Name: determination of mitochondrial respiration and glycolysis in ex vivo retinal tissue samples
Uploaded: 2021-08-04T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples at JoVE.com

Dette arbeidet støttes av Intramural Research Program ved National Eye Institute (ZIAEY000450 og ZIAEY000546).

Alle museprotokoller ble godkjent av Dyrepleie- og brukskomiteen ved National Eye Institute (NEI ASP# 650). Mus ble plassert i 12 timer lyse mørke forhold og brydde seg om ved å følge anbefalingene fra Guide for care and use of Laboratory Animals, Institute of Laboratory Animal Resources og Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals.
1. Fuktighetsgivende sensorpatron og tilberedning av analysemediet
<ol><li>Dagen før eksperimentet legger du til 1 ml av kali...

<ol>
	<li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+In+sickness+and+in+health.">Mitochondria: In sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li><li>Wong-Riley, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+the+visual+system.">Energy metabolism of the visual system.</a> Eye Brain. 2, 99-116 (2010).</li><li>Yu, D. Y., Cringle, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+distribution+and+consumption+within+the+retina+in+vascularised+and+avascular+retinas+and+in+animal+models+of+retinal+disease.">Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease.</a> Progress in Retina and Eye Research. 20, 175-208 (2001).</li><li>Barot, M., Gokulgandhi, M. R., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+retinal+diseases.">Mitochondrial dysfunction in retinal diseases.</a> Current Eye Research. 36 (12), 1069-1077 (2011).</li><li>Joyal, J. S., Gantner, M. L., Smith, L. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+energy+demands+control+vascular+supply+of+the+retina+in+development+and+disease:+The+role+of+neuronal+lipid+and+glucose+metabolism.">Retinal energy demands control vascular supply of the retina in development and disease: The role of neuronal lipid and glucose metabolism.</a> Progress in Retina and Eye Research. 64, 131-156 (2018).</li><li>Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose,+lactate,+and+shuttling+of+metabolites+in+vertebrate+retinas.">Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas.</a> Journal of Neuroscience Research. 93 (7), 1079-1092 (2015).</li><li>Haydinger, C. D., Kittipassorn, T., Peet, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+to+see-Drivers+of+aerobic+glycolysis+in+the+mammalian+retina:+A+review.">Power to see-Drivers of aerobic glycolysis in the mammalian retina: A review.</a> Clinical and Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1057-1071 (2020).</li><li>Wright, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan+and+mitochondrial+control+of+neurodegeneration.">Lifespan and mitochondrial control of neurodegeneration.</a> Nature Genetics. 36, 1153-1158 (2004).</li><li>Bossy-Wetzel, E., Schwarzenbacher, R., Lipton, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathways+to+neurodegeneration.">Molecular pathways to neurodegeneration.</a> Nature Medicine. 10, 2-9 (2004).</li><li>Leveillard, T., Philp, N. J., Sennlaub, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+retinal+metabolic+dysfunction+at+the+center+of+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration.">Is retinal metabolic dysfunction at the center of the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), (2019).</li><li>Vlachantoni, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+severe+mitochondrial+oxidative+stress+and+a+protective+effect+of+low+oxygen+in+mouse+models+of+inherited+photoreceptor+degeneration.">Evidence of severe mitochondrial oxidative stress and a protective effect of low oxygen in mouse models of inherited photoreceptor degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 20 (2), 322-335 (2011).</li><li>Grenell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MPC1+reprograms+retinal+metabolism+to+impair+visual+function.">Loss of MPC1 reprograms retinal metabolism to impair visual function.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (9), 3530-3535 (2019).</li><li>Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+degeneration:+genetic+and+mechanistic+dissection+of+a+complex+trait.">Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait.</a> Nature Reviews in Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).</li><li>Jarrett, S. G., Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+oxidative+stress+in+age-related+macular+degeneration.">Consequences of oxidative stress in age-related macular degeneration.</a> Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 399-417 (2012).</li><li>Rozing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration:+A+two-level+model+hypothesis.">Age-related macular degeneration: A two-level model hypothesis.</a> Progress in Retina Eye Research. 76, 100825 (2020).</li><li>Yokosako, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolysis+in+patients+with+age-related+macular+degeneration.">Glycolysis in patients with age-related macular degeneration.</a> Open Ophthalmology Journal. 8, 39-47 (2014).</li><li>Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+diabetic+retinopathy.">Mitochondrial dysfunction and diabetic retinopathy.</a> Mitochondrion. 36, 4-6 (2017).</li><li>Yumnamcha, T., Guerra, M., Singh, L. P., Ibrahim, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+dysregulation+and+neurovascular+dysfunction+in+diabetic+retinopathy.">Metabolic dysregulation and neurovascular dysfunction in diabetic retinopathy.</a> Antioxidants. 9 (12), (2020).</li><li>Futterman, S., Kinoshita, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+retina.+I.+Respiration+of+cattle+retina.">Metabolism of the retina. I. Respiration of cattle retina.</a> Journal of Biological Chemistry. 234 (4), 723-726 (1959).</li><li>Linsenmeier, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+light+and+darkness+on+oxygen+distribution+and+consumption+in+the+cat+retina.">Effects of light and darkness on oxygen distribution and consumption in the cat retina.</a> Journal of General Physiology. 88 (4), 521-542 (1986).</li><li>Medrano, C. J., Fox, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+consumption+in+the+rat+outer+and+inner+retina:+light-+and+pharmacologically-induced+inhibition.">Oxygen consumption in the rat outer and inner retina: light- and pharmacologically-induced inhibition.</a> Experiments in Eye Research. 61 (3), 273-284 (1995).</li><li>Kooragayala, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+oxygen+consumption+in+retina+ex+vivo+demonstrates+limited+reserve+capacity+of+photoreceptor+mitochondria.">Quantification of oxygen consumption in retina ex vivo demonstrates limited reserve capacity of photoreceptor mitochondria.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).</li><li>Adlakha, Y. K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+mitochondrial+oxygen+consumption+in+the+retina+ex+vivo:+applications+for+retinal+disease.">Determination of mitochondrial oxygen consumption in the retina ex vivo: applications for retinal disease.</a> Methods in Molecular Biology. 1753, 167-177 (2018).</li><li>. Agilent Mitocondrial stress test user guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Cell_Mito_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Cell_Mito_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent Glycolytic rate assay user guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent wave 2.6 user guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf</a> (2021)</li><li>. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf">https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf</a> (2021)</li><li>. Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf</a> (2021)</li><li>. Report Generator User Guide Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent Seahorse XF Buffer Factor Protocol Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent sensor cartridges and cell culture microplates Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf</a> (2021)</li><li>Fan, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioassay+to+measure+energy+metabolism+in+mouse+colonic+crypts,+organoids,+and+sorted+stem+cells.">A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309, 1-9 (2015).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-+and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li><li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina.">The major cell populations of the mouse retina.</a> Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).</li><li>Akimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+GFP+to+newborn+rods+by+Nrl+promoter+and+temporal+expression+profiling+of+flow-sorted+photoreceptors.">Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (10), 3890-3895 (2006).</li><li>Kenwood, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+mitochondrial+uncoupler+that+does+not+depolarize+the+plasma+membrane.">Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane.</a> Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).</li><li>Corso-Diaz, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+identifies+DNA+methylation+signatures+of+aging+in+rod+photoreceptors+associated+with+alterations+in+energy+metabolism.">Genome-wide profiling identifies DNA methylation signatures of aging in rod photoreceptors associated with alterations in energy metabolism.</a> Cell Reports. 31 (3), 107525 (2020).</li><li>Berkowitz, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiration+in+outer+retina+contributes+to+light-evoked+increase+in+hydration+in+vivo.">Mitochondrial respiration in outer retina contributes to light-evoked increase in hydration in vivo.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (15), 5957-5964 (2018).</li><li>Joyal, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+lipid+and+glucose+metabolism+dictates+angiogenesis+through+the+lipid+sensor+Ffar1.">Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1.</a> Nature Medicine. 22 (4), 439-445 (2016).</li></ol>

Her er detaljerte instruksjoner for å utføre mikroplatebaserte analyser av mitokondrie-respirasjon og glykolyseaktivitet ved hjelp av ex vivo, ny dissekerte retinal punch disker. Protokollen er optimalisert for å: 1) sikre bruk av et egnet analysemedium for ex vivo retinal vev; 2) bruke riktig størrelse på retinal punch disker for å oppnå OCR og ECAR avlesninger som faller innenfor maskinens optimale detekteringsområde; 3) belegg mesh innsatser for å forbedre klebeevnen av retinal punch for sta...

Mitokondrier er essensielle organeller som regulerer cellulær metabolisme, signalering, homeostase og apoptose ved å koordinere flere viktige fysiologiske prosesser1. Mitokondrier fungerer som kraftstasjonen i cellen for å generere adenosintrifosfat (ATP) gjennom oksidativ fosforylering (OXPHOS) og gi energi som støtter nesten alle cellulære hendelser. Mesteparten av cellulær oksygen metaboliseres i mitokondrier, hvor det fungerer som den endelige elektron akseptoren i elektrontransportkjeden (ETC) under aerob åndedrett. Lave mengder ATP kan også produseres fra glykolyse i cytosolen, hvor glukose omdannes til pyruvat, som kan omdannes ytterligere til laktat eller transporteres til mitokondrier og oksideres til acetyl-CoA, et substrat i trikarboksylsyresyklusen (TCA-syklus).
Netthinnen er et av de mest metabolsk aktive vevene hos pattedyr2, og viser høye nivåer av mitokondrie respirasjon og ekstremt høyt oksygenforbruk3. Stangen og kjeglefotoreseptorene inneholder en høy tetthet av mitokondrier4, og OXPHOS genererer de fleste ATP i netthinnen5. I tillegg er netthinnen også avhengig av aerob glykolyse6,7 ved å konvertere glukose til laktat5. Mitokondriefeil er forbundet med ulike nevrodegenerative sykdommer8,9; og med sine unike høye energibehov er netthinnen spesielt sårbar for metabolske defekter, inkludert de som påvirker mitokondrie OXPHOS4 og glykolyse10. Mitokondrie dysfunksjon og defekter i glykolyse er involvert i retinal11,12 og macular13 degenerative sykdommer, aldersrelatert makuladegenerasjon10,14,15,16, og diabetisk retinopati17,18. Derfor kan nøyaktige målinger av mitokondrie respirasjon og glykolyse gi viktige parametere for å vurdere integriteten og helsen til netthinnen.
Mitokondrie respirasjon kan måles gjennom bestemmelse av oksygenforbruk (OCR). Gitt at konvertering av glukose til pyruvat og deretter å laktere resulterer i ekstrudering av protoner til og forsuring av det ekstracellulære miljøet, gir målinger av den ekstracellulære forsuringsraten (ECAR) en indikasjon på glykolysefluks. Siden netthinnen består av flere celletyper med intime relasjoner og aktiv synergi, inkludert utveksling av substrater6, er det viktig å analysere mitokondriefunksjon og metabolisme i sammenheng med hele netthinnevev med intakt laminering og kretser. De siste tiårene har Clark type O2-elektroder og andre oksygenmikroelektroder blitt brukt til å måle oksygenforbruket i netthinnen19,20,21. Disse oksygenelektrodene har store begrensninger i følsomhet, krav til et stort prøvevolum og behovet for kontinuerlig omrøring av suspendert prøve, noe som vanligvis fører til forstyrrelse av cellulær og vevskontekst. Protokollen beskrevet her ble utviklet ved hjelp av en mikroplatebasert fluorescensteknikk for å måle mitokondrieenergimetabolisme i ny dissekert ex vivo mus netthinnevev. Det tillater mid-throughput sanntidsmålinger av både OCR og ECAR samtidig ved hjelp av en liten prøve (1 mm punch) av ex vivo retinal vev samtidig unngå behovet for suspensjon og kontinuerlig omrøring.
Demonstrert her er den eksperimentelle prosedyren for mitokondrie stressanalyse og glykolytisk hastighetsanalyse på ny dissekerte retinal punch disker. Denne protokollen tillater måling av mitokondrier-relaterte metabolske aktiviteter i en ex vivo vev kontekst. Forskjellig fra analysene som utføres ved hjelp av dyrkede celler, gjenspeiler målingene som er oppnådd her kombinert energimetabolisme på vevsnivå og påvirkes av interaksjoner mellom de forskjellige celletypene i vevet. Protokollen er modifisert fra en tidligere publisert versjon22,23 for å tilpasse seg den nye generasjonen av Agilent Seahorse ekstracellulær flux 24-brønner (XFe24) analysator med Islet Capture plate. Analysemediet, konsentrasjonene av injeksjonsforbindelser og antall/varighet av analysesykluser er også optimalisert for netthinnevev. En detaljert trinnvis protokoll er gitt for fremstilling av retinal punch-disker. Mer informasjon om programoppsett og dataanalyse kan fås fra produsentens brukerhåndbok24,25,26.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6134</td>
			<td>Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-gauge needle</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A, 10 mM stock solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bam15, 10 mM stock solution</td>
			<td>TimTec</td>
			<td>ST056388</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy puncher, 1 mm</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>33-31AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 asphyxiation chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection forceps-Dumont #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>Stright tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection forceps-Dumont #7</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11274-20</td>
			<td>Curved tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>Curved, Serrated tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15004-08</td>
			<td>Curved tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH solution, 1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8263</td>
			<td>Aqueous solution, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone, 10 mM stock solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse calibration medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 1.0 M glucose</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103577-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 100 mM pyruvate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103578-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 200 mM glutamine</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103579-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF DMEM medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>pH 7.4, with 5 mM HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103518-100</td>
			<td>Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate solution, 0.1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Aqueous solution, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfine eyelash brush</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>113</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of mitochondrial respiration and glycolysis in ex vivo retinal tissue samples

Mitokondrie respirasjon er en kritisk energigenererende vei i alle celler, spesielt retinal fotoreseptorer som har en svært aktiv metabolisme. I tillegg viser fotoreseptorer også høy aerob glykolyse som kreftceller. Presise målinger av disse metabolske aktivitetene kan gi verdifull innsikt i cellulær homeostase under fysiologiske tilstander og i sykdomstilstander. Mikroplatebaserte analyser med høy gjennomstrømning er utviklet for å måle mitokondrie-respirasjon og ulike metabolske aktiviteter i levende celler. Imidlertid er et stort flertall av disse utviklet for dyrkede celler og har ikke blitt optimalisert for intakte vevsprøver og for anvendelse ex vivo. Beskrevet her er en detaljert trinnvis protokoll, ved hjelp av mikroplatebasert fluorescensteknologi, for å måle oksygenforbrukshastigheten (OCR) direkte som en indikator på mitokondrie respirasjon, samt ekstracellulær forsuringshastighet (ECAR) som en indikator på glykolyse, i intakt eks vivo retinal vev. Denne metoden har blitt brukt til å vurdere metabolske aktiviteter i voksen mus netthinne og demonstrere sin anvendelse i å undersøke cellulære mekanismer for aldring og sykdom.

Dataene som rapporteres her er representativ mitokondriestressanalyse som viser OCR-spor (figur 1) og glykolytisk hastighetsanalyse som viser OCR-spor og ECAR-spor (figur 2), som ble utført ved hjelp av ny dissekerte 1 mm retinal punch disker fra 4 måneder gamle transgene Nrl-L-EGFP mus36 (C57B / L6 bakgrunn). Disse musene uttrykker GFP spesielt i stang fotoreseptorer uten å endre normal retinal utvikling, histologi og fysiolo...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples at JoVE.com

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Beskrevet her er en detaljert protokoll for å utføre mitokondrie stressanalyse og glykolytisk hastighetsanalyse i ex vivo retinal vevsprøver ved hjelp av en kommersiell bioanalyse.

Bestemmelse av mitokondrie respirasjon og glykolyse i Ex Vivo retinal vevsprøver

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. ...

Denne protokollen gir sanntidsanalyse av to store bioenergetiske veier: mitokondrie respirasjon og glykolyse i ferskt dissekert ex vivo mus retinal vev. Tradisjonell sjøhestanalyse var fokusert på dyrkede monolagede celler, mens denne protokollen gjør det mulig for forskere å studere mitokondrieaktivitet i ny dissekert vev, spesielt netthinnen. Denne teknikken brukes til å studere mitokondriers aktiviteter og glykolyseflagg i netthinner av arvede retinal degenerasjonsmusmodeller.Det er et nyttig verktøy for retinal forskning og har også potensial til å bli brukt på andre typer vev for å utvikle potensielle terapier. Den vanskeligste delen av denne protokollen er å få kvalitet punch plater fra ny dissekert mus netthinnen, så det anbefales at den som skal utføre denne teknikken har gode retinal dissekering ferdigheter. Dagen før eksperimentet åpner du sensorpatronkassetten og legger til en milliliter kalibreringsmedium i hver brønn på strømplaten.Inkuber over natten i en karbondioksidfri inkubator ved 37 grader Celsius for å aktivere fluoroforene. På eksperimentets dag, lag analysemedium i fortynnede sammensatte stoffer fra lager. Varm opp analysemediet i 37 grader Celsius vannbad.Sett opp analyseprogrammet på maskinen som beskrevet i tekstmanuskriptet. Åpne lokket på kassetten som inneholder nettinginnlegg. Pipette åtte mikroliter av beleggblandingen til hver maskeinnsats, og bruk deretter en pipettespiss til forsiktig å spre dråpen rundt for å fordele beleggblandingen likt gjennom hele maskeinnsatsen.Lukk kassetten og la maskeinnsatsene inkubere ved romtemperatur i minst 25 minutter for absorpsjon. Etter inkubasjon, vask nettinginnleggene ved å pipettere fire milliliter av analysemediet direkte på innsatsene. Rist kassetten forsiktig for å sikre at alle nettinginnlegg vaskes med analysemediet.For å forberede retinal punch, enucleate øynene fra en voksen euthanized mus og plassere dem i iskald PBS i en Petri parabolen, deretter plassere Petri parabolen under en disseksjon mikroskop. Bruk mikroscissorer, kutt av synsnerven, og fjern deretter forsiktig de ekstrarectus musklene som er festet utenfor øyebollet. Bruk en 30 gauge nål, slå et hull på kanten av hornhinnen.Bruk deretter fine disseksjonsmikroscissorer for å lage et sirkulært kutt langs kanten av hornhinnen. Bruk skarpe disseksjons tang, fjern hornhinnen, linsen og glasslegemet humor fra øyekoppen. Lag flere små kutt på sclerallaget ved kanten av øyekoppen ved hjelp av fine disseksjonsmikroscissorer.Bruk to skarpe disseksjons tang for å holde på scleral vev på hver side og trekke på scleral laget svært nøye for å fjerne den fra neural netthinnen. Gjenta dette rundt øyekoppen til alle sclera er fjernet og en intakt netthinnekopp er oppnådd. Lag radiale kutt på netthinnekoppen for å flate den ut og generere flere forskjellige seksjoner ved hjelp av disseksjonsmikroscissorer.Deretter, ved hjelp av en millimeter diameter biopsi puncher, kutt en retinal plate fra hver del av den flate retinal koppen. Slå i like avstand fra synsnerven. Overfør de forhåndsbelagte nettinginnleggene inn i disseksjonen Petri-tallerkenen ved hjelp av tang.Ved hjelp av to superfine øyenvippebørster plasserer du retinal punch-platen i midten av maskeinnsatsen med ganglioncellelaget side ned og berører nettet og fotoreseptorlaget vendt opp. For å laste sensorpatronen, ta kassetten med den hydrerte sensorkassetten ut av 37 graders Celsius-inkubatoren. Når du har fjernet hydroboosterdekselet, plasserer du sensorkassetten tilbake på strømplaten.Legg ønsket volum av injeksjonsforbindelser i passende porter ved å holde pipettespissen i en 45 graders vinkel, og sett pipettespissen halvveis inn i en injeksjonsport med spissens skråkant mot motsatt vegg av injeksjonsporten. Last forbindelsen forsiktig inn i hver port. Legg sensorkassetten i maskinen for kalibrering ved å klikke på startkjøringsknappen for å åpne maskinskuffen.Plasser sensorkassetten i maskinen og klikk på Jeg er klar-knappen for å starte kalibreringen. Last ønsket volum av analysemediet inn i hver brønn på holmens fangstplate. Bruk tang, ta tak i kanten på nettinginnsatsen som inneholder retinal punch plater og ta den ut fra Petri parabolen.Trykk lett på bunnen av nettinginnsatsen på et absorberende tørkevev for å fjerne ekstra væske og sette den inn i brønnen på holmefangstplaten. Gjenta dette trinnet til alle nettinginnlegg med nettingstanser er plassert i holmen som fyller bakgrunnskorrigeringsbrønnene og tomme brønner med tomme nettinginnlegg. Bruk to Graefe tang, trykk kanten på hver maskeinnsats forsiktig og forsiktig, og sørg for at disse er sikkert satt inn på bunnen av holmens fangstplate.Plasser den lastede holmens opptaksplate i en 37 graders Celsius-inkubator i fem minutter for å varme opp, og løs deretter ut verktøyplaten etter at kalibreringen er fullført. Bytt den ut med holmens opptaksplate som inneholder netthinnestanser, og gjenoppta analysen ved å klikke på lastcelleplateknappen. Når kjøringen er fullført, løser du ut sensorpatronen og holmefangstplaten som inneholder netthinnestans ved å klikke på utløserknappen, og deretter klikker du på den ferdige knappen slik at dataene automatisk lagres som en ASYR-fil og skjermen endres automatisk til resultatvisning.Mitokondriestressanalysen som viser et OCR-spor og glykolytisk hastighetsanalyse som viser både OCR- og ECAR-spor, ble utført ved hjelp av ny dissekerte en millimeter retinal punch-plater. I mitokondriestressanalysen ble Bam15 injisert til unoutlet protongradient fra mitokondrie-ATP-produksjon, noe som resulterte i økningen av OCR til maksimalt nivå. Rotenon og antimycin A ble injisert for å hemme mitokondrierespirasjon ved henholdsvis kompleks en og kompleks tre, noe som resulterte i en nedgang i OCR til minimalt nivå.Forskjellen mellom det maksimale nivået av OCR og den siste målingen av basal OCR-nivået gjenspeiler mitokondriereservekapasiteten. I glykolytisk hastighetsanalyse stenger injeksjon av rotenon og antimycin A mitokondrie respirasjon og driver glykolyse høyere. Glykolyse beslaglegges ved å injisere 2-deoksy-d-glukose, som konkurrerer med glukose for hexokinasebinding, noe som får ECAR til å falle til minimalt nivå.Forskjellen mellom det maksimale nivået av glyco ECAR i siste mål av glyco ECAR basal nivå gjenspeiler glykolyse reserve kapasitet. For å produsere pålitelige data er det viktig å oppnå god kvalitet på retinal punch-plater og begrense den totale dissekeringstiden innen 1,5 time. Etter eksperimentet kan man kvantifisere DNA-et til proteininnholdet i en netthinneskive i en brønn og bruke det til å normalisere sjøhestdataene.Så denne protokollen ble brukt til å studere utvikling, aldring og sykdom i netthinnen. Vevspreferanse eller avhengighet av forskjellige drivstoffsubstrater som glukose eller fettsyrer ble også analysert.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funksjonell Bildediagnostiske Bruke Ultrasonic blod-hjerne barrieren avbrudd og mangan forbedret MR

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Disseksjon, kultur, og analyse av<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonic Retinal Tissue

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex vivo tilbe Intakt Vomeronasal orgel og tilbehør luktelappen

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funksjonell testing av to netthinne etter<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogrammet System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo optogenetic Disseksjon av Fear kretser i hjernen skiver

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Fastsettelse av fotoreseptorlidelser Cell Spectral følsomhet i en Insect modell fra<em&gt; I Vivo</em&gt; Intracellulære Recordings

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Forberede frisk Retinal skiver fra voksne sebrafisk for Ex Vivo Imaging eksperimenter

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Kvantitativ Autoradiographic metode for fastsettelse av regionale priser på cerebral protein syntese in vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...