Name: determination of mitochondrial respiration and glycolysis in ex vivo retinal tissue samples
Uploaded: 2021-08-04T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples at JoVE.com

이 작품은 국립 안과 연구소 (ZIAEY000450 및 ZIAEY000546)의 교내 연구 프로그램에 의해 지원됩니다.

모든 마우스 프로토콜은 국립 안과 연구소의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었다 (NEI ASP # 650). 마우스는 12h 어두운 조건에 보관하고 실험실 동물의 배려 그리고 사용을 위한 가이드의 권고, 실험실 동물 자원 연구소 및 실험실 동물의 인도적인 배려 그리고 사용에 대한 공중 위생 서비스 정책의 권고에 따라 배려되었습니다.
1. 센서 카트리지를 수분화하고 분석 매체의...

<ol>
	<li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+In+sickness+and+in+health.">Mitochondria: In sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li><li>Wong-Riley, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+the+visual+system.">Energy metabolism of the visual system.</a> Eye Brain. 2, 99-116 (2010).</li><li>Yu, D. Y., Cringle, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+distribution+and+consumption+within+the+retina+in+vascularised+and+avascular+retinas+and+in+animal+models+of+retinal+disease.">Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease.</a> Progress in Retina and Eye Research. 20, 175-208 (2001).</li><li>Barot, M., Gokulgandhi, M. R., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+retinal+diseases.">Mitochondrial dysfunction in retinal diseases.</a> Current Eye Research. 36 (12), 1069-1077 (2011).</li><li>Joyal, J. S., Gantner, M. L., Smith, L. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+energy+demands+control+vascular+supply+of+the+retina+in+development+and+disease:+The+role+of+neuronal+lipid+and+glucose+metabolism.">Retinal energy demands control vascular supply of the retina in development and disease: The role of neuronal lipid and glucose metabolism.</a> Progress in Retina and Eye Research. 64, 131-156 (2018).</li><li>Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose,+lactate,+and+shuttling+of+metabolites+in+vertebrate+retinas.">Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas.</a> Journal of Neuroscience Research. 93 (7), 1079-1092 (2015).</li><li>Haydinger, C. D., Kittipassorn, T., Peet, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+to+see-Drivers+of+aerobic+glycolysis+in+the+mammalian+retina:+A+review.">Power to see-Drivers of aerobic glycolysis in the mammalian retina: A review.</a> Clinical and Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1057-1071 (2020).</li><li>Wright, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan+and+mitochondrial+control+of+neurodegeneration.">Lifespan and mitochondrial control of neurodegeneration.</a> Nature Genetics. 36, 1153-1158 (2004).</li><li>Bossy-Wetzel, E., Schwarzenbacher, R., Lipton, S. 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J., Sennlaub, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+retinal+metabolic+dysfunction+at+the+center+of+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration.">Is retinal metabolic dysfunction at the center of the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), (2019).</li><li>Vlachantoni, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+severe+mitochondrial+oxidative+stress+and+a+protective+effect+of+low+oxygen+in+mouse+models+of+inherited+photoreceptor+degeneration.">Evidence of severe mitochondrial oxidative stress and a protective effect of low oxygen in mouse models of inherited photoreceptor degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 20 (2), 322-335 (2011).</li><li>Grenell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MPC1+reprograms+retinal+metabolism+to+impair+visual+function.">Loss of MPC1 reprograms retinal metabolism to impair visual function.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (9), 3530-3535 (2019).</li><li>Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+degeneration:+genetic+and+mechanistic+dissection+of+a+complex+trait.">Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait.</a> Nature Reviews in Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).</li><li>Jarrett, S. G., Boulton, M. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+light+and+darkness+on+oxygen+distribution+and+consumption+in+the+cat+retina.">Effects of light and darkness on oxygen distribution and consumption in the cat retina.</a> Journal of General Physiology. 88 (4), 521-542 (1986).</li><li>Medrano, C. J., Fox, D. 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K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+mitochondrial+oxygen+consumption+in+the+retina+ex+vivo:+applications+for+retinal+disease.">Determination of mitochondrial oxygen consumption in the retina ex vivo: applications for retinal disease.</a> Methods in Molecular Biology. 1753, 167-177 (2018).</li><li>. Agilent Mitocondrial stress test user guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Cell_Mito_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Cell_Mito_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent Glycolytic rate assay user guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent wave 2.6 user guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf</a> (2021)</li><li>. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf">https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf</a> (2021)</li><li>. Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf</a> (2021)</li><li>. Report Generator User Guide Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent Seahorse XF Buffer Factor Protocol Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent sensor cartridges and cell culture microplates Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf</a> (2021)</li><li>Fan, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioassay+to+measure+energy+metabolism+in+mouse+colonic+crypts,+organoids,+and+sorted+stem+cells.">A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309, 1-9 (2015).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-+and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li><li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina.">The major cell populations of the mouse retina.</a> Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).</li><li>Akimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+GFP+to+newborn+rods+by+Nrl+promoter+and+temporal+expression+profiling+of+flow-sorted+photoreceptors.">Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (10), 3890-3895 (2006).</li><li>Kenwood, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+mitochondrial+uncoupler+that+does+not+depolarize+the+plasma+membrane.">Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane.</a> Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).</li><li>Corso-Diaz, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+identifies+DNA+methylation+signatures+of+aging+in+rod+photoreceptors+associated+with+alterations+in+energy+metabolism.">Genome-wide profiling identifies DNA methylation signatures of aging in rod photoreceptors associated with alterations in energy metabolism.</a> Cell Reports. 31 (3), 107525 (2020).</li><li>Berkowitz, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiration+in+outer+retina+contributes+to+light-evoked+increase+in+hydration+in+vivo.">Mitochondrial respiration in outer retina contributes to light-evoked increase in hydration in vivo.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (15), 5957-5964 (2018).</li><li>Joyal, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+lipid+and+glucose+metabolism+dictates+angiogenesis+through+the+lipid+sensor+Ffar1.">Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1.</a> Nature Medicine. 22 (4), 439-445 (2016).</li></ol>

여기에 제공된 미토콘드리아 호흡 및 글리코리시스 활성의 마이크로플레이트 기반 의 작용을 전 생체, 갓 해부한 망막 펀치 디스크를 사용하여 수행하기 위한 자세한 지침이 있습니다. 프로토콜은 최적화되었습니다 : 1) 전 생체 망막 조직에 적합한 분석 매체의 사용을 보장; 2) 장비의 최적의 검출 범위에 속하는 OCR 및 ECAR 판독값을 얻기 위해 망막 펀치 디스크의 적절한 크기를 고용;...

미토콘드리아는 여러 가지 중요한 생리적 과정을 조정하여 세포 대사, 신호, 항상성 및 세포 사멸을 조절하는 필수 세포기관입니다1. 미토콘드리아는 산화 인산화(OXPHOS)를 통해 아데노신 삼위산염(ATP)을 생성하고 거의 모든 세포 이벤트를 지원하는 에너지를 제공하는 세포의 강국역할을 합니다. 세포 산소의 대다수는 유산소 호흡 도중 전자 수송 사슬 (ETC)에 있는 최종 전자 수용자로 작용하는 미토콘드리아에서 대사됩니다. 낮은 양의 ATP는 또한 포도당이 피루바테로 변환되는 시토솔의 글리코리시스로부터 생산될 수 있으며, 이는 젖산으로 더 변환되거나 미토콘드리아로 이송되고 삼환산성 사이클(TCA 사이클)의 기판인 아세틸-코아로 산화될 수 있다.
망막은 포유류에서 가장 신진 대사 활성 조직 중 하나입니다2, 미토콘드리아 호흡의 높은 수준을 표시하 고 매우 높은 산소 소비3. 막대와 콘 광수용체는 미토콘드리아4의 고밀도를 함유하고 있으며, OXPHOS는 망막5에서 대부분의 ATP를 생성한다. 또한, 망막은 또한 유산소 글리코리시스6,7에 크게 의존하여 포도당을 락테이트5로 변환합니다. 미토콘드리아 결함은 다양한 신경 퇴행성 질환과 연관되어 있습니다8,9; 그리고 그것의 독특한 높은 에너지 요구와 함께, 망막은 미토콘드리아 OXPHOS4 및 glycolysis10에 영향을 미치는 사람들을 포함하여 신진 대사 결함에 특히 취약합니다. 글리코리시스의 미토콘드리아 기능 장애 및 결함은 망막11,12 및 황반13 퇴행성 질환, 연령 관련 황반 변성10,14,15,16 및 당뇨병 성 망막증17,18에 연루되어 있습니다. 따라서 미토콘드리아 호흡 및 글리코리시스의 정확한 측정은 망막의 무결성과 건강을 평가하기 위한 중요한 매개 변수를 제공할 수 있습니다.
미토콘드리아 호흡은 산소 소비율(OCR)의 측정을 통해 측정될 수 있다. 포도당이 피루바테로 전환되고 젖산으로 전환하여 세포 외 환경의 배설 및 세포 외 환경의 산성화를 초래한다는 점을 감안할 때, 세포외 산성화율(ECAR)의 측정은 글리코리시스 플럭스의 표시를 제공한다. 망막은 기판6의 교환을 포함하여 친밀한 관계 및 적극적인 시너지를 가진 다중 세포 모형으로 구성되기 때문에, 온전한 적층 및 회로를 가진 전체 망막 조직의 맥락에서 미토콘드리아 기능 및 물질 대사를 분석하는 것이 필수적이다. 지난 수십 년 동안, 클라크 타입 O2 전극 및 그밖 산소 미세 전극은 망막19,20,21에 있는 산소 소비를 측정하기 위하여 이용되었습니다. 이러한 산소 전극은 감도에 있는 중요한 한계, 큰 견본 부피의 요구 사항 및 일반적으로 세포 및 조직 문맥의 중단으로 이끌어 내는 일시 중단 견본의 연속적인 교반을 위한 필요를 가지고 있습니다. 여기서 설명된 프로토콜은 마이크로플레이트 계의 형광 기술을 사용하여 새로 해부된 전 생체 내 마우스 망막 조직에서 미토콘드리아 에너지 대사를 측정하여 개발되었다. 그것은 서스펜션 및 연속 교반의 필요성을 피하면서 전 생체 망막 조직의 작은 샘플 (1mm 펀치)를 사용하여 동시에 OCR과 ECAR모두의 중간 처리량 실시간 측정을 허용합니다.
여기에 입증된 미토콘드리아 스트레스 분석 및 글리코리질 속도 분석시 에 대한 실험 절차로, 갓 해부된 망막 펀치 디스크에 대한 분석. 이 프로토콜은 전 생체 조직 맥락에서 미토콘드리아 관련 대사 활동의 측정을 허용한다. 배양된 세포를 사용하여 수행된 애서와는 달리, 여기서 얻은 수치는 조직 수준에서 결합된 에너지 대사를 반영하고 조직 내의 상이한 세포 유형 간의 상호 작용에 의해 좌우된다. 이 프로토콜은 이전에 게시된 버전22,23에서 수정되어 Islet Capture 플레이트를 사용하여 애질런트 해마 세포 외 플럭스 24-wells(XFe24) 분석기의 새로운 세대에 적응합니다. 분석 매체, 주사 화합물 농도, 및 분석 주기의 수/기간 또한 망막 조직에 대 한 최적화 되었습니다. 망막 펀치 디스크의 준비를 위해 자세한 단계별 프로토콜이 제공됩니다. 프로그램 설정 및 데이터 분석에 대한 자세한 내용은 제조업체의 사용자 가이드24,25,26에서 얻을 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6134</td>
			<td>Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-gauge needle</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A, 10 mM stock solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bam15, 10 mM stock solution</td>
			<td>TimTec</td>
			<td>ST056388</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy puncher, 1 mm</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>33-31AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 asphyxiation chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection forceps-Dumont #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>Stright tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection forceps-Dumont #7</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11274-20</td>
			<td>Curved tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>Curved, Serrated tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15004-08</td>
			<td>Curved tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH solution, 1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8263</td>
			<td>Aqueous solution, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone, 10 mM stock solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse calibration medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 1.0 M glucose</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103577-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 100 mM pyruvate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103578-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 200 mM glutamine</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103579-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF DMEM medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>pH 7.4, with 5 mM HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103518-100</td>
			<td>Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate solution, 0.1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Aqueous solution, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfine eyelash brush</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>113</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of mitochondrial respiration and glycolysis in ex vivo retinal tissue samples

미토콘드리아 호흡은 모든 세포, 특히 고활성 신진 대사를 가진 망막 광수용체에서 중요한 에너지 생성 경로입니다. 또한, 광수용체는 또한 암세포와 같은 높은 유산소 글리코리시스를 나타낸다. 이러한 신진 대사 활동의 정확한 측정생리 조건 및 질병 상태에서 세포 항상성에 귀중 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 높은 처리량 마이크로 플레이트 기반 의 소사는 살아있는 세포에서 미토콘드리아 호흡 및 다양한 대사 활동을 측정하기 위해 개발되었습니다. 그러나, 이들 중 대부분은 배양 된 세포를 위해 개발 되고 그대로 조직 샘플 및 응용 프로그램 ex vivo에 대 한 최적화 되지 않았습니다. 여기에 설명된 상세한 단계별 프로토콜은 마이크로플레이트 기반 형광 기술을 사용하여 미토콘드리아 호흡의 지표로서 산소 소비율(OCR)을 직접 측정하고, 전 생체 망막 조직에서, 글리코리시스의 지표로서 세포외산성화율(ECAR)을 직접 측정한다. 이 방법은 성공적으로 성인 마우스 망막에서 신진 대사 활동을 평가하고 노화와 질병의 세포 메커니즘을 조사에 그것의 응용 프로그램을 입증하는 데 사용되었습니다.

여기에 보고된 데이터는 OCR 추적(도 1) 및 OCR 추적 및 ECAR 추적(그림 2)을 보여주는 대표적인 미토콘드리아 응력 분석서이며, 이는 4개월 된 트랜스제닉 Nrl-L-EGFP mice36 (C57B/L6 배경)에서 갓 해부된 1mm 망막 펀치 디스크를 사용하여 수행되었다. 이 마우스는 일반적인 망막 발달, 조직학 및 생리학을 변경하지 않고 막대 광수용체에서 ...

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Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

여기에 기재된 미토콘드리아 응력 분석기 및 글리코리질 속도 분석기의 상세한 프로토콜은 상용 생체 분석기를 이용한 전 생체 망 막 조직 샘플에서 이다.

전 비보 망막 조직 샘플에서 미토콘드리아 호흡 및 글리코리시스의 결정

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. ...

이 프로토콜은 두 가지 주요 생체 에너지 경로의 실시간 분석을 제공합니다: 미토콘드리아 호흡 및 글리코리시스에서 갓 해부된 전 생체 내 마우스 망막 조직. 전통적인 해마 분석은 배양단 단층 세포에 집중되었습니다, 이 프로토콜은 연구원이 갓 해부한 조직에서 미토콘드리아 활동을 연구하는 동안, 특히 망막. 이 기술은 상속된 망막 변성 마우스 모형의 망막에 있는 미토콘드리아의 활동 및 글리코리시스 깃발을 공부하는 데 사용됩니다.그것은 망막 연구를 유용한 도구이며 잠재적 인 치료를 개발하기 위해 조직의 다른 유형에 적용 될 가능성이있다. 이 프로토콜의 가장 어려운 부분은 갓 해부 된 마우스 망막에서 품질 펀치 디스크를 얻는 것입니다, 그래서이 기술을 수행 할 개인이 좋은 망막 해부 기술을 가지고하는 것이 좋습니다. 실험 전날 센서 카트리지 카세트를 열고 1밀리리터의 교정 매체를 유틸리티 플레이트의 각 웰에 추가합니다.이산화탄소가 없는 인큐베이터에서 하룻밤 동안 37도의 인큐베이터에서 배양하여 형광을 활성화합니다. 실험 당일, 원료로부터 희석 화합물 약물로 분석 매체를 준비한다. 섭씨 37도의 수조에서 분석 매체를 데우습니다.텍스트 원고에 설명된 대로 컴퓨터에 분석 프로그램을 설정합니다. 메쉬 인서트가 포함된 카세트의 뚜껑을 엽니다. 각 메쉬 인서트에 코팅 믹스의 파이펫 8 마이크로리터, 다음 부드럽게 메쉬 삽입 을 통해 코팅 믹스를 배포 주위에 방울을 확산 파이펫 팁을 사용합니다.카세트를 닫고 메쉬 인서트가 흡수를 위해 실온에서 25분 이상 배양할 수 있도록 합니다. 인큐베이션 후 분석 매체의 4밀리리터를 인서트에 직접 피펫하여 메쉬 인서트를 세척합니다. 카세트를 부드럽게 흔들어 모든 메쉬 인서트가 분석 매체로 세척되도록 합니다.망막 펀치를 준비하려면 성인 안락사 마우스에서 눈을 방출하고 페트리 접시에 얼음 차가운 PBS에 넣은 다음 페트리 접시를 해부 현미경 아래에 놓습니다. 미세 시체를 사용하여 시신경을 잘라낸 다음 안구 외부에 부착된 여분의 근육을 조심스럽게 제거합니다. 30 게이지 바늘을 사용하여 각막 가장자리에 구멍을 뚫습니다.그런 다음 미세 해부 미세 시저를 사용하여 각막 가장자리를 따라 원형 절단을 합니다. 날카로운 해부 집게를 사용하여 각막, 렌즈 및 유리체 유머를 아이 컵에서 제거하십시오. 미세 해부 미세 시저를 사용하여 눈 컵의 가장자리에 있는 경층 층에 몇 가지 작은 상처를 만듭니다.두 개의 날카로운 해부 집게를 사용하여 양쪽의 경추 조직을 잡고 경마 층을 매우 조심스럽게 당겨 신경 망막에서 제거하십시오. 모든 clera가 제거되고 그대로 망막 컵이 얻어질 때까지 아이 컵 주위에 이것을 반복하십시오. 망막 컵에 방사형 컷을 만들어 평평해지고 해부 미세 시저를 사용하여 여러 개의 뚜렷한 섹션을 생성합니다.다음으로, 1밀리미터 직경의 생검 펀처를 사용하여 평평한 망막 컵의 각 섹션에서 망막 디스크 하나를 잘라냅니다. 시신경 헤드와 동일한 거리에서 펀치. 미리 코팅된 메쉬 인서트를 집게를 사용하여 페트리 접시에 옮킨다.두 개의 슈퍼 미세 속눈썹 브러시의 도움으로 망막 펀치 디스크를 메쉬 와 광수용체 층을 향한 신경절 세포 층 측면으로 메쉬 인서트의 중앙에 놓습니다. 센서 카트리지를 로드하려면 수화 센서 카트리지 플레이트 카세트를 섭씨 37도 인큐베이터에서 꺼내십시오. 하이드로 부스터 커버를 제거한 후 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 다시 놓습니다.파이펫 팁을 45도 각도로 잡고, 사출 포트의 반대 쪽 벽에 대한 팁의 경사와 함께 사출 포트에 피펫 팁을 중간 삽입하여 적절한 포트에 주입 화합물 솔루션의 원하는 볼륨을 로드합니다. 화합물을 각 포트에 부드럽게 로드합니다. 센서 카트리지를 기기에 로드하여 시작 실행 버튼을 클릭하여 교정을 위해 장비 트레이를 엽니다.센서 카트리지를 기기에 넣고 보정을 시작할 준비가 된 버튼을 클릭합니다. 분석 매체의 원하는 부피를 각 우물에 적재하여 각 우물에 적재하여 플레이트를 캡처합니다. 집게를 사용하여 망막 펀치 디스크가 들어있는 메쉬 인서트의 테두리를 잡고 페트리 접시에서 꺼내십시오.흡수닦기 티슈에 메쉬 인서트 의 바닥을 가볍게 두드려 여분의 액체를 제거하고 아슬레 캡처 플레이트의 우물에 넣습니다. 망막 펀치가 있는 모든 메쉬 인서트가 빈 메쉬 인서트로 배경 보정 우물과 빈 우물을 채우는 아슬렛 캡처 플레이트에 배치될 때까지 이 단계를 반복합니다. 두 개의 Graefe 집게를 사용하여 각 메쉬 인서트의 테두리를 신중하고 부드럽게 눌러 이 것들이 아일렛 캡처 플레이트의 바닥에 단단히 삽입되도록 합니다.로드된 아슬렛 캡처 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터에 넣고 5분간 워밍업한 다음 교정이 완료된 후 유틸리티 플레이트를 배출합니다. 망막 펀치가 들어 있는 islet 캡처 플레이트로 교체하고 로드 셀 플레이트 버튼을 클릭하여 분석 실행을 다시 시작합니다. 실행이 완료되면 센서 카트리지와 방출 버튼을 클릭하여 망막 펀치가 포함된 islet 캡처 플레이트를 꺼내서 데이터가 ASYR 파일로 자동으로 저장되고 화면이 자동으로 변경되어 표시되도록 완료된 버튼을 클릭합니다.OCR 및 ECAR 추적을 모두 나타내는 OCR 추적 및 글리코리질 속도 분석기를 보여주는 미토콘드리아 응력 분석은 갓 해부된 1mm 망막 펀치 디스크를 사용하여 수행하였다. 미토콘드리아 스트레스 분석에서 Bam15는 미토콘드리아 ATP 생산에서 양성자 그라데이션을 분리하여 OCR을 최대 수준으로 증가시도록 주입되었습니다. 로테네안 및 항마이신 A는 각각 복잡한 하나 및 복잡한 3개에서 미토콘드리아 호흡을 억제하도록 주입되어 OCR이 최소 수준으로 떨어졌다.OCR의 최대 수준과 기저 OCR 수준의 마지막 측정 사이의 차이는 미토콘드리아 예비 용량을 반영합니다. 글리코리틱 속도 분석에서 로테네안 과 항마이신 A의 주사는 미토콘드리아 호흡을 차단하고 글리코리시스를 더 높게 유도합니다. 글리코리시스는 헥소키나아제 결합을 위한 포도당과 경쟁하는 2-deoxy-d-포도당을 주입하여 압수되어 ECAR가 최소한의 수준으로 떨어지게 합니다.글리코 ECAR 기저 레벨의 마지막 측정에서 글리코 ECAR의 최대 수준 사이의 차이는 글리코 리저브 용량을 반영한다. 신뢰할 수 있는 데이터를 생성하려면 망막 펀치 디스크의 품질을 얻고 1.5시간 이내에 총 해부 시간을 제한하는 것이 중요합니다. 실험후, 망막 디스크의 단백질 함량의 DNA를 잘 정량화하고 이를 사용하여 해마 데이터를 정상화할 수 있다.그래서 이 프로토콜은 망막에 있는 발달, 노화 및 질병을 공부하기 위하여 이용되었습니다. 포도당 또는 지방산과 같은 상이한 연료 기판에 대한 조직 선호도 또는 의존도 분석되었다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

연구

신경과학

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

라이브 랫 두피 뉴런에서 Mitochondrial 분리막 잠재력과 반응 산소 종의 결정

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

초음파 혈액 - 뇌 장벽 파괴 및 망간 향상된 MRI를 사용하여 기능성 Neuroimaging

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

의 해부, 문화, 및 분석<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; 배아 망막 조직

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

본래 Vomeronasal 기관 및 액세서리 후각 망울의 생체 준비

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

동시<em&gt; 생체</em두 망막의&gt; 기능 테스트로<em&gt; 생체</em&gt; 전위도 시스템

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

뇌 조각의 공포 회로의 예 생체 Optogenetic 해부

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

에서 곤충 모델에서 시각 세포 스펙트럼 감도의 결정<em&gt; 생체</em&gt; 세포 내 녹음

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Ex Vivo 실험 이미징에 대 한 성인 제 브라에서 준비 신선한 망막 조각

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

생체 내 뇌 단백질 합성의 지역 비율 측정을 위한 정량적 자가 방사선 측정 방법

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...