Name: determination of mitochondrial respiration and glycolysis in ex vivo retinal tissue samples
Uploaded: 2021-08-04T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples at JoVE.com

Questo lavoro è supportato dal programma di ricerca intramurale del National Eye Institute (ZIAEY000450 e ZIAEY000546).

Tutti i protocolli del topo sono stati approvati dall'Animal Care and Use Committee del National Eye Institute (NEI ASP# 650). I topi sono stati alloggiati in condizioni di luce-buio di 12 ore e curati seguendo le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, l'Istituto delle risorse animali da laboratorio e la politica del servizio sanitario pubblico sulla cura umana e l'uso degli animali da laboratorio.
1. Cartuccia del sensore idratante e preparazione del mezzo...

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	<li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+In+sickness+and+in+health.">Mitochondria: In sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li><li>Wong-Riley, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+the+visual+system.">Energy metabolism of the visual system.</a> Eye Brain. 2, 99-116 (2010).</li><li>Yu, D. Y., Cringle, S. 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Agilent wave 2.6 user guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf</a> (2021)</li><li>. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf">https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf</a> (2021)</li><li>. Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf</a> (2021)</li><li>. Report Generator User Guide Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent Seahorse XF Buffer Factor Protocol Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent sensor cartridges and cell culture microplates Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf</a> (2021)</li><li>Fan, Y. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+mitochondrial+uncoupler+that+does+not+depolarize+the+plasma+membrane.">Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane.</a> Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).</li><li>Corso-Diaz, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+identifies+DNA+methylation+signatures+of+aging+in+rod+photoreceptors+associated+with+alterations+in+energy+metabolism.">Genome-wide profiling identifies DNA methylation signatures of aging in rod photoreceptors associated with alterations in energy metabolism.</a> Cell Reports. 31 (3), 107525 (2020).</li><li>Berkowitz, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiration+in+outer+retina+contributes+to+light-evoked+increase+in+hydration+in+vivo.">Mitochondrial respiration in outer retina contributes to light-evoked increase in hydration in vivo.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (15), 5957-5964 (2018).</li><li>Joyal, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+lipid+and+glucose+metabolism+dictates+angiogenesis+through+the+lipid+sensor+Ffar1.">Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1.</a> Nature Medicine. 22 (4), 439-445 (2016).</li></ol>

Di seguito sono fornite istruzioni dettagliate per l'esecuzione di saggi basati su micropiastre della respirazione mitocondriale e dell'attività di glicolisi utilizzando dischi di perforazione retinica ex vivo appena sezionati. Il protocollo è stato ottimizzato per: 1) garantire l'utilizzo di un mezzo di saggio idoneo per il tessuto retinico ex vivo; 2) impiegare dischi di punzonatura retinica di dimensioni adeguate per ottenere letture OCR ed ECAR che rientrano nel campo di rilevamento ottimale della...

I mitocondri sono organelli essenziali che regolano il metabolismo cellulare, la segnalazione, l'omeostasi e l'apoptosi coordinando molteplici processi fisiologici cruciali1. I mitocondri fungono da centrale elettrica nella cellula per generare adenosina trifosfato (ATP) attraverso la fosforilazione ossidativa (OXPHOS) e fornire energia che supporta quasi tutti gli eventi cellulari. La maggior parte dell'ossigeno cellulare viene metabolizzato nei mitocondri, dove funge da accettore finale di elettroni nella catena di trasporto degli elettroni (ETC) durante la respirazione aerobica. Basse quantità di ATP possono anche essere prodotte dalla glicolisi nel citosol, dove il glucosio viene convertito in piruvato, che può essere ulteriormente convertito in lattato o trasportato nei mitocondri e ossidato in acetil-CoA, un substrato nel ciclo dell'acido tricarbossilico (ciclo TCA).
La retina è uno dei tessuti metabolicamente più attivi nei mammiferi2, che mostra alti livelli di respirazione mitocondriale e un consumo di ossigeno estremamente elevato3. I fotorecettori a bastoncello e cono contengono un'alta densità di mitocondri4 e OXPHOS genera la maggior parte dell'ATP nella retina5. Inoltre, la retina si basa fortemente sulla glicolisi aerobica6,7 convertendo il glucosio in lattato5. I difetti mitocondriali sono associati a varie malattie neurodegenerative8,9; e con le sue elevate richieste energetiche uniche, la retina è particolarmente vulnerabile ai difetti metabolici, compresi quelli che colpiscono OXPHOS4 mitocondriale e glicolisi10. La disfunzione mitocondriale e i difetti della glicolisi sono implicati nelle malattie degenerative della retina11,12 e macular13, nella degenerazione maculare legata all'età10,14,15,16 e nella retinopatia diabetica17,18. Pertanto, misurazioni accurate della respirazione mitocondriale e della glicolisi possono fornire parametri importanti per valutare l'integrità e la salute della retina.
La respirazione mitocondriale può essere misurata attraverso la determinazione del tasso di consumo di ossigeno (OCR). Dato che la conversione del glucosio in piruvato e successivamente in lattato provoca l'estrusione di protoni e l'acidificazione dell'ambiente extracellulare, le misurazioni del tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) forniscono un'indicazione del flusso di glicolisi. Poiché la retina è composta da più tipi di cellule con relazioni intime e sinergia attiva, incluso lo scambio di substrati6, è imperativo analizzare la funzione mitocondriale e il metabolismo nel contesto dell'intero tessuto retinico con laminazione e circuiti intatti. Negli ultimi decenni, gli elettrodi O2 di tipo Clark e altri microelettrodi di ossigeno sono stati utilizzati per misurare il consumo di ossigeno nella retina19,20,21. Questi elettrodi di ossigeno hanno importanti limitazioni nella sensibilità, nella necessità di un grande volume di campione e nella necessità di un'agitazione continua del campione sospeso, che di solito porta alla rottura del contesto cellulare e tissutale. Il protocollo qui descritto è stato sviluppato utilizzando una tecnica di fluorescenza basata su micropiastre per misurare il metabolismo energetico mitocondriale nel tessuto retinico di topo ex vivo appena sezionato. Consente misurazioni in tempo reale a medio rendimento di OCR ed ECAR contemporaneamente utilizzando un piccolo campione (punzone da 1 mm) di tessuto retinico ex vivo, evitando la necessità di sospensione e agitazione continua.
Qui è dimostrata la procedura sperimentale per il test dello stress mitocondriale e il test della velocità glicolitica su dischi di punzonatura retinica appena sezionati. Questo protocollo consente la misurazione delle attività metaboliche correlate ai mitocondri in un contesto tissutale ex vivo. A differenza dei saggi eseguiti utilizzando cellule in coltura, le letture qui ottenute riflettono il metabolismo energetico combinato a livello tissutale e sono influenzate dalle interazioni tra i diversi tipi di cellule all'interno del tessuto. Il protocollo è stato modificato da una versione precedentemente pubblicata22,23 per adattarsi alla nuova generazione dell'analizzatore a flusso extracellulare a 24 pozzetti Agilent Seahorse (XFe24) con piastra Islet Capture. Anche il mezzo di dosaggio, le concentrazioni del composto di iniezione e il numero/durata dei cicli di analisi sono stati ottimizzati per il tessuto retinico. Viene fornito un protocollo dettagliato passo-passo per la preparazione dei dischi di punzonatura retinica. Ulteriori informazioni sulla configurazione del programma e sull'analisi dei dati possono essere ottenute dalla guida per l'utente del produttore24,25,26.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6134</td>
			<td>Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-gauge needle</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A, 10 mM stock solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bam15, 10 mM stock solution</td>
			<td>TimTec</td>
			<td>ST056388</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy puncher, 1 mm</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>33-31AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 asphyxiation chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection forceps-Dumont #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>Stright tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection forceps-Dumont #7</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11274-20</td>
			<td>Curved tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>Curved, Serrated tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15004-08</td>
			<td>Curved tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH solution, 1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8263</td>
			<td>Aqueous solution, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone, 10 mM stock solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse calibration medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 1.0 M glucose</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103577-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 100 mM pyruvate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103578-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 200 mM glutamine</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103579-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF DMEM medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>pH 7.4, with 5 mM HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103518-100</td>
			<td>Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate solution, 0.1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Aqueous solution, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfine eyelash brush</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>113</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of mitochondrial respiration and glycolysis in ex vivo retinal tissue samples

La respirazione mitocondriale è una via critica che genera energia in tutte le cellule, in particolare i fotorecettori della retina che possiedono un metabolismo altamente attivo. Inoltre, i fotorecettori mostrano anche un'elevata glicolisi aerobica come le cellule tumorali. Misurazioni precise di queste attività metaboliche possono fornire preziose informazioni sull'omeostasi cellulare in condizioni fisiologiche e negli stati patologici. Sono stati sviluppati saggi basati su micropiastre ad alto rendimento per misurare la respirazione mitocondriale e varie attività metaboliche nelle cellule vive. Tuttavia, la stragrande maggioranza di questi sono sviluppati per cellule in coltura e non sono stati ottimizzati per campioni di tessuto intatto e per l'applicazione ex vivo. Qui è descritto un protocollo dettagliato passo-passo, che utilizza la tecnologia di fluorescenza basata su micropiastre, per misurare direttamente il tasso di consumo di ossigeno (OCR) come indicatore della respirazione mitocondriale, nonché il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) come indicatore di glicolisi, nel tessuto retinico ex vivo intatto. Questo metodo è stato utilizzato per valutare con successo le attività metaboliche nella retina del topo adulto e dimostrare la sua applicazione nello studio dei meccanismi cellulari dell'invecchiamento e della malattia.

I dati riportati qui sono un test rappresentativo dello stress mitocondriale che mostra tracce OCR (Figura 1) e test della velocità glicolitica che mostra traccia OCR e traccia ECAR (Figura 2), che sono stati eseguiti utilizzando dischi perforati retinici da 1 mm appena sezionati da topi transgenici Nrl-L-EGFP di 4 mesi ( sfondo C57B / L6). Questi topi esprimono GFP specificamente nei fotorecettori a bastoncello senza alterare i...

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Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Qui è descritto un protocollo dettagliato per l'esecuzione del test dello stress mitocondriale e del test della velocità glicolitica in campioni di tessuto retinico ex vivo utilizzando un bioanalizzatore commerciale.

Determinazione della respirazione mitocondriale e della glicolisi in campioni di tessuto retinico Ex Vivo

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. ...

Questo protocollo fornisce l'analisi in tempo reale di due principali vie bioenergetiche: la respirazione mitocondriale e la glicolisi in tessuti retinici di topo ex vivo appena sezionati. L'analisi tradizionale del cavalluccio marino si è concentrata sulle cellule monostrato in coltura, mentre questo protocollo consente ai ricercatori di studiare l'attività mitocondriale nei tessuti appena sezionati, in particolare la retina. Questa tecnica viene utilizzata per studiare le attività dei mitocondri e le bandiere di glicolisi nelle retine di modelli murini di degenerazione retinica ereditaria.È uno strumento utile per la ricerca retinica e ha anche il potenziale per essere applicato ad altri tipi di tessuto per sviluppare potenziali terapie. La parte più difficile di questo protocollo è ottenere dischi di punch di qualità dalla retina del topo appena sezionata, quindi si raccomanda che l'individuo che eseguirà questa tecnica abbia buone capacità di dissezione retinica. Il giorno prima dell'esperimento, aprire la cassetta della cartuccia del sensore e aggiungere un millilitro di mezzo di calibrazione a ciascun pozzetto della piastra di utilità.Incubare durante la notte in un incubatore privo di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per attivare i fluorofori. Il giorno dell'esperimento, preparare il mezzo di saggio in farmaci composti diluiti da stock. Riscaldare il mezzo di analisi nel bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.Impostare il programma di analisi sulla macchina come descritto nel manoscritto di testo. Aprire il coperchio della cassetta contenente inserti a rete. Pipettare otto microlitri della miscela di rivestimento per ogni inserto a rete, quindi utilizzare una punta di pipetta per distribuire delicatamente la goccia intorno per distribuire equamente la miscela di rivestimento in tutto l'inserto a rete.Chiudere la cassetta e lasciare incubare gli inserti in rete a temperatura ambiente per almeno 25 minuti per l'assorbimento. Dopo l'incubazione, lavare gli inserti a rete pipettando quattro millilitri del mezzo di saggio direttamente sugli inserti. Agitare delicatamente la cassetta per assicurarsi che tutti gli inserti in rete vengano lavati con il mezzo di analisi.Per preparare il punch retinico, enucleare gli occhi da un topo adulto eutanasizzato e metterli in PBS ghiacciato in una capsula di Petri, quindi posizionare la capsula di Petri sotto un microscopio di dissezione. Utilizzando microscissori, tagliare il nervo ottico, quindi rimuovere con cura i muscoli extraretti attaccati all'esterno del bulbo oculare. Usando un ago calibro 30, perforare un foro sul bordo della cornea.Quindi utilizzare microscissori di dissezione fine per effettuare un taglio circolare lungo il bordo della cornea. Usando una pinza di dissezione affilata, rimuovere la cornea, la lente e l'umore vitreo dalla coppa dell'occhio. Fare diversi piccoli tagli sullo strato sclerale sul bordo della coppa dell'occhio usando microscissori di dissezione fine.Utilizzare due pinze di dissezione affilate per trattenere il tessuto sclerale su ciascun lato e tirare lo strato sclerale con molta attenzione per rimuoverlo dalla retina neurale. Ripeti questo intorno alla coppa dell'occhio fino a quando tutta la sclera viene rimossa e si ottiene una coppa retinica intatta. Effettuare tagli radiali sulla tazza retinica per appiattirla e generare diverse sezioni distinte utilizzando microscissori di dissezione.Successivamente, utilizzando un punzonatore per biopsia di un millimetro di diametro, tagliare un disco retinico da ciascuna sezione della tazza retinica appiattita. Punzonatura a una distanza uguale dalla testa del nervo ottico. Trasferire gli inserti in rete preverniciati nella piastra di Petri di dissezione usando una pinza.Con l'aiuto di due pennelli per ciglia super fini, posizionare il disco di punzonatura retinica al centro dell'inserto a rete con lo strato di cellule gangliari lato verso il basso toccando la rete e lo strato di fotorecettore rivolto verso l'alto. Per caricare la cartuccia del sensore, estrarre la cassetta della cartuccia del sensore idratata dall'incubatore a 37 gradi Celsius. Dopo aver rimosso il coperchio dell'idro booster, riposizionare la cartuccia del sensore sulla piastra di utilità.Caricare il volume desiderato di soluzioni composte di iniezione nelle porte appropriate tenendo la punta della pipetta con un angolo di 45 gradi, inserendo la punta della pipetta a metà strada in una porta di iniezione con la smussatura della punta contro la parete opposta della porta di iniezione. Caricare delicatamente il composto in ogni porta. Caricare la cartuccia del sensore nella macchina per la calibrazione facendo clic sul pulsante Avvia esecuzione per aprire il vassoio della macchina.Inserire la cartuccia del sensore nella macchina e fare clic sul pulsante Sono pronto per avviare la calibrazione. Caricare il volume desiderato del mezzo di analisi in ciascun pozzetto della piastra di cattura dell'isolotto. Usando la pinza, afferrare il bordo dell'inserto a rete contenente dischi di punzonatura retinica ed estrarlo dalla capsula di Petri.Picchiettare leggermente il fondo dell'inserto a rete su un tessuto assorbente per rimuovere il liquido extra e metterlo nel pozzetto della piastra di cattura dell'isolotto. Ripetere questo passaggio fino a quando tutti gli inserti mesh con punzoni retinici vengono inseriti nella piastra di cattura dell'isolotto riempiendo i pozzetti di correzione dello sfondo e i pozzetti vuoti con inserti a rete vuoti. Utilizzando due pinze Graefe, premere il bordo di ciascun inserto a rete con attenzione e delicatezza, assicurandosi che questi siano inseriti saldamente nella parte inferiore della piastra di cattura dell'isolotto.Posizionare la piastra di cattura dell'isolotto caricata in un incubatore a 37 gradi Celsius per cinque minuti per riscaldarsi, quindi espellere la piastra di utilità al termine della calibrazione. Sostituirlo con la piastra di cattura dell'isolotto contenente punzoni retinici e riprendere l'esecuzione del test facendo clic sul pulsante della piastra della cella di carico. Al termine dell'esecuzione, espellere la cartuccia del sensore e la piastra di acquisizione dell'isolotto contenente punzoni retinici facendo clic sul pulsante di espulsione, quindi fare clic sul pulsante Fatto in modo che i dati vengano salvati automaticamente come file ASYR e lo schermo cambi automaticamente per visualizzare i risultati.Il test dello stress mitocondriale che mostra una traccia OCR e un test della velocità glicolitica che mostra sia la traccia OCR che la traccia ECAR sono stati eseguiti utilizzando dischi perforati retinici da un millimetro appena sezionati. Nel test dello stress mitocondriale, Bam15 è stato iniettato per disaccoppiare il gradiente protonico dalla produzione di ATP mitocondriale, con conseguente aumento dell'OCR al massimo livello. Rotenone e antimicina A sono stati iniettati per inibire la respirazione dei mitocondri rispettivamente nel complesso uno e nel complesso tre, con conseguente calo dell'OCR al livello minimo.La differenza tra il livello massimo di OCR e l'ultima misurazione del livello di OCR basale riflette la capacità di riserva mitocondriale. Nel test della velocità glicolitica, l'iniezione di rotenone e antimicina A arresta la respirazione mitocondriale e spinge la glicolisi più in alto. La glicolisi viene colta iniettando 2-deossi-d-glucosio, che compete con il glucosio per il legame con l'esochinasi, causando la caduta dell'ECAR al livello minimo.La differenza tra il livello massimo di glico ECAR nell'ultima misura del livello basale di glico ECAR riflette la capacità di riserva di glicolisi. Per produrre dati affidabili, è fondamentale ottenere una buona qualità dei dischi di punzonatura retinica e limitare il tempo totale di dissezione entro 1,5 ore. Seguendo l'esperimento, si può quantificare il DNA del contenuto proteico di un disco retinico in un pozzo e usarlo per normalizzare i dati del cavalluccio marino.Quindi questo protocollo è stato utilizzato per studiare lo sviluppo, l'invecchiamento e la malattia nella retina. È stata anche analizzata la preferenza tissutale o la dipendenza da diversi substrati di carburante come glucosio o acidi grassi.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Trasfezione delle cellule gangliari della retina di topo In vivo Elettroporazione

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Ricerca

Neuroscienze

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Neuroimaging funzionale con l&#39;impiego dell&#39;ecografia emato-encefalica e la barriera di Turbativa del Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

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