandlingar mellan celltyper och nedströmsanalys av en enda celltyp är dock inte lätt genomförbara med tanke på den blandade populationen.
Tidigare studier visade att hypoxiska och ischemiska förolämpningar orsakar signifikant skada på cellmembranets integritet mätt genom frisättning av laktatdehydrogenas (LDH). Denna skada förvärras vid reoxygenering, som efterliknar reperfusionsskada 6,7,8. Målet med det nuvarande protokollet var att testa hypoteserna att närvaron av ECs kan dosberoende dämpa cellmembranläckage av CM orsakad av hypoxi och reoxygenering (HR) och att den skyddande effekten av ECs kan optimeras genom att variera kontaktavståndet mellan de två cellinjerna. Således använde vi tre typer av cellodlingsinsatser och mus primära kranskärlsendotelceller och vuxna muskardiomyocyter. Insatserna, märkta av Corning, Merck Millipore och Greiner Bio-One gjorde det möjligt för oss att skapa tre olika cellodlingsöverhörningsförhållanden med intercellinjeavstånd på 0,5, 1,0 respektive 2,0 mm. 100 000 EP:er pläterades per insats i varje enskilt fall.
För att avgöra om densiteten hos EC i samodling bidrar till HR-skadedämpning i denna modell studerade vi dessutom dos-responsförhållandet mellan EG-koncentration och LDH-frisättning av CM. EC-ämnen pläterades till 25 000, 50 000 respektive 100 000 per insats i 2,0 mm-insatsen.
Denna rapport ger en steg-för-steg-strategi för utredare att använda denna viktiga modell till sin fördel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)</td>
			<td >Celprogen Inc</td>
			<td >11041-14</td>
			<td >Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Automated Cell Counter Countess II</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A27977</td>
			<td>Cell counting for calculating cell numbers</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bio-Safety Cabinet</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU425400</td>
			<td>Cell culture sterile hood</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6916</td>
			<td>Used for cell freezing for long term cell line storage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>Nu-5500</td>
			<td>To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37&#176;C, humidified)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Incubator Gas Tank</td>
			<td>A-L Compressed Gases</td>
			<td>UN1013</td>
			<td>Gas needed for cell culture incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts A (0.5 mm)</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>353095</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts B (1.0 mm)</td>
			<td>Millicell Millipore</td>
			<td>PIHP01250</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts C (2.0 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662640</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td>Anstel Enterprises Inc</td>
			<td>4235</td>
			<td>For cell culture plating and passaging</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Flasks T25</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>E11041-14</td>
			<td>Used for CMs regular culture, coated by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Medium Complete</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14S</td>
			<td>CMs culture complete medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14PN</td>
			<td>CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Plates 96 well</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>E11041-14-96well</td>
			<td>Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Hypoxia Cell Culture Medium</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14GFPN</td>
			<td>CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Countess cell counting chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Counting slides used for cell counter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cyquant LDH Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>C20301</td>
			<td>LDH measurement kit</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Flasks T25</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>FB012935</td>
			<td>Used for ECs regular culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Medium Complete</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>M1168</td>
			<td>ECs culture complete medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>M1168PF</td>
			<td>ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Plates 96 well</td>
			<td>Fisher Scientific (Costar)</td>
			<td>3370</td>
			<td>Used for experiments of LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6950</td>
			<td>Used for coating flasks and plates for ECs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Hypoxia Cell Culture Medium</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>GPF1168</td>
			<td>ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35011CV</td>
			<td>FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxia Chamber</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td>To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxia Chamber Flow Meter</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27311</td>
			<td>To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)</td>
			<td>A-L Compressed Gases</td>
			<td>UN1956</td>
			<td>Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TMS</td>
			<td>To observe cell condition</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>C57-6093</td>
			<td>Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NUNC 15ML CONICL Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565269</td>
			<td>For cell culture process, experiments, solution preparation etc.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NUNC 50ML CONICL Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565271</td>
			<td>For cell culture process, experiments, solution preparation etc.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>Used for cell washing during culture or experiments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plate Reader</td>
			<td>BioTek Instrument</td>
			<td>11120533</td>
			<td>Colorimetric or fluorometric plate reading</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reaction 96 Well Palte (clear no lid)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565226</td>
			<td>Used for LDH measurement plate reading</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA for CMs</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>T1509-014</td>
			<td>1 x sterile filtered and tissue culture tested</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA for ECs</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6914/0619</td>
			<td>0.25%, cell cuture-tested</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a cell co-culture model to mimic cardiac ischemia/reperfusion in vitro

Ischemisk hjärtsjukdom är den främsta orsaken till dödsfall och funktionshinder över hela världen. Reperfusion orsakar ytterligare skada utöver ischemi. Endotelceller (ECs) kan skydda kardiomyocyter (CM) från reperfusionsskada genom cell-cellinteraktioner. Samkulturer kan hjälpa till att undersöka rollen som cell-cellinteraktioner. En blandad samodling är det enklaste tillvägagångssättet men är begränsat eftersom isolerade behandlingar och nedströms analyser av enskilda celltyper inte är möjliga. För att undersöka om ECs kan dosberoende dämpa CM-cellskador och om detta skydd kan optimeras ytterligare genom att variera kontaktavståndet mellan de två cellinjerna, använde vi Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells och Adult Mouse Cardiomyocytes för att testa tre typer av cellodlingsinsatser som varierade i deras intercellskiktavstånd vid 0,5, 1,0 respektive 2,0 mm. Endast i CM ökade cellskada enligt bedömning av laktatdehydrogenasfrisättning (LDH) signifikant under hypoxi och vidare vid reoxygenering när avståndet var 2,0 mm jämfört med 0,5 och 1,0 mm. När EG och CM var i nästan direktkontakt (0,5 mm) fanns det bara en mild dämpning av reoxygeneringsskadan hos CM efter hypoxi. Denna dämpning ökade signifikant när det rumsliga avståndet var 1,0 mm. Med 2,0 mm avstånd dämpade ECs CM-skada under både hypoxi och hypoxi / reoxygenering, vilket indikerar att tillräcklig kulturdistans är nödvändig för att ECs ska kunna överhörna med CM, så att utsöndrade signalmolekyler kan cirkulera och fullt stimulera skyddsvägar. Våra resultat tyder för första gången på att optimering av EC / CM-samkulturens rumsliga miljö är nödvändig för att tillhandahålla en gynnsam in vitro-modell för att testa EC: s roll i CM-skydd mot simulerad ischemi / reperfusionsskada. Målet med denna rapport är att tillhandahålla en steg-för-steg-strategi för utredare att använda denna viktiga modell till sin fördel.

Alla tre typer av insatser (A, B, C) som används i detta experiment har samma porstorlek på 0,4 μm. Den enda skillnaden mellan dem är insats-till-bashöjden, vilket gör att avstånden mellan de två samodlingade cellskikten kan vara 0,5, 1,0 respektive 2,0 mm (figur 3) och att de kommer från olika leverantörer (för detaljer se Materialtabell).
För att etablera en in vitro-samodlingsmodell med separata lager av två cellinjer som ...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro at JoVE.com

Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

Rumsligt avstånd är en nyckelparameter för att bedöma hypoxi / reoxygeneringsskada i en samodlingsmodell av separata endotel- och kardiomyocytcellskikt, vilket för första gången tyder på att optimering av samodlingsmiljön är nödvändig för att tillhandahålla en gynnsam in vitro-modell för att testa endotelcellernas roll i kardiomyocytskydd.

Utveckling av en cellkokulturmodell för att efterlikna hjärt ischemi / reperfusion in vitro

Ischemic heart disease is the leading cause of death and disability worldwide. Reperfusion causes additional injury beyond ischemia. Endothelial cells ...

Vårt resultat tyder på att optimering av endotelcellens kardiomyocyt samodling av rumslig miljö är nödvändig för att tillhandahålla en gynnsam in vitro-modell för att testa endotelcellernas roll i kardiomyocytskydd mot simulerad ischemiereprofusionsskada. Cellkokulturmodeller har använts i stor utsträckning för att undersöka cell-cellinteraktionernas roll på cellfunktion och differentiering. Separata behandlingar mellan celltyper och nedströmsanalys av en enda celltyp är emellertid inte lätt genomförbara i den blandade samkulturen.Den aktuella studien syftade till att skapa två separata celllager med ett meningsfullt avstånd mellan dem där man kan inducera hypoxireprofusionsskada och studera resultatet och effekterna på en enda celltyp. Börja beredningen genom att tina båda cellinjerna. Platta cellerna i T25-kolvar efter tvättning av dem med färska medier.Nästa dag, uppdatera cellerna med media och använd när de är sammanflytande. Håll cellodlingsinkubatorn vid 37 grader Celsius med 21% syre, 5% koldioxid och 74% kväve. Håll det fuktat.Uppskatta kardiomyocyternas cellinjekonfluens under ett ljusmikroskop. Ta bort mediet från kolvarna som innehåller sammanflytande cellkulturer och trypsinisera med tre till fem milliliter trypsin-EDTA per kolv. Rör kolven försiktigt och inkubera vid 37 grader Celsius i två till fem minuter.Därefter bedöma de enzymatiska framstegen under ett ljusmikroskop. Efter lossning, inaktivera trypsinlösningen genom att tillsätta trysin eller celllösning till ett 50 ml rör innehållande 10 ml media per T25-kolv. Centrifugera cellsuspensionen vid 120 x g i två minuter för att erhålla en mjukcellpellet.Efter centrifugering, ta bort supernatanten och återsuspendera pelletsen i fem milliliter av ett medium. Utför sedan cellräkning och bekräfta cellens livskraft. Blanda och alikvot av 10 mikroliter resuspenderade celler och 10 mikroliter trypanblått färgämne, räkna sedan de levande cellerna med hjälp av en cellräknare.Späd cellerna med färska regelbundna medier för att uppnå önskade sådddensiteter. Ta en 24-brunnsplatta förbelägga den med extracellulär matris och plattkardiomyocyter vid sådddensiteter på 300 000 per brunn på botten av plattan. Håll cellerna vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid över natten.Efter 24 timmar sätter plattendotelceller i insatser med en optimal pläteringsdensitet på 100 000 per insats. Efter 24 timmars endotelcellplätering, placera endotelcellsinsatser inuti kardiomyocytbrunnarna och initiera samodling. Låt celler samkulturera i 12 till 24 timmar innan experimenten utförs.Förbered det hypoxiska mediet genom att hälla cirka 25 ml media i ett 50 ml koniskt rör. Lufttätning toppen med ett silikonmembran och använd en steriliserad pipett för att stansa ett hål. Därefter skapar du ett annat hål och lämnar ungefär 2/3 av pipetterna nedsänkta i media.Spola mediet med hypoxisk gas i fem minuter med en flödeshastighet på 30 liter per minut och kassera sedan mediet från 24-brunnsplattorna eller odlingsinsatserna som innehåller bifogade celler. Tvätta dem mycket försiktigt med 100 mikroliter 10% PBS per brunn tillsätt 500 mikroliter av det nyberedda hypoxiska mediet till varje brunn på plattorna eller insatserna. Byt ut originalmediet mot färska normala medier innehållande glukos och serum i den normoxiska kontrollgruppen.Placera en petriskål fylld med sterilt vatten i hypoxikammaren för att befukta kammaren. Placera sedan plattorna som innehåller de hypoxiska grupperna i kammaren. Spola hypoxikammaren med hypoxisk gas i fem minuter vid ett flöde av 30 liter per minut.Placera sedan kammaren inuti en inkubator vid 37 grader Celsius i 24 timmar. Efter hypoxi, kassera det gamla mediet på plattorna eller insatserna och tillsätt 500 mikroliter normala medier innehållande glukos och serum till varje vägg på plattorna och förvara sedan plattorna inuti en inkubator under normala odlingsförhållanden i två timmar för att efterlikna reperfusion. Överför cellodlingsmediet från 24-brunnsplattan till en 96-brunnsplatta, ta sedan 200 mikroliter media från varje brunn på 24-brunnsplattan och jämnt fördelad i fyra brunnar på 96-brunnsplattan.Mät absorbansen för LDH med hjälp av ett cytotoxicitetsanalyskit i en 96-brunnsplatta och följ tillverkarens instruktioner för att bestämma graden av cellulär skada. I denna studie utvärderades tre typer av insatser. Alla tre insatserna hade samma porstorlek på 0,4 mikrometer.Den enda skillnaden mellan dem var insatsen till bashöjd, vilket gjorde att avstånden mellan de två samodlingade cellskikten kunde vara 0,5, 1,0 och 2,0 millimeter. Med hjälp av detta protokoll odlades celler under normala syreförhållanden och delades sedan upp i två grupper en normoxisk kontrollgrupp och hypoxigruppen. Efter 24 timmar uppdaterades båda grupperna med media och odlades under normala syreförhållanden i ytterligare två timmar innan endpointanalyserna genomfördes.En jämförelse av de tre typerna av odlingsinsatser vid bedömning av laktatdehydrogenasfrisättning för kardiomyocyt ensam, endotelceller ensam och samodling av kardiomyocyter med endotelceller visas här under normoxiska, hypoxi endast och hypoxi reoxygeneringsförhållanden. Med ett avstånd på 0,5 millimeter mellan cellskikten ledde hypoxi till en signifikant ökad LDH-frisättning jämfört med normoxi när kardiomyocyter odlades ensamma. LDH ökade dock bara något i hypoxireoxygeneringsgruppen jämfört med gruppen med endast hypoxi.När endotelceller och kardiomyocyter samodlades tillsammans dämpades inte ökningen av LDH-frisättningen under hypoxiförhållandena. Detta indikerar att endotelcellerna inte hade någon skyddande effekt jämfört med kardiomyocyterna ensamma gruppen under hypoxi endast villkor. Endotelceller utövade emellertid mildt men signifikant skydd på kardiomyocyter under HR. När avståndet mellan cellskikten var en millimeter ökade LDH-frisättningen också signifikant i kardiomyocyter endast under hypoxitillståndet.Men till skillnad från i 0,5 millimeter insatsen förstärktes LDH-ökningen av kardiomyocyter endast av HR över hypoxi endast villkor. Denna ökning var ännu mer uttalad med två millimeters insats. Koncentrationen av endotelceller pläterade i två millimeterinsatser titrerades till 25 000, 50 000 respektive 100 000 celler per insats.det visade sig att ökad endotelcellintensitet i samkulturen ledde till en dosberoende dämpning av LDH-frisättning orsakad av HR. Emellertid sågs ingen sådan effekt under normoxiska förhållanden. Denna samodlingsmetodik är inte begränsad till endotelceller och kardiomyocyter. Dessa metoder bör underlätta en undersökning av specifika cell-cellinteraktioner mellan olika cellinjer över flera organ av intresse.

Research

JoVE Journal

Biology

Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

En Neuronal och astrocyternas Co-Kultur-analys för High innehållsanalys av Neurotoxicitet

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

En flera brandceller CNS Neuron-Glia Co-kulturen mikroflödessystem plattform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

Endotelcell Co-kultur förmedlar Mognad av mänskliga embryonala stamceller att producera insulin från bukspottkörteln celler i en riktad differentiering strategi

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

Isolering av bröstepitelialceller celler från tre-dimensionell Mixed-cell sfäroid Co-kultur

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Blastomer Explantat att testa Cell Fate engagemang under embryonal utveckling

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

Intravital Mikroskopi av mikrocirkulationen i musen kremastermuskeln för analys av perifera stamcells Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

En Anoxia-svält modell för ischemi / reperfusion i<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolering och kultur i vuxen mus Cardiomyocytes för cellsignalering och<em&gt; In vitro</em&gt; Hjärthypertrofi

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In vitro Syntes av modifierade mRNA för induktion av proteinuttryck i humana celler

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Validering av en musmodell för att Disrupt LINC Anläggningar i en cell-specifik Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...