Name: determination of mitochondrial respiration and glycolysis in ex vivo retinal tissue samples
Uploaded: 2021-08-04T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples at JoVE.com

ويدعم هذا العمل برنامج البحوث داخل العين التابع للمعهد الوطني للعيون (ZIAEY000450 وZIAEY000546).

تمت الموافقة على جميع بروتوكولات الماوس من قبل لجنة العناية بالحيوان واستخدامه التابعة للمعهد الوطني للعيون (NEI ASP# 650). تم إيواء الفئران في ظروف مظلمة خفيفة 12 ساعة ورعايتها باتباع توصيات دليل رعاية واستخدام المختبر ، ومعهد الموارد الحيوانية المختبرية ، وسياسة خدمة الصحة العامة بشأن الرعا?...

<ol>
	<li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+In+sickness+and+in+health.">Mitochondria: In sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li><li>Wong-Riley, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+the+visual+system.">Energy metabolism of the visual system.</a> Eye Brain. 2, 99-116 (2010).</li><li>Yu, D. Y., Cringle, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+distribution+and+consumption+within+the+retina+in+vascularised+and+avascular+retinas+and+in+animal+models+of+retinal+disease.">Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease.</a> Progress in Retina and Eye Research. 20, 175-208 (2001).</li><li>Barot, M., Gokulgandhi, M. R., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+retinal+diseases.">Mitochondrial dysfunction in retinal diseases.</a> Current Eye Research. 36 (12), 1069-1077 (2011).</li><li>Joyal, J. S., Gantner, M. L., Smith, L. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+energy+demands+control+vascular+supply+of+the+retina+in+development+and+disease:+The+role+of+neuronal+lipid+and+glucose+metabolism.">Retinal energy demands control vascular supply of the retina in development and disease: The role of neuronal lipid and glucose metabolism.</a> Progress in Retina and Eye Research. 64, 131-156 (2018).</li><li>Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose,+lactate,+and+shuttling+of+metabolites+in+vertebrate+retinas.">Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas.</a> Journal of Neuroscience Research. 93 (7), 1079-1092 (2015).</li><li>Haydinger, C. D., Kittipassorn, T., Peet, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+to+see-Drivers+of+aerobic+glycolysis+in+the+mammalian+retina:+A+review.">Power to see-Drivers of aerobic glycolysis in the mammalian retina: A review.</a> Clinical and Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1057-1071 (2020).</li><li>Wright, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan+and+mitochondrial+control+of+neurodegeneration.">Lifespan and mitochondrial control of neurodegeneration.</a> Nature Genetics. 36, 1153-1158 (2004).</li><li>Bossy-Wetzel, E., Schwarzenbacher, R., Lipton, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathways+to+neurodegeneration.">Molecular pathways to neurodegeneration.</a> Nature Medicine. 10, 2-9 (2004).</li><li>Leveillard, T., Philp, N. J., Sennlaub, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+retinal+metabolic+dysfunction+at+the+center+of+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration.">Is retinal metabolic dysfunction at the center of the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), (2019).</li><li>Vlachantoni, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+severe+mitochondrial+oxidative+stress+and+a+protective+effect+of+low+oxygen+in+mouse+models+of+inherited+photoreceptor+degeneration.">Evidence of severe mitochondrial oxidative stress and a protective effect of low oxygen in mouse models of inherited photoreceptor degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 20 (2), 322-335 (2011).</li><li>Grenell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MPC1+reprograms+retinal+metabolism+to+impair+visual+function.">Loss of MPC1 reprograms retinal metabolism to impair visual function.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (9), 3530-3535 (2019).</li><li>Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+degeneration:+genetic+and+mechanistic+dissection+of+a+complex+trait.">Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait.</a> Nature Reviews in Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).</li><li>Jarrett, S. G., Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+oxidative+stress+in+age-related+macular+degeneration.">Consequences of oxidative stress in age-related macular degeneration.</a> Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 399-417 (2012).</li><li>Rozing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration:+A+two-level+model+hypothesis.">Age-related macular degeneration: A two-level model hypothesis.</a> Progress in Retina Eye Research. 76, 100825 (2020).</li><li>Yokosako, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolysis+in+patients+with+age-related+macular+degeneration.">Glycolysis in patients with age-related macular degeneration.</a> Open Ophthalmology Journal. 8, 39-47 (2014).</li><li>Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+diabetic+retinopathy.">Mitochondrial dysfunction and diabetic retinopathy.</a> Mitochondrion. 36, 4-6 (2017).</li><li>Yumnamcha, T., Guerra, M., Singh, L. P., Ibrahim, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+dysregulation+and+neurovascular+dysfunction+in+diabetic+retinopathy.">Metabolic dysregulation and neurovascular dysfunction in diabetic retinopathy.</a> Antioxidants. 9 (12), (2020).</li><li>Futterman, S., Kinoshita, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+retina.+I.+Respiration+of+cattle+retina.">Metabolism of the retina. I. Respiration of cattle retina.</a> Journal of Biological Chemistry. 234 (4), 723-726 (1959).</li><li>Linsenmeier, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+light+and+darkness+on+oxygen+distribution+and+consumption+in+the+cat+retina.">Effects of light and darkness on oxygen distribution and consumption in the cat retina.</a> Journal of General Physiology. 88 (4), 521-542 (1986).</li><li>Medrano, C. J., Fox, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+consumption+in+the+rat+outer+and+inner+retina:+light-+and+pharmacologically-induced+inhibition.">Oxygen consumption in the rat outer and inner retina: light- and pharmacologically-induced inhibition.</a> Experiments in Eye Research. 61 (3), 273-284 (1995).</li><li>Kooragayala, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+oxygen+consumption+in+retina+ex+vivo+demonstrates+limited+reserve+capacity+of+photoreceptor+mitochondria.">Quantification of oxygen consumption in retina ex vivo demonstrates limited reserve capacity of photoreceptor mitochondria.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).</li><li>Adlakha, Y. K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+mitochondrial+oxygen+consumption+in+the+retina+ex+vivo:+applications+for+retinal+disease.">Determination of mitochondrial oxygen consumption in the retina ex vivo: applications for retinal disease.</a> Methods in Molecular Biology. 1753, 167-177 (2018).</li><li>. Agilent Mitocondrial stress test user guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Cell_Mito_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Cell_Mito_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent Glycolytic rate assay user guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent wave 2.6 user guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf</a> (2021)</li><li>. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf">https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf</a> (2021)</li><li>. Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf</a> (2021)</li><li>. Report Generator User Guide Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent Seahorse XF Buffer Factor Protocol Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent sensor cartridges and cell culture microplates Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf</a> (2021)</li><li>Fan, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioassay+to+measure+energy+metabolism+in+mouse+colonic+crypts,+organoids,+and+sorted+stem+cells.">A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309, 1-9 (2015).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-+and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li><li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina.">The major cell populations of the mouse retina.</a> Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).</li><li>Akimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+GFP+to+newborn+rods+by+Nrl+promoter+and+temporal+expression+profiling+of+flow-sorted+photoreceptors.">Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (10), 3890-3895 (2006).</li><li>Kenwood, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+mitochondrial+uncoupler+that+does+not+depolarize+the+plasma+membrane.">Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane.</a> Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).</li><li>Corso-Diaz, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+identifies+DNA+methylation+signatures+of+aging+in+rod+photoreceptors+associated+with+alterations+in+energy+metabolism.">Genome-wide profiling identifies DNA methylation signatures of aging in rod photoreceptors associated with alterations in energy metabolism.</a> Cell Reports. 31 (3), 107525 (2020).</li><li>Berkowitz, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiration+in+outer+retina+contributes+to+light-evoked+increase+in+hydration+in+vivo.">Mitochondrial respiration in outer retina contributes to light-evoked increase in hydration in vivo.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (15), 5957-5964 (2018).</li><li>Joyal, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+lipid+and+glucose+metabolism+dictates+angiogenesis+through+the+lipid+sensor+Ffar1.">Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1.</a> Nature Medicine. 22 (4), 439-445 (2016).</li></ol>

وترد هنا تعليمات مفصلة لأداء المقايسات القائمة على الألواح الدقيقة من التنفس الميتوكوندريا ونشاط انحلال الجليكوليسيس باستخدام الجسم الحي السابق، وأقراص لكمة الشبكية تشريح حديثا. وقد تم تحسين البروتوكول إلى: 1) ضمان استخدام وسيطة المقايسة مناسبة للأنسجة الشبكية في الجسم الحي السا...

الميتوكوندريا هي العضية الأساسية التي تنظم التمثيل الغذائي الخلوي، والإشارات، وداء التوازن، وموت الخلايا المبرمج من خلال تنسيق العمليات الفسيولوجية الحاسمة المتعددة1. الميتوكوندريا بمثابة قوة في الخلية لتوليد أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) من خلال الفوسفور التأكسدي (OXPHOS) وتوفير الطاقة التي تدعم تقريبا جميع الأحداث الخلوية. يتم استقلاب غالبية الأكسجين الخلوي في الميتوكوندريا ، حيث يعمل كمقبول الإلكترون النهائي في سلسلة نقل الإلكترون (ETC) أثناء التنفس الهوائي. يمكن أيضا إنتاج كميات منخفضة من ATP من انحلال الجليكوليس في السيتوسول ، حيث يتم تحويل الجلوكوز إلى بيروفاتي ، والتي يمكن تحويلها إلى لاكتات أو نقلها إلى الميتوكوندريا وتأكسدها إلى أسيتيل -CoA ، وهي ركيزة في دورة حمض الثلاثي (دورة TCA).
شبكية العين هي واحدة من الأنسجة الأكثر نشاطا الأيضية في الثدييات2، وعرض مستويات عالية من التنفس الميتوكوندريا واستهلاك الأكسجين عالية للغاية3. قضيب ومخروط مستقبلات ضوئية تحتوي على كثافة عالية من Mitochondria4، وOXPHOS يولد معظم ATP في شبكية العين5. بالإضافة إلى ذلك، تعتمد شبكية العين أيضا بشكل كبير على انحلال الجليكوليسيس الهوائي6,7 عن طريق تحويل الجلوكوز إلى لاكتات5. وترتبط عيوب الميتوكوندريا مع مختلف الأمراض العصبية8,9; ومع متطلباتها الفريدة من الطاقة العالية ، فإن شبكية العين معرضة بشكل خاص للعيوب الأيضية ، بما في ذلك تلك التي تؤثر على OXPHOS4 الميتوكوندريا وتحلل الجليكوليسيس10. الخلل الوظيفي الميتوكوندريا والعيوب في انحلال الجليكوليسيس متورطة في الشبكية111,12 والأمراض التنكسية البقعي13, الضمور البقعي المرتبط بالعمر10,14,15,16, واعتلال الشبكية السكري17,18. لذلك، يمكن أن توفر القياسات الدقيقة لتنفس الميتوكوندريا وتحلل الجليكوليسيس معايير مهمة لتقييم سلامة وصحة شبكية العين.
يمكن قياس تنفس الميتوكوندريا من خلال تحديد معدل استهلاك الأكسجين (OCR). وبالنظر إلى أن تحويل الجلوكوز إلى بيروفاتي وبالتالي إلى اللاكتات يؤدي إلى قذف البروتونات إلى البيئة خارج الخلية وتحمضها ، فإن قياسات معدل الحموضة خارج الخلية (ECAR) توفر مؤشرا على تدفق انحلال الجليكوليزي. كما تتكون شبكية العين من أنواع الخلايا المتعددة مع العلاقات الحميمة والتآزر النشط، بما في ذلك تبادل الركائز6، فمن الضروري لتحليل وظيفة الميتوكوندريا والتمثيل الغذائي في سياق أنسجة الشبكية بأكملها مع صفح سليمة والدوائر. على مدى العقود القليلة الماضية، تم استخدام أقطاب كلارك O2 وغيرها من الأقطاب الكهربائية الدقيقة الأكسجين لقياس استهلاك الأكسجين في شبكية العين19،20،21. هذه الأقطاب الأكسجين لديها قيود كبيرة في الحساسية، ومتطلبات حجم عينة كبيرة، والحاجة إلى التحريك المستمر للعينة تعليق، الأمر الذي يؤدي عادة إلى تعطيل السياق الخلوي والأنسجة. تم تطوير البروتوكول الموصوف هنا باستخدام تقنية مضان تعتمد على الألواح الدقيقة لقياس استقلاب الطاقة الميتوكوندريا في أنسجة شبكية العين السابقة للفأر السابق تشريحها حديثا. يسمح بقياسات متوسطة الإنتاجية في الوقت الحقيقي لكل من OCR و ECAR في وقت واحد باستخدام عينة صغيرة (لكمة 1 مم) من أنسجة الشبكية في الجسم الحي مع تجنب الحاجة إلى التعليق والتحريك المستمر.
أظهرت هنا هو الإجراء التجريبي لالقساء الإجهاد الميتوكوندريا ونسبة الجليكوليك المقايسة على أقراص لكمة الشبكية تشريح حديثا. يسمح هذا البروتوكول بقياس الأنشطة الأيضية المتعلقة بالميتوكوندريا في سياق الأنسجة الحية السابقة. تختلف عن المقايسات التي أجريت باستخدام الخلايا المستزرعة، والقراءات التي تم الحصول عليها هنا تعكس التمثيل الغذائي للطاقة مجتمعة على مستوى الأنسجة وتتأثر بالتفاعلات بين أنواع الخلايا المختلفة داخل الأنسجة. تم تعديل البروتوكول من الإصدار 22,23 المنشور سابقا للتكيف مع الجيل الجديد من محلل التدفق خارج الخلية Agilent Seahorse 24-wells (XFe24) مع لوحة التقاط الجزيرة. كما تم تحسين متوسط المقايسة وتركيزات مركب الحقن وعدد / مدة دورات الفحص لأنسجة الشبكية. يتم إعطاء بروتوكول مفصل خطوة بخطوة لإعداد أقراص لكمة الشبكية. يمكن الحصول على مزيد من المعلومات حول إعداد البرنامج وتحليل البيانات من دليل المستخدم الخاص بالشركة المصنعة24,25,26.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6134</td>
			<td>Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-gauge needle</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A, 10 mM stock solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bam15, 10 mM stock solution</td>
			<td>TimTec</td>
			<td>ST056388</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy puncher, 1 mm</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>33-31AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 asphyxiation chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection forceps-Dumont #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>Stright tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection forceps-Dumont #7</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11274-20</td>
			<td>Curved tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>Curved, Serrated tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15004-08</td>
			<td>Curved tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH solution, 1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8263</td>
			<td>Aqueous solution, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone, 10 mM stock solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse calibration medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 1.0 M glucose</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103577-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 100 mM pyruvate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103578-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 200 mM glutamine</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103579-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF DMEM medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>pH 7.4, with 5 mM HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103518-100</td>
			<td>Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate solution, 0.1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Aqueous solution, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfine eyelash brush</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>113</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of mitochondrial respiration and glycolysis in ex vivo retinal tissue samples

التنفس الميتوكوندريا هو مسار توليد الطاقة الحرجة في جميع الخلايا، وخاصة المستقبلات الضوئية الشبكية التي تمتلك عملية التمثيل الغذائي نشطة للغاية. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر المستقبلات الضوئية أيضا انحلال غليكوليسيس هوائي عالي مثل الخلايا السرطانية. يمكن أن توفر القياسات الدقيقة لهذه الأنشطة الأيضية رؤى قيمة في التوازن الخلوي في ظل الظروف الفسيولوجية وفي حالات المرض. وقد وضعت عالية الإنتاجية المقايسات المستندة إلى لوحة صغيرة لقياس التنفس الميتوكوندريا ومختلف الأنشطة الأيضية في الخلايا الحية. ومع ذلك، يتم تطوير الغالبية العظمى من هذه للخلايا المستزرعة ولم يتم تحسين لعينات الأنسجة سليمة والتطبيق السابق فيفو. وصف هنا هو مفصل خطوة بخطوة بروتوكول، وذلك باستخدام تكنولوجيا الفلورية القائمة على لوحة صغيرة، لقياس مباشرة معدل استهلاك الأكسجين (OCR) كمؤشر على التنفس الميتوكوندريا، فضلا عن معدل الحموضة خارج الخلية (ECAR) كمؤشر على انحلال الجليكوليسيس، في الأنسجة الشبكية السابقة سليمة . وقد استخدمت هذه الطريقة لتقييم بنجاح الأنشطة الأيضية في شبكية العين الماوس الكبار وإظهار تطبيقه في التحقيق في الآليات الخلوية للشيخوخة والمرض.

البيانات المبلغ عنها هنا هي تمثيلية الميتوكوندريا الإجهاد المقايسة تظهر تتبع OCR (الشكل 1) ونسبة السكر في تحليل يظهر تتبع OCR وتتبع ECAR (الشكل 2)، والتي أجريت باستخدام تشريح حديثا 1 مم أقراص لكمة الشبكية من 4 أشهر من العمر المعدلة وراثيا NRL-L-EGFP mice36</su...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples at JoVE.com

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

وصف هنا هو بروتوكول مفصل لإجراء اختبار الإجهاد الميتوكوندريا ونسبة الجليكوليك المقايسة في عينات الأنسجة الشبكية في الجسم الحي السابق باستخدام تحليل حيوي التجارية.

تحديد التنفس الميتوكوندريا وتحلل الجليكوليسيس في عينات الأنسجة الشبكية Ex Vivo

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. ...

يوفر هذا البروتوكول تحليلا في الوقت الفعلي لاثنين من المسارات الحيوية الرئيسية: التنفس الميتوكوندريا وتحلل الجليكوليسيس في أنسجة شبكية العين السابقة للفأرة السابقة التي تم تشريحها حديثا. وركز التحليل التقليدي لحصان البحر على الخلايا الأحادية الطبقات المستزرعة، في حين يسمح هذا البروتوكول للباحثين بدراسة نشاط الميتوكوندريا في الأنسجة التي تم تشريحها حديثا، وتحديدا شبكية العين. وتستخدم هذه التقنية لدراسة أنشطة الميتوكوندريا وأعلام انحلال الجليكوليسيس في شبكية العين من نماذج الماوس انحطاط الشبكية الموروثة.وهو أداة مفيدة لأبحاث الشبكية ولديه أيضا إمكانية لتطبيقه على نوع آخر من الأنسجة لتطوير العلاجات المحتملة. الجزء الأكثر صعوبة في هذا البروتوكول هو الحصول على أقراص لكمة عالية الجودة من شبكية العين الماوس تشريح حديثا، لذلك فمن المستحسن أن الفرد الذي سيؤدي هذه التقنية لديه مهارات تشريح شبكية العين جيدة. في اليوم السابق للتجربة، افتح كاسيت خرطوشة المستشعر وأضف ملليلتر واحد من وسيط المعايرة إلى كل بئر من لوحة المرافق.احتضان بين عشية وضحاها في حاضنة خالية من ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية لتنشيط الفلوروفوريس. في يوم التجربة، وإعداد متوسطة المقايسة في الأدوية المركبة المخففة من المخزون. الاحماء المتوسطة المقايسة في حمام الماء 37 درجة مئوية.إعداد برنامج الفحص على الجهاز كما هو موضح في المخطوطة النصية. افتح غطاء الكاسيت الذي يحتوي على إدراجات شبكية. Pipette ثمانية ميكرولترات من مزيج الطلاء إلى كل إدراج شبكة، ثم استخدام طرف ماصة لنشر بلطف قطرة حول لتوزيع مزيج الطلاء على قدم المساواة في جميع أنحاء إدراج شبكة.أغلق الكاسيت واترك إدراج الشبكة يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة على الأقل للامتصاص. بعد الحضانة، اغسل إدراج الشبكة عن طريق أنابيب أربعة ملليلترات من وسيط المقايسة مباشرة على الإدراجات. هز بلطف كاسيت لضمان غسل جميع إدراج شبكة مع وسيطة المقايسة.لإعداد لكمة الشبكية، واختزال العينين من فأر القتل الرحيم الكبار ووضعها في الجليد البارد PBS في طبق بيتري، ثم وضع طبق بيتري تحت المجهر تشريح. باستخدام الميكروسيستورات، وقطع العصب البصري، ثم إزالة بعناية عضلات خارج القولون تعلق خارج مقلة العين. باستخدام إبرة قياس 30، لكمة حفرة على حافة القرنية.ثم استخدم microscissors تشريح غرامة لجعل قطع دائرية على طول حافة القرنية. باستخدام ملقط تشريح حاد ، قم بإزالة القرنية والعدسة والفكاهة الزجاجية من كأس العين. إجراء عدة تخفيضات صغيرة على طبقة الصلب في حافة كوب العين باستخدام microscissors تشريح غرامة.استخدام اثنين من ملقط تشريح حادة للتمسك الأنسجة الصلبة في كل جانب وسحب على طبقة مشقوق بعناية فائقة لإزالته من شبكية العين العصبية. كرر هذا حول كوب العين حتى تتم إزالة جميع تصلب ويتم الحصول على كوب الشبكية سليمة. إجراء تخفيضات شعاعي على كأس الشبكية لتسطيح وتوليد عدة أقسام متميزة باستخدام microscissors تشريح.بعد ذلك ، باستخدام جهاز لكم خزعة قطره ملليمتر واحد ، اقطع قرص شبكية واحد من كل قسم من كوب الشبكية المسطح. لكمة على مسافة متساوية من رأس العصب البصري. نقل إدراج شبكة المغلفة مسبقا في طبق بيتري تشريح باستخدام ملقط.مع مساعدة من اثنين من فرش رمش فائقة غرامة، ووضع قرص لكمة الشبكية في وسط إدراج شبكة مع الجانب طبقة الخلية العقدة أسفل لمس شبكة وطبقة مستقبلات ضوئية تواجه ما يصل. لتحميل خرطوشة الاستشعار، أخرج كاسيت لوحة خرطوشة الاستشعار المرطب من حاضنة 37 درجة مئوية. بعد إزالة غطاء الداعم المائي، ضع خرطوشة المستشعر مرة أخرى على لوحة المرافق.تحميل الحجم المطلوب من حلول مركب الحقن في المنافذ المناسبة عن طريق عقد تلميح ماصة في زاوية 45 درجة، وإدراج طرف ماصة في منتصف الطريق إلى منفذ الحقن مع شطبة من طرف ضد الجدار المقابل من منفذ الحقن. تحميل المركب برفق في كل منفذ. قم بتحميل خرطوشة المستشعر في الجهاز للمعايرة بالنقر فوق زر التشغيل لبدء تشغيل لفتح درج الجهاز.ضع خرطوشة الاستشعار في الجهاز وانقر فوق أنا مستعد زر لبدء المعايرة. تحميل الحجم المطلوب من المتوسط المقايسة في كل بئر من لوحة التقاط الجزيرة. باستخدام ملقط، والاستيلاء على حافة إدراج شبكة تحتوي على أقراص لكمة الشبكية وأخذها من طبق بيتري.اضغط بخفة على الجزء السفلي من إدراج شبكة على النسيج مسح امتصاص لإزالة السائل الإضافي ووضعها في بئر لوحة التقاط الجزيرة. كرر هذه الخطوة حتى يتم وضع جميع إدراج شبكة مع اللكمات الشبكية في لوحة التقاط الجزيرة ملء آبار تصحيح الخلفية والآبار الفارغة مع إدراج شبكة فارغة. باستخدام ملقطين Graefe، اضغط على حافة كل شبكة إدراج بعناية وبلطف، والتأكد من أن يتم إدراج هذه بأمان في الجزء السفلي من لوحة التقاط الجزيرة.ضع صفيحة التقاط الجزر المحملة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق للإحماء ، ثم أخرج لوحة المرافق بعد اكتمال المعايرة. استبداله مع لوحة التقاط الجزيرة التي تحتوي على اللكمات الشبكية واستئناف تشغيل المقايسة عن طريق النقر على زر لوحة الخلية تحميل. بعد اكتمال التشغيل، أخرج خرطوشة الاستشعار ولوحة التقاط الجزر التي تحتوي على لكمات شبكية العين عن طريق النقر على زر الإخراج، ثم انقر فوق الزر الذي تم حتى يتم حفظ البيانات تلقائيا كملف ASYR وتغيير الشاشة تلقائيا لعرض النتيجة.تم إجراء فحص الإجهاد الميتوكوندريا الذي يظهر تتبع OCR ومقايسة معدل الجليكوليك التي تظهر كل من OCR وECAR تتبع باستخدام أقراص لكمة شبكية العين ملليمتر واحد تشريح حديثا. في اختبار الإجهاد الميتوكوندريا، تم حقن Bam15 لفك تدرج البروتون من إنتاج ATP الميتوكوندريا، مما أدى إلى زيادة OCR إلى أقصى مستوى. تم حقن روتينون وأنتيميسين A لمنع تنفس الميتوكوندريا في مجمع واحد وثلاثة معقدة على التوالي، مما أدى إلى انخفاض في OCR إلى الحد الأدنى.يعكس الفرق بين المستوى الأقصى للتعرف الضوئي على الحروف والقياس الأخير لمستوى OCR القاعدي قدرة احتياطي الميتوكوندريا. في المقايسة معدل الجليكوليك، حقن الروتينون وأنتيميسين A يغلق التنفس الميتوكوندريا ويدفع تحلل أعلى. يتم ضبط تحلل الجليكوليسيس عن طريق حقن 2-deoxy-d-glucose، الذي ينافس الجلوكوز على ربط الهيكسوكيناز، مما يؤدي إلى انخفاض ECAR إلى الحد الأدنى.الفرق بين المستوى الأقصى للجليكو ECAR في المقياس الأخير لمستوى الجليكو ECAR القاعدي يعكس قدرة احتياطي الجليكوليسيس. لإنتاج بيانات موثوقة، من الضروري الحصول على نوعية جيدة من أقراص لكمة الشبكية والحد من إجمالي وقت التشريح في غضون 1.5 ساعة. بعد التجربة، يمكن للمرء أن يحدد الحمض النووي لمحتوى البروتين من قرص الشبكية في بئر واستخدام ذلك لتطبيع بيانات حصان البحر.لذلك تم استخدام هذا البروتوكول لدراسة التنمية والشيخوخة والمرض في شبكية العين. كما تم تحليل تفضيل الأنسجة أو الاعتماد على ركائز الوقود المختلفة مثل الجلوكوز أو الأحماض الدهنية.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

ترنسفكأيشن من خلايا الشبكية بواسطة الماوس العقدة في الجسم الحي Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

تحديد أنواع غشاء الميتوكوندريا المحتملة والأوكسجين التفاعلي في الخلايا العصبية الفئران الحية القشرية

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

تصوير الأعصاب وظيفية عن طريق الموجات فوق الصوتية تعطيل حاجز الدم في الدماغ والتصوير بالرنين المغناطيسي المنغنيز معززة لل

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

تشريح والثقافة، وتحليل<em&gt; القيطم المورق</em&gt; الأنسجة الجنينية الشبكية

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

فيفو السابقين الاستعدادات للالميكعي الجهاز سليمة والإكسسوار الشم لمبة

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

متزامنة<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; اختبار وظيفي اثنين من شبكية العين من قبل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; نظام مخطط كهربية

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

فيفو السابقين علم البصريات الوراثي تشريح الدوائر الخوف في الدماغ شرائح

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

تحديد مبصرة خلية الحساسية الطيفية في نموذج الحشرات من<em&gt; في فيفو</em&gt; بين الخلايا تسجيلات

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

إعداد شرائح الشبكية الطازجة من الزرد الكبار السابقين فيفو التصوير تجارب

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

طريقة الأوتوراديوغرافية الكمية لتحديد المعدلات الإقليمية لتخليق البروتين الدماغي في فيفو

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...