Name: determination of mitochondrial respiration and glycolysis in ex vivo retinal tissue samples
Uploaded: 2021-08-04T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples at JoVE.com

Este trabalho é apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do National Eye Institute (ZIAEY000450 e ZIAEY000546).

Todos os protocolos de camundongos foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais do Instituto Nacional de Olhos (NEI ASP nº 650). Os camundongos foram alojados em condições claras e escuras 12h e atendidos seguindo as recomendações do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, do Instituto de Recursos Animais Laboratoriais e da Política de Serviços Públicos de Saúde sobre Cuidados Humanos e Uso de Animais de Laboratório.
1. Cartucho de sensor hidratante e preparação...

<ol>
	<li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+In+sickness+and+in+health.">Mitochondria: In sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li><li>Wong-Riley, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+the+visual+system.">Energy metabolism of the visual system.</a> Eye Brain. 2, 99-116 (2010).</li><li>Yu, D. Y., Cringle, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+distribution+and+consumption+within+the+retina+in+vascularised+and+avascular+retinas+and+in+animal+models+of+retinal+disease.">Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease.</a> Progress in Retina and Eye Research. 20, 175-208 (2001).</li><li>Barot, M., Gokulgandhi, M. R., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+retinal+diseases.">Mitochondrial dysfunction in retinal diseases.</a> Current Eye Research. 36 (12), 1069-1077 (2011).</li><li>Joyal, J. S., Gantner, M. L., Smith, L. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+energy+demands+control+vascular+supply+of+the+retina+in+development+and+disease:+The+role+of+neuronal+lipid+and+glucose+metabolism.">Retinal energy demands control vascular supply of the retina in development and disease: The role of neuronal lipid and glucose metabolism.</a> Progress in Retina and Eye Research. 64, 131-156 (2018).</li><li>Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose,+lactate,+and+shuttling+of+metabolites+in+vertebrate+retinas.">Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas.</a> Journal of Neuroscience Research. 93 (7), 1079-1092 (2015).</li><li>Haydinger, C. D., Kittipassorn, T., Peet, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+to+see-Drivers+of+aerobic+glycolysis+in+the+mammalian+retina:+A+review.">Power to see-Drivers of aerobic glycolysis in the mammalian retina: A review.</a> Clinical and Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1057-1071 (2020).</li><li>Wright, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan+and+mitochondrial+control+of+neurodegeneration.">Lifespan and mitochondrial control of neurodegeneration.</a> Nature Genetics. 36, 1153-1158 (2004).</li><li>Bossy-Wetzel, E., Schwarzenbacher, R., Lipton, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathways+to+neurodegeneration.">Molecular pathways to neurodegeneration.</a> Nature Medicine. 10, 2-9 (2004).</li><li>Leveillard, T., Philp, N. J., Sennlaub, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+retinal+metabolic+dysfunction+at+the+center+of+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration.">Is retinal metabolic dysfunction at the center of the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), (2019).</li><li>Vlachantoni, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+severe+mitochondrial+oxidative+stress+and+a+protective+effect+of+low+oxygen+in+mouse+models+of+inherited+photoreceptor+degeneration.">Evidence of severe mitochondrial oxidative stress and a protective effect of low oxygen in mouse models of inherited photoreceptor degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 20 (2), 322-335 (2011).</li><li>Grenell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MPC1+reprograms+retinal+metabolism+to+impair+visual+function.">Loss of MPC1 reprograms retinal metabolism to impair visual function.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (9), 3530-3535 (2019).</li><li>Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+degeneration:+genetic+and+mechanistic+dissection+of+a+complex+trait.">Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait.</a> Nature Reviews in Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).</li><li>Jarrett, S. G., Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+oxidative+stress+in+age-related+macular+degeneration.">Consequences of oxidative stress in age-related macular degeneration.</a> Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 399-417 (2012).</li><li>Rozing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration:+A+two-level+model+hypothesis.">Age-related macular degeneration: A two-level model hypothesis.</a> Progress in Retina Eye Research. 76, 100825 (2020).</li><li>Yokosako, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolysis+in+patients+with+age-related+macular+degeneration.">Glycolysis in patients with age-related macular degeneration.</a> Open Ophthalmology Journal. 8, 39-47 (2014).</li><li>Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+diabetic+retinopathy.">Mitochondrial dysfunction and diabetic retinopathy.</a> Mitochondrion. 36, 4-6 (2017).</li><li>Yumnamcha, T., Guerra, M., Singh, L. P., Ibrahim, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+dysregulation+and+neurovascular+dysfunction+in+diabetic+retinopathy.">Metabolic dysregulation and neurovascular dysfunction in diabetic retinopathy.</a> Antioxidants. 9 (12), (2020).</li><li>Futterman, S., Kinoshita, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+retina.+I.+Respiration+of+cattle+retina.">Metabolism of the retina. I. Respiration of cattle retina.</a> Journal of Biological Chemistry. 234 (4), 723-726 (1959).</li><li>Linsenmeier, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+light+and+darkness+on+oxygen+distribution+and+consumption+in+the+cat+retina.">Effects of light and darkness on oxygen distribution and consumption in the cat retina.</a> Journal of General Physiology. 88 (4), 521-542 (1986).</li><li>Medrano, C. J., Fox, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+consumption+in+the+rat+outer+and+inner+retina:+light-+and+pharmacologically-induced+inhibition.">Oxygen consumption in the rat outer and inner retina: light- and pharmacologically-induced inhibition.</a> Experiments in Eye Research. 61 (3), 273-284 (1995).</li><li>Kooragayala, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+oxygen+consumption+in+retina+ex+vivo+demonstrates+limited+reserve+capacity+of+photoreceptor+mitochondria.">Quantification of oxygen consumption in retina ex vivo demonstrates limited reserve capacity of photoreceptor mitochondria.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).</li><li>Adlakha, Y. K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+mitochondrial+oxygen+consumption+in+the+retina+ex+vivo:+applications+for+retinal+disease.">Determination of mitochondrial oxygen consumption in the retina ex vivo: applications for retinal disease.</a> Methods in Molecular Biology. 1753, 167-177 (2018).</li><li>. Agilent Mitocondrial stress test user guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Cell_Mito_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Cell_Mito_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent Glycolytic rate assay user guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent wave 2.6 user guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf</a> (2021)</li><li>. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf">https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf</a> (2021)</li><li>. Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf</a> (2021)</li><li>. Report Generator User Guide Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent Seahorse XF Buffer Factor Protocol Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent sensor cartridges and cell culture microplates Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf</a> (2021)</li><li>Fan, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioassay+to+measure+energy+metabolism+in+mouse+colonic+crypts,+organoids,+and+sorted+stem+cells.">A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309, 1-9 (2015).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-+and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li><li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina.">The major cell populations of the mouse retina.</a> Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).</li><li>Akimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+GFP+to+newborn+rods+by+Nrl+promoter+and+temporal+expression+profiling+of+flow-sorted+photoreceptors.">Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (10), 3890-3895 (2006).</li><li>Kenwood, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+mitochondrial+uncoupler+that+does+not+depolarize+the+plasma+membrane.">Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane.</a> Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).</li><li>Corso-Diaz, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+identifies+DNA+methylation+signatures+of+aging+in+rod+photoreceptors+associated+with+alterations+in+energy+metabolism.">Genome-wide profiling identifies DNA methylation signatures of aging in rod photoreceptors associated with alterations in energy metabolism.</a> Cell Reports. 31 (3), 107525 (2020).</li><li>Berkowitz, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiration+in+outer+retina+contributes+to+light-evoked+increase+in+hydration+in+vivo.">Mitochondrial respiration in outer retina contributes to light-evoked increase in hydration in vivo.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (15), 5957-5964 (2018).</li><li>Joyal, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+lipid+and+glucose+metabolism+dictates+angiogenesis+through+the+lipid+sensor+Ffar1.">Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1.</a> Nature Medicine. 22 (4), 439-445 (2016).</li></ol>

Fornecido aqui estão instruções detalhadas para a realização de ensaios baseados em microplaca de atividade de respiração mitocondrial e glicolise usando discos de perfuração de retina ex vivo, recém-dissecados. O protocolo foi otimizado para: 1) garantir o uso de um meio de ensaio adequado para tecido de retina ex vivo; 2) empregar o tamanho adequado dos discos de perfuração de retina para obter leituras de OCR e ECAR que se enquadram no alcance ideal de detecção da máquina; 3) revestime...

Mitocôndrias são organelas essenciais que regulam o metabolismo celular, sinalização, homeostase e apoptose coordenando múltiplos processos fisiológicos cruciais1. Mitocôndrias servem como a potência na célula para gerar triphosfato de adenosina (ATP) através da fosforilação oxidativa (OXPHOS) e fornecem energia que suporta quase todos os eventos celulares. A maioria do oxigênio celular é metabolizada em mitocôndrias, onde serve como o aceitador final de elétrons na cadeia de transporte de elétrons (ETC) durante a respiração aeróbica. Baixas quantidades de ATP também podem ser produzidas a partir da glicolise no citosol, onde a glicose é convertida em piruvato, que pode ser ainda convertida em lactato ou ser transportada para mitocôndrias e oxidada para acetil-CoA, um substrato no ciclo de ácido tricarboxílico (ciclo TCA).
A retina é um dos tecidos mais metabolicamente ativos em mamíferos2, apresentando altos níveis de respiração mitocondrial e consumo de oxigênio extremamente alto3. Os fotorreceptores da haste e do cone contêm uma alta densidade de mitocôndrias4, e oxphos gera a maioria de ATP na retina5. Além disso, a retina também depende fortemente da glicólise aeróbica6,7, convertendo glicose em lactato5. Os defeitos mitocondriais estão associados a diversas doenças neurodegenerativas8,9; e com suas demandas únicas de alta energia, a retina é especialmente vulnerável a defeitos metabólicos, incluindo aqueles que afetam oxphos4 mitocondrial4 e glicolise10. A disfunção mitocondrial e os defeitos na glicólise estão implicados em doenças degenerativas da retina 11,12 e macular13, degeneração macular relacionada à idade10,14,15,16 e retinopatia diabética17,18. Portanto, medições precisas da respiração mitocondrial e da glicolise podem fornecer parâmetros importantes para avaliar a integridade e a saúde da retina.
A respiração mitocondrial pode ser medida através da determinação da taxa de consumo de oxigênio (OCR). Dado que a conversão da glicose em piruvato e, posteriormente, para lactato resulta em extrusão de prótons em e acidificação do ambiente extracelular, as medidas da taxa de acidificação extracelular (ECAR) fornecem uma indicação de fluxo de glicolise. Como a retina é composta de múltiplos tipos de células com relações íntimas e sinergia ativa, incluindo a troca de substratos6, é imperativo analisar a função mitocondrial e o metabolismo no contexto de todo o tecido retinente com laminação intacta e circuitos. Nas últimas décadas, os eletrodos O2 tipo Clark e outros microeletrodos de oxigênio têm sido usados para medir o consumo de oxigênio na retina19,20,21. Esses eletrodos de oxigênio têm grandes limitações na sensibilidade, exigência de um grande volume amostral e a necessidade de agitação contínua da amostra suspensa, o que geralmente leva à interrupção do contexto celular e tecidual. O protocolo descrito aqui foi desenvolvido usando uma técnica de fluorescência à base de microplaca para medir o metabolismo de energia mitocondrial em tecido de retina de camundongos ex vivo recém-dissecado. Permite medições em tempo real de média entrada tanto do OCR quanto do ECAR simultaneamente usando uma pequena amostra (soco de 1 mm) de tecido ex vivo retina, evitando a necessidade de suspensão e agitação contínua.
Demonstrado aqui é o procedimento experimental para ensaio de estresse mitocondrial e ensaio de taxa glicolítico em discos de perfuração de retina recém-dissecados. Este protocolo permite a medição de atividades metabólicas relacionadas a mitocôndrias em um contexto de tecido ex vivo. Diferente dos ensaios realizados com células cultivadas, as leituras obtidas aqui refletem o metabolismo energético combinado no nível do tecido e são influenciadas por interações entre os diferentes tipos celulares dentro do tecido. O protocolo é modificado a partir de uma versão anteriormente publicada22,23 para se adaptar à nova geração do analisador Agilent Seahorse extracelular fluxo 24-wells (XFe24) com placa de Captura de Ilhéus. O meio de ensaio, as concentrações de compostos de injeção e o número/duração dos ciclos de ensaio também foram otimizados para o tecido retiniano. Um protocolo passo a passo detalhado é dado para a preparação de discos de perfuração de retina. Mais informações sobre a configuração do programa e análise de dados podem ser obtidas no guia de usuário do fabricante24,25,26.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6134</td>
			<td>Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-gauge needle</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A, 10 mM stock solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bam15, 10 mM stock solution</td>
			<td>TimTec</td>
			<td>ST056388</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy puncher, 1 mm</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>33-31AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 asphyxiation chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection forceps-Dumont #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>Stright tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection forceps-Dumont #7</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11274-20</td>
			<td>Curved tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>Curved, Serrated tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15004-08</td>
			<td>Curved tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH solution, 1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8263</td>
			<td>Aqueous solution, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone, 10 mM stock solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse calibration medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 1.0 M glucose</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103577-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 100 mM pyruvate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103578-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 200 mM glutamine</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103579-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF DMEM medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>pH 7.4, with 5 mM HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103518-100</td>
			<td>Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate solution, 0.1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Aqueous solution, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfine eyelash brush</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>113</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of mitochondrial respiration and glycolysis in ex vivo retinal tissue samples

A respiração mitocondrial é um caminho crítico gerador de energia em todas as células, especialmente fotorreceptores de retina que possuem um metabolismo altamente ativo. Além disso, fotorreceptores também exibem alta glicólise aeróbica como células cancerosas. Medições precisas dessas atividades metabólicas podem fornecer informações valiosas sobre a homeostase celular em condições fisiológicas e em estados de doenças. Ensaios baseados em microplacos de alto rendimento foram desenvolvidos para medir a respiração mitocondrial e várias atividades metabólicas em células vivas. No entanto, a grande maioria delas são desenvolvidas para células cultivadas e não foram otimizadas para amostras de tecido intacto e para aplicação ex vivo. Descrito aqui é um protocolo passo-a-passo detalhado, utilizando a tecnologia de fluorescência baseada em microplaca, para medir diretamente a taxa de consumo de oxigênio (OCR) como um indicador de respiração mitocondrial, bem como taxa de acidificação extracelular (ECAR) como um indicador de glicolise, em tecido de retina ex vivo intacto. Este método tem sido usado para avaliar com sucesso as atividades metabólicas na retina do camundongo adulto e demonstrar sua aplicação na investigação de mecanismos celulares de envelhecimento e doença.

Os dados aqui relatados são ensaios representativos de estresse mitocondrial mostrando traços OCR (Figura 1) e ensaio de taxa glicolítico mostrando traços OCR e traço ECAR (Figura 2), que foram realizados usando discos de perfuração de retina de 1 mm recém-dissecados a partir de 4 meses de camundongos nrl-L-EGFP transgênicos de 4 meses de idade( fundo C57B/L6). Esses camundongos expressam GFP especificamente em fotorrece...

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Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Descrito aqui é um protocolo detalhado para a realização de ensaios de estresse mitocondrial e ensaio de taxa glicólítica em amostras de tecido de retina ex vivo usando um bioanalzer comercial.

Determinação da respiração mitocondrial e glicolise em amostras de tecido retinal ex vivo

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. ...

Este protocolo fornece análise em tempo real de duas principais vias bioenergénicas: respiração mitocondrial e glicolise em tecidos retinas de camundongos ex vivo recém-dissecados. A análise tradicional de cavalos marinhos foi focada em células monocamadas cultivadas, enquanto este protocolo permite que os pesquisadores estudem a atividade mitocondrial em tecidos recém-dissecados, especificamente a retina. Esta técnica é usada para estudar as atividades das mitocôndrias e bandeiras de glicolise em retinas de modelos herdados de camundongos de degeneração da retina.É uma ferramenta útil para a pesquisa da retina e também tem potencial para ser aplicado a outro tipo de tecido para desenvolver terapias potenciais. A parte mais difícil deste protocolo é obter discos de perfuração de qualidade da retina do rato recém-dissecada, por isso recomenda-se que o indivíduo que irá executar esta técnica tenha boas habilidades de dissecação de retina. Um dia antes do experimento, abra o do cartucho do sensor e adicione um mililitro de meio de calibração a cada poço da placa de utilidade.Incubar durante a noite em uma incubadora sem dióxido de carbono a 37 graus Celsius para ativar os fluoroforos. No dia do experimento, prepare o meio de ensaio em drogas compostas diluídas do estoque. Aqueça o meio de ensaio no banho de água de 37 graus Celsius.Configure o programa de ensaio na máquina conforme descrito no manuscrito do texto. Abra a tampa do contendo pastilhas de malha. Pipeta oito microliters da mistura de revestimento para cada inserção de malha, em seguida, use uma ponta de pipeta para espalhar suavemente a gota ao redor para distribuir a mistura de revestimento igualmente ao longo da inserção da malha.Feche o e deixe as pastilhas de malha incubarem à temperatura ambiente por pelo menos 25 minutos para absorção. Após a incubação, lave as pastilhas de malha ao pipetar quatro mililitros do meio de ensaio diretamente nas pastilhas. Agite suavemente o para garantir que todas as pastilhas de malha sejam lavadas com o meio de ensaio.Para preparar o soco da retina, enuclear os olhos de um rato adulto eutanizado e colocá-los em PBS gelado em uma placa de Petri, em seguida, colocar a placa de Petri sob um microscópio de dissecção. Usando microscisores, corte o nervo óptico e remova cuidadosamente os músculos extrarreectus ligados fora do globo ocular. Usando uma agulha calibre 30, faça um buraco na borda da córnea.Em seguida, use microscissores de dissecção fina para fazer um corte circular ao longo da borda da córnea. Usando fórceps de dissecção afiadas, remova a córnea, a lente e o humor vítreo do copo dos olhos. Faça vários pequenos cortes na camada escleral na borda do copo ocular usando microscissores de dissecção fina.Use dois fórceps de dissecção afiados para segurar o tecido escleral de cada lado e puxe a camada escleral com muito cuidado para removê-lo da retina neural. Repita isso ao redor do copo ocular até que toda a esclera seja removida e um copo de retina intacto seja obtido. Faça cortes radiais no copo de retina para achatá-lo e gerar várias seções distintas usando microscissores de dissecção.Em seguida, usando um perfurador de biópsia de um milímetro de diâmetro, corte um disco de retina de cada seção do copo de retina achatado. Soco a uma distância igual da cabeça do nervo óptico. Transfira as pastilhas de malha pré-revestidas para a placa de dissecção Petri usando fórceps.Com a ajuda de dois pincéis de cílios super finos, coloque o disco de perfuração de retina no centro da inserção da malha com a camada de célula de gânglio lado para baixo tocando a malha e a camada fotorreceptora voltada para cima. Para carregar o cartucho do sensor, tire o da placa do cartucho do sensor hidratado da incubadora Celsius de 37 graus. Depois de remover a tampa do propulsor hidráulico, coloque o cartucho do sensor de volta na placa de utilidade.Carregue o volume desejado de soluções compostas de injeção em portas apropriadas, segurando a ponta pipeta em um ângulo de 45 graus, inserindo a ponta da pipeta no meio do caminho em uma porta de injeção com o bisel da ponta contra a parede oposta da porta de injeção. Carregue suavemente o composto em cada porta. Carregue o cartucho do sensor na máquina para calibração clicando no botão iniciar a execução para abrir a bandeja da máquina.Coloque o cartucho do sensor na máquina e clique em Estou pronto botão para iniciar a calibração. Carregue o volume desejado do meio de ensaio em cada poço da placa de captura de ilhotas. Usando fórceps, pegue a borda da inserção de malha contendo discos de perfuração de retina e retire-o da placa de Petri.Bata levemente a parte inferior da inserção da malha em um tecido absorvente para remover líquido extra e coloque-o no poço da placa de captura de ilhotas. Repita esta etapa até que todas as pastilhas de malha com socos de retina sejam colocadas na placa de captura de ilhotas que preenche os poços de correção de fundo e poços em branco com pastilhas de malha vazias. Usando duas fórceps Graefe, pressione a borda de cada malha inserir cuidadosamente e suavemente, certificando-se de que estes estão inseridos com segurança na parte inferior da placa de captura de ilhotas.Coloque a placa de captura de ilhota carregada em uma incubadora Celsius de 37 graus por cinco minutos para aquecer e ejete a placa de utilidade após a calibração estiver completa. Substitua-a pela placa de captura de ilhota contendo socos na retina e retome a execução do ensaio clicando no botão da placa da célula de carga. Depois que a execução estiver concluída, ejete a placa de captura do sensor e a placa de captura de ilhotas contendo socos de retina clicando no botão ejetar ejetar, em seguida, clique no botão feito para que os dados seja automaticamente salvo como um arquivo ASYR e a mudança de tela automaticamente para a exibição do resultado.O ensaio de estresse mitocondrial mostrando um traço de OCR e um ensaio de taxa glicolítico mostrando traços de OCR e ECAR foram realizados usando discos de perfuração de retina de um milímetro recém-dissecados. No ensaio de estresse mitocondrial, Bam15 foi injetado para desacoplar gradiente de prótons da produção de ATP mitocondrial, resultando no aumento do OCR para o nível máximo. Rotenona e antimicina A foram injetados para inibir a respiração das mitocôndrias no complexo um e complexo três, respectivamente, resultando em uma queda do OCR para o nível mínimo.A diferença entre o nível máximo de OCR e a última medição do nível basal de OCR reflete a capacidade de reserva mitocondrial. No ensaio da taxa glicóltica, a injeção de rotenona e antimicina A desliga a respiração mitocondrial e aumenta a glicólise. A glicólise é apreendida injetando 2-desoxi-d-glicose, que compete com glicose para a ligação hexokinase, fazendo com que o ECAR caia para o nível mínimo.A diferença entre o nível máximo de Glyco ECAR na última medida do nível basal Glyco ECAR reflete a capacidade de reserva de glicolise. Para produzir dados confiáveis, é fundamental obter uma boa qualidade dos discos de perfuração de retina e limitar o tempo total de dissecação dentro de 1,5 hora. Após o experimento, pode-se quantificar o DNA do conteúdo proteico de um disco de retina em um poço e usá-lo para normalizar os dados dos cavalos-marinhos.Assim, este protocolo foi utilizado para estudar o desenvolvimento, o envelhecimento e a doença na retina. Também foi analisada a preferência ou dependência de diferentes substratos de combustível, como glicose ou ácidos graxos.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Neurociência

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Determinação de Membrana Mitocondrial Espécies de Oxigênio Reativas Potencial e em neurônios de rato vivo Cortical

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissecção, Cultura, Análise e de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tecido embrionário da retina

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex vivo preparações da Intacta Vomeronasal Órgão e acessórios bulbo olfatório

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultâneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Teste Funcional de Dois retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Eletrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo optogenética Dissection de Circuitos medo no cérebro Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Determinação dos fotorreceptores celular Sensibilidade espectral em um inseto modelo de<em&gt; In Vivo</em&gt; Gravações intracelulares

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Prepara frescas fatias da retina de adultos do Zebrafish para Ex Vivo experimentos de imagem

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Método autoradiográfico quantitativo para determinação das taxas regionais de síntese protéica cerebral in vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...