Name: development of a cell co-culture model to mimic cardiac ischemia/reperfusion in vitro
Uploaded: 2021-10-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro at JoVE.com

Bu çalışma kısmen ABD Gazi İşleri Bakanlığı Biyomedikal Laboratuvar Ar-Ge Servisi (I01 BX003482) ve M.L.R.'ye kurumsal fonlar tarafından desteklenmiştir.

1. Deneysel hazırlama/kaplama
<ol><li>CM'leri ve EC'leri üreticinin talimatlarına göre koruyun.<ol>
<li>Satıcılardan geldiklerinde her iki hücre hattını da çözün. Taze maddelerle yıkandıktan sonra T25 şişelerde plaka. Her hücre kültürü ortamının, hücrelerin satın alındığı aynı satıcılardan satın alınması önerilir. Ertesi gün, hücreleri medya ile yenileyin ve birleştiğinde kullanın.</li>
		<li>Hücre kültürü inkübatörünü %21 O2, %5 CO2, %74N...

<ol>
	<li>Hausenloy, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemic+conditioning+and+targeting+reperfusion+injury:+a+30+year+voyage+of+discovery.">Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery.</a> Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70 (2016).</li><li>Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+ischemia-reperfusion+injury:+a+neglected+therapeutic+target.">Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 92-100 (2013).</li><li>Gottlieb, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+pathways+in+acute+ischemia/reperfusion+injury.">Cell death pathways in acute ischemia/reperfusion injury.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 233-238 (2011).</li><li>Colliva, A., Braga, L., Giacca, M., Zacchigna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-cardiomyocyte+crosstalk+in+heart+development+and+disease.">Endothelial cell-cardiomyocyte crosstalk in heart development and disease.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2923-2939 (2020).</li><li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cell-cell+communication+in+co-culture.">Studying cell-cell communication in co-culture.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 395-396 (2013).</li><li>Salzman, M. M., Bartos, J. A., Yannopoulos, D., Riess, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poloxamer+188+protects+isolated+adult+mouse+cardiomyocytes+from+reoxygenation+injury.">Poloxamer 188 protects isolated adult mouse cardiomyocytes from reoxygenation injury.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 8 (6), 00639 (2020).</li><li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+ischemia/reperfusion+injury.">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 298, 229-317 (2012).</li><li>Martindale, J. J., Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+of+increased+cellular+oxidative+stress+and+myocardial+ischemia+reperfusion+injury+by+directed+sarcolemma+stabilization.">Uncoupling of increased cellular oxidative stress and myocardial ischemia reperfusion injury by directed sarcolemma stabilization.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 26-37 (2014).</li><li>vander Meer, A. D., Orlova, V. V., ten Dijke, P., vanden Berg, A., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+co-cultures+of+human+endothelial+cells+and+embryonic+stem+cell-derived+pericytes+inside+a+microfluidic+device.">Three-dimensional co-cultures of human endothelial cells and embryonic stem cell-derived pericytes inside a microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 13, 3562-3568 (2013).</li><li>Bidarra, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+proliferative+modulation+of+human+mesenchymal+stem+cells+via+crosstalk+with+endothelial+cells.">Phenotypic and proliferative modulation of human mesenchymal stem cells via crosstalk with endothelial cells.</a> Stem Cell Research. 7, 186-197 (2011).</li><li>Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology.">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PloS One. 6, 25661 (2011).</li><li>Mehes, E., Mones, E., Nemeth, V., Vicsek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+motion+of+cells+mediates+segregation+and+pattern+formation+in+co-cultures.">Collective motion of cells mediates segregation and pattern formation in co-cultures.</a> PloS One. 7, 31711 (2012).</li><li>Miki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+of+co-culture+over+mono+cell+culture+in+simulating+in+vivo+environment.">The advantages of co-culture over mono cell culture in simulating in vivo environment.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 131 (3-5), 68-75 (2012).</li><li>Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-chip:+a+focus+on+compartmentalized+microdevices.">Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1211-1227 (2012).</li><li>Campbell, J., Davidenko, N., Caffarel, M., Cameron, R., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology.">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PLoS One. 6, 25661 (2011).</li><li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research.">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10, 939-956 (2010).</li></ol>

Protokoldeki kritik adımlar Kardiyoproteksiyonun hücresel mekanizmalarını incelemek için hücre ko-kültürü modelleri kullanılmıştır. Bu nedenle, aralarında anlamlı bir mesafe olan iki ayrı katmanın nasıl oluşturulacağı, uygun bir ortak kültür modelinin geliştirilmesi için çok önemlidir. Simüle edilmiş IR, yani HR, yaralanma çalışmasındaki bir zorluk, sadece iskeminin (hipoksi) kendisinin değil, aynı zamanda reperfüzyonun (reoksijenasyon) hücresel işlev bozukluğunu...

İskemik kalp hastalığı dünya çapında önde gelen ölüm ve sakatlık nedenidir 1,2. Bununla birlikte, reperfüzyonun tedavi sürecinin kendisi, miyokard iskemisi / reperfüzyon (IR) hasarı olarak bilinen kardiyomiyosit ölümüne neden olabilir, bunun için hala etkili bir ilaç yoktur3. Endotel hücrelerinin (ECs), kardiyomiyositleri (CM'ler) parakrin sinyallerin salgılanması ve hücreden hücreye etkileşimler yoluyla koruduğu öne sürülmüştür4.
Hücre ko-kültürü modelleri, otokrin ve / veya parakrin hücre-hücre etkileşimlerinin hücre fonksiyonu ve farklılaşması üzerindeki rolünü araştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır. Ko-kültür modelleri arasında, karışık ko-kültür, iki farklı hücre tipinin, istenen hücre oranında tek bir kültür bölmesinde doğrudan temas halinde olduğu en basitolanıdır 5. Bununla birlikte, hücre tipleri arasındaki ayrı tedaviler ve tek bir hücre tipinin aşağı akış analizi, karışık popülasyon göz önüne alındığında kolayca mümkün değildir.
Önceki çalışmalar, hipoksik ve iskemik hakaretlerin, laktat dehidrogenaz (LDH) salınımı ile ölçülen hücre zarının bütünlüğünde önemli hasara neden olduğunu göstermiştir. Bu yaralanma reoksijenasyon üzerine kötüleşirve reperfüzyon hasarı 6,7,8'i taklit eder. Mevcut protokolün amacı, EC'lerin varlığının, hipoksi ve reoksijenasyonun (HR) neden olduğu CM'lerin hücre zarı sızıntısını doza bağımlı olarak azaltabileceği ve EC'lerin koruyucu etkisinin iki hücre hattı arasındaki temas mesafesinin değiştirilmesiyle optimize edilebileceği hipotezlerini test etmekti. Bu nedenle, üç tip hücre kültürü inserti ve Fare Primer Koroner Arter Endotel Hücreleri ve Yetişkin Fare Kardiyomiyositleri kullandık. Corning, Merck Millipore ve Greiner Bio-One markalı kesici uçlar, sırasıyla 0,5, 1,0 ve 2,0 mm'lik hücreler arası hat mesafelerine sahip üç farklı hücre kültürü çapraz konuşma koşulu oluşturmamızı sağladı. Her durumda kesici uç başına 100.000 ECs kaplandı.
Ek olarak, ko-kültürdeki EC'lerin yoğunluğunun bu modelde İK hasarının zayıflamasına katkıda bulunup bulunmadığını belirlemek için, CM'ler tarafından EC konsantrasyonu ve LDH salınımı arasındaki doz-yanıt ilişkisini inceledik. ECs, 2.0 mm'lik kesici uçta kesici uç başına sırasıyla 25.000, 50.000 ve 100.000 olarak kaplandı.
Bu rapor, araştırmacıların bu önemli modeli kendi avantajlarına kullanmaları için adım adım bir yaklaşım sunmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Adult Mouse Cardiomyocytes (CMs)</td>
			<td >Celprogen Inc</td>
			<td >11041-14</td>
			<td >Isolated from adult C57BL/6J mouse cardiac tissue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Automated Cell Counter Countess II</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A27977</td>
			<td>Cell counting for calculating cell numbers</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bio-Safety Cabinet</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU425400</td>
			<td>Cell culture sterile hood</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6916</td>
			<td>Used for cell freezing for long term cell line storage</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Incubator</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>Nu-5500</td>
			<td>To provide normal cell living condition (21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37&#176;C, humidified)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Incubator Gas Tank</td>
			<td>A-L Compressed Gases</td>
			<td>UN1013</td>
			<td>Gas needed for cell culture incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts A (0.5 mm)</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>353095</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts B (1.0 mm)</td>
			<td>Millicell Millipore</td>
			<td>PIHP01250</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Culture Inserts C (2.0 mm)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662640</td>
			<td>Used for EC-CM co-culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td>Anstel Enterprises Inc</td>
			<td>4235</td>
			<td>For cell culture plating and passaging</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Flasks T25</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>E11041-14</td>
			<td>Used for CMs regular culture, coated by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Medium Complete</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14S</td>
			<td>CMs culture complete medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Medium Complete Phenol free</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14PN</td>
			<td>CMs culture medium without phenol red used during LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Cell Culture Plates 96 well</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>E11041-14-96well</td>
			<td>Used for experiments of LDH measurement, coated by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CMs Hypoxia Cell Culture Medium</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>M11041-14GFPN</td>
			<td>CMs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Countess cell counting chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>Counting slides used for cell counter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cyquant LDH Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>C20301</td>
			<td>LDH measurement kit</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Flasks T25</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>FB012935</td>
			<td>Used for ECs regular culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Medium Complete</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>M1168</td>
			<td>ECs culture complete medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Medium Complete Phenol free</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>M1168PF</td>
			<td>ECs culture medium without phenol red used during LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Cell Culture Plates 96 well</td>
			<td>Fisher Scientific (Costar)</td>
			<td>3370</td>
			<td>Used for experiments of LDH measurement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Culture Gelatin-Based Coating Solution</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6950</td>
			<td>Used for coating flasks and plates for ECs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECs Hypoxia Cell Culture Medium</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>GPF1168</td>
			<td>ECs cell culture under hypoxic condition (glucose- and serum-free)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35011CV</td>
			<td>FBS-HI USDA-approved for cell culture and maintenance</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxia Chamber</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td>To create a hypoxic condition with 0.01%O2 environment</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxia Chamber Flow Meter</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>27311</td>
			<td>To connect with hypoxic gas tank for a consistent gas flow speed</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hypoxic Gas Tank (0.01%O2 Cylinder)</td>
			<td>A-L Compressed Gases</td>
			<td>UN1956</td>
			<td>Used to flush hypoxic medium and chamber (0.01%O2/5%CO2/94.99N2)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TMS</td>
			<td>To observe cell condition</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse Primary Coronary Artery Endothelial Cells (ECs)</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>C57-6093</td>
			<td>Isolated from coronary artery of C57BL/6 mice</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NUNC 15ML CONICL Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565269</td>
			<td>For cell culture process, experiments, solution preparation etc.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NUNC 50ML CONICL Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565271</td>
			<td>For cell culture process, experiments, solution preparation etc.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>Used for cell washing during culture or experiments</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plate Reader</td>
			<td>BioTek Instrument</td>
			<td>11120533</td>
			<td>Colorimetric or fluorometric plate reading</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reaction 96 Well Palte (clear no lid)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565226</td>
			<td>Used for LDH measurement plate reading</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA for CMs</td>
			<td>Celprogen Inc</td>
			<td>T1509-014</td>
			<td>1 x sterile filtered and tissue culture tested</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA for ECs</td>
			<td>Cell Biologics Inc</td>
			<td>6914/0619</td>
			<td>0.25%, cell cuture-tested</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a cell co-culture model to mimic cardiac ischemia/reperfusion in vitro

İskemik kalp hastalığı dünya çapında önde gelen ölüm ve sakatlık nedenidir. Reperfüzyon iskeminin ötesinde ek yaralanmalara neden olur. Endotel hücreleri (ECs), kardiyomiyositleri (CM'ler) hücre-hücre etkileşimleri yoluyla reperfüzyon hasarından koruyabilir. Ko-kültürler, hücre-hücre etkileşimlerinin rolünü araştırmaya yardımcı olabilir. Karışık bir ko-kültür en basit yaklaşımdır, ancak izole tedaviler ve tek hücre tiplerinin aşağı akış analizleri mümkün olmadığından sınırlıdır. ECs'nin CM hücre hasarını doza bağımlı olarak zayıflatıp zayıflatamayacağını ve bu korumanın iki hücre hattı arasındaki temas mesafesini değiştirerek daha da optimize edilip edilemeyeceğini araştırmak için, hücreler arası katman mesafelerinde 0.5'te değişen üç tip hücre kültürü ekini test etmek için Fare Primer Koroner Arter Endotel Hücreleri ve Yetişkin Fare Kardiyomiyositlerini kullandık. Sırasıyla 1,0 ve 2,0 mm. Sadece CM'lerde, laktat dehidrogenaz (LDH) salınımı ile değerlendirilen hücresel hasar, hipoksi sırasında ve mesafe 0.5 ve 1.0 mm'ye kıyasla 2.0 mm olduğunda reoksijenasyon sonrasında önemli ölçüde artmıştır. ECS ve CM'ler neredeyse doğrudan temas halinde olduğunda (0.5 mm), hipoksi sonrası CM'lerin reoksijenasyon hasarında sadece hafif bir zayıflama vardı. 2.0 mm mesafe ile ECs, hem hipoksi hem de hipoksi / reoksijenasyon sırasında CM yaralanmasını zayıflattı, bu da EC'lerin CM'lerle çapraz konuşması için yeterli kültür mesafesinin gerekli olduğunu gösterdi, böylece salgılanan sinyal molekülleri dolaşabilir ve koruyucu yolları tamamen uyarabilir. Bulgularımız, ilk kez, EC / CM ortak kültür mekansal ortamının optimize edilmesinin, EC'lerin simüle iskemi / reperfüzyon hasarına karşı CM korumasındaki rolünü test etmek için uygun bir in vitro model sağlamak için gerekli olduğunu göstermektedir. Bu raporun amacı, araştırmacıların bu önemli modeli kendi avantajlarına kullanmaları için adım adım bir yaklaşım sağlamaktır.

Bu deneyde kullanılan üç kesici uç türü (A, B, C) 0,4 μm'lik aynı gözenek boyutuna sahiptir. Aralarındaki tek fark, iki ortak kültürlü hücre katmanı arasındaki mesafelerin sırasıyla 0,5, 1,0 ve 2,0 mm olmasını sağlayan (Şekil 3) ve farklı satıcılardan (ayrıntılar için bkz.
IR hasarını simüle etmek için HR'ye maruz kalan iki hücre hattının ayrı katmanlarıyla in vitro bir ko-kültür modeli oluşturmak i...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro at JoVE.com

Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

Uzamsal mesafe, ayrı endotel ve kardiyomiyosit hücre katmanlarının bir ko-kültür modelinde hipoksi / reoksijenasyon hasarının değerlendirilmesinde anahtar bir parametredir, bu da ilk kez, kardiyomiyosit korumasında endotel hücrelerinin rolünü test etmek için uygun bir in vitro model sağlamak için ko-kültür uzamsal ortamının optimize edilmesinin gerekli olduğunu düşündürmektedir.

Kardiyak İskemi / Reperfüzyonu In Vitro Taklit Etmek için Bir Hücre Ko-Kültür Modelinin Geliştirilmesi

Ischemic heart disease is the leading cause of death and disability worldwide. Reperfusion causes additional injury beyond ischemia. Endothelial cells ...

Bulgumuz, endotel hücreli kardiyomiyosit ko-kültür uzamsal ortamının optimize edilmesinin, simüle iskemi reprofüzyon hasarına karşı kardiyomiyosit korumasında endotel hücrelerinin rolünü test etmek için uygun bir in vitro model sağlamak için gerekli olduğunu göstermektedir. Hücre ko-kültürü modelleri, hücre-hücre etkileşimlerinin hücre fonksiyonu ve farklılaşması üzerindeki rolünü araştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, hücre tipleri arasındaki ayrı tedaviler ve tek bir hücre tipinin aşağı akış analizi, karışık ko-kültürde kolayca mümkün değildir.Bu çalışma, hipoksi reprofüzyon hasarını indükleyebilecek ve tek bir hücre tipi üzerindeki sonuç ve etkileri inceleyebilecek, aralarında anlamlı bir mesafe olan iki ayrı hücre katmanı oluşturmayı amaçlamıştır. Her iki hücre hattını da çözerek hazırlığa başlayın. Hücreleri taze maddelerle yıkadıktan sonra T25 şişelerine yerleştirin.Ertesi gün, hücreleri medya ile yenileyin ve birleştiğinde kullanın. Hücre kültürü inkübatörünü% 21 oksijen,% 5 karbondioksit ve% 74 azot ile 37 santigrat derecede tutun. Nemli tutun.Kardiyomiyositlerin hücre hattı akıcılığını bir ışık mikroskobu altında tahmin edin. Ortamları birleşik hücre kültürleri içeren şişelerden çıkarın ve şişe başına üç ila beş mililitre tripsin-EDTA ile tripsinize edin. Şişeyi nazikçe çalkalayın ve iki ila beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Bundan sonra, enzimatik ilerlemeyi bir ışık mikroskobu altında değerlendirin. Ayrılmadan sonra, trysin veya hücre çözeltisini T25 şişe başına 10 mililitre ortam içeren 50 mililitrelik bir tüpe ekleyerek tripsin çözeltisini etkisiz hale getirin. Yumuşak bir hücre peleti elde etmek için hücre süspansiyonunu iki dakika boyunca 120 x g'de santrifüj yapın.Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı çıkarın ve peleti bir ortamın beş mililitresinde yeniden askıya alın. Ardından, hücre sayımı yapın ve hücre canlılığını onaylayın. 10 mikrolitre yeniden askıya alınmış hücre ve 10 mikrolitre tripan mavisi boyayı karıştırın ve aliquotlayın, ardından bir hücre sayacı kullanarak canlı hücreleri sayın.İstenilen tohumlama yoğunluklarını elde etmek için hücreleri taze normal ortamlarla seyreltin. 24 kuyucuklu bir plaka ön kaplamasını hücre dışı matris ve plaka kardiyomiyositleri ile plakanın dibine kuyucuk başına 300.000 tohumlama yoğunluklarında alın. Hücreleri gece boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede tutun.24 saat sonra, endotel hücrelerini kesici uç başına 100.000 optimum kaplama yoğunluğunda kesici uçlara plakalayın. Endotel hücre kaplamasından 24 saat sonra, kardiyomiyosit kuyucuklarının içine endotel hücre ekleri yerleştirin ve ko-kültürü başlatın. Deneyleri gerçekleştirmeden önce hücrelerin 12 ila 24 saat boyunca birlikte kültürlenmesine izin verin.Hipoksik ortamı, 50 mililitrelik konik bir tüpe yaklaşık 25 mililitre ortam dökerek hazırlayın. Üstünü silikon bir membranla hava ile kapatın ve bir delik açmak için sterilize edilmiş bir pipet kullanın. Bundan sonra, başka bir delik oluşturun ve pipetlerin yaklaşık 2 / 3'ünü ortama batırılmış halde bırakın.Ortamı dakikada 30 litre akış hızında beş dakika boyunca hipoksik gazla yıkayın, ardından bağlı hücreler içeren 24 delikli plakaların veya kültür eklerinin ortamını atın. Bunları kuyu başına% 10 PBS'lik 100 mikrolitre ile çok nazikçe yıkayın, plakaların veya eklerin her bir oyuğuna taze hazırlanmış hipoksik ortamın 500 mikrolitresini ekleyin. Orijinal ortamı, normoksik kontrol grubunda glikoz ve serum içeren taze normal ortamla değiştirin.Odayı nemlendirmek için hipoksi odasına steril suyla dolu bir Petri kabı yerleştirin. Daha sonra hipoksik grupları içeren plakaları odaya yerleştirin. Hipoksi odasını dakikada 30 litrelik bir akışta beş dakika boyunca hipoksik gazla yıkayın.Bundan sonra, odayı 24 saat boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatörün içine yerleştirin. Hipoksiden sonra, plakaların veya eklerin eski ortamını atın ve plakaların her duvarına glikoz ve serum içeren 500 mikrolitre normal ortam ekleyin, ardından reperfüzyonu taklit etmek için plakaları normal kültür koşulları altında iki saat boyunca bir inkübatörün içinde saklayın. Hücre kültürü ortamını 24 delikli plakadan 96 delikli bir plakaya aktarın, ardından 24 delikli plakanın her bir kuyucuğundan 200 mikrolitre ortam alın ve 96 delikli plakanın dört kuyucuğuna eşit olarak dağıtılın.96 delikli bir plakada bir sitotoksisite testi kiti kullanarak LDH için absorbansı ölçün ve hücresel yaralanma derecesini belirlemek için üreticinin talimatlarını izleyin. Bu çalışmada üç tip kesici uç değerlendirilmiştir. Her üç kesici uç da 0,4 mikrometrelik aynı gözenek boyutuna sahipti.Aralarındaki tek fark, iki ortak kültürlü hücre katmanı arasındaki mesafelerin 0,5, 1,0 ve 2,0 milimetre olmasına izin veren taban yüksekliğine kadar olan uçtu. Bu protokol kullanılarak, hücreler normal oksijen koşulları altında kültürlendi ve daha sonra normoksik kontrol grubu ve hipoksi grubu olmak üzere iki gruba ayrıldı. 24 saat sonra, her iki grup da medya ile yenilendi ve son nokta tahlillerini yapmadan önce iki saat daha normal oksijen koşulları altında kültürlendi.Tek başına kardiyomiyosit için laktat dehidrogenaz salınımını, tek başına endotel hücrelerini ve kardiyomiyositin endotel hücreleri ile ko-kültürünü değerlendirmede üç tip kültür ekinin karşılaştırılması burada normoksik, sadece hipoksi ve hipoksi reoksijenasyon koşulları altında gösterilmiştir. Hücre katmanları arasında 0.5 milimetrelik bir mesafe ile hipoksi, kardiyomiyositler tek başına kültürlendiğinde normoksiye kıyasla LDH salınımının önemli ölçüde artmasına neden oldu. Bununla birlikte, LDH, hipoksi reoksijenasyon grubunda, hipoksi sadece gruba kıyasla sadece biraz artmıştır.Endotel hücreleri ve kardiyomiyositler birlikte kültürlendiğinde, sadece hipoksi koşulları altında LDH salınımının artması azalmadı. Bu da endotel hücrelerinin hipoksi sadece hipoksi koşulları altında tek başına kardiyomiyositler grubuna kıyasla herhangi bir koruyucu etkiye sahip olmadığını göstermektedir. Bununla birlikte, endotel hücreleri HR sırasında kardiyomiyositler üzerinde hafif fakat önemli bir koruma uyguladı. Hücre katmanları arasındaki mesafe bir milimetre olduğunda, LDH salınımı da kardiyomiyositlerde sadece hipoksi koşulu altında önemli ölçüde artmıştır.Bununla birlikte, 0.5 milimetrelik ekin aksine, kardiyomiyositlerdeki LDH artışı sadece HR tarafından hipoksi koşullarına göre güçlendirilmiştir. Bu artış, iki milimetrelik kesici uç ile daha da belirgindi. İki milimetrelik eklerle kaplanmış endotel hücrelerinin konsantrasyonu, kesici uç başına sırasıyla 25.000, 50.000 ve 100.000 hücreye titre edildi.ko-kültürde artan endotel hücre yoğunluğunun, HR'nin neden olduğu LDH salınımının doza bağımlı zayıflamasına yol açtığı bulunmuştur. Bununla birlikte, normoksik koşullar altında böyle bir etki görülmemiştir. Bu ko-kültür metodolojisi endotel hücreleri ve kardiyomiyositlerle sınırlı değildir. Bu yöntemler, ilgilenilen birden fazla organdaki çeşitli hücre hatları arasındaki spesifik hücre-hücre etkileşimlerinin araştırılmasına yardımcı olmalıdır.

Research

JoVE Journal

Biology

Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

Çok bölmesi MSS Nöron glia Co-kültür mikroakışkan Platformu

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

İnsan Embriyonik endotel hücre Co-kültür aracılık Olgunlaşma Bir Yönetmen Farklılaşma Yaklaşım Pankreas insülin üreten hücreler için Kök Hücre

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

Üç boyutlu Karışık-hücre Sfero Co-kültürden Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Blastomer Eksplantlarından Embriyonik gelişim sırasında Hücre Kader Taahhüt Test Etmek için

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

Periferik Kök Hücre Göç Analizi Fare Cremaster Muscle Mikrosirkülasyon Intravital Mikroskopi

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Iskemi / reperfüzyon içinde bir anoksisi-açlık Modeli<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

İzolasyon ve Kültür Yetişkin Fare Hücre Sinyal için kardiyomiyositlerin ve<em&gt; In vitro</em&gt; Kalp hipertrofisi

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In vitro sentezi insan hücrelerinde protein sentezlenmesinin uyarımından için mRNA&#39;nın Değiştirilmiş

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Fare Modeli Doğrulanması Hücre-spesifik şekilde LINC kompleksler bozacak

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...