Name: determination of mitochondrial respiration and glycolysis in ex vivo retinal tissue samples
Uploaded: 2021-08-04T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples at JoVE.com

Detta arbete stöds av Intramural Research Program vid National Eye Institute (ZIAEY000450 och ZIAEY000546).

Alla musprotokoll godkändes av Animal Care and Use Committee vid National Eye Institute (NEI ASP# 650). Möss inrymdes i 12 timmar ljusmörka förhållanden och vårdades genom att följa rekommendationerna från Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Institute of Laboratory Animal Resources och Folkhälsopolicyn för human vård och användning av laboratoriedjur.
1. Hydrerande sensorpatron och beredning av analysmediet
<ol><li>Dagen före experimentet, tillsätt 1 ml kalibrerin...

<ol>
	<li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+In+sickness+and+in+health.">Mitochondria: In sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li><li>Wong-Riley, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+the+visual+system.">Energy metabolism of the visual system.</a> Eye Brain. 2, 99-116 (2010).</li><li>Yu, D. Y., Cringle, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+distribution+and+consumption+within+the+retina+in+vascularised+and+avascular+retinas+and+in+animal+models+of+retinal+disease.">Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease.</a> Progress in Retina and Eye Research. 20, 175-208 (2001).</li><li>Barot, M., Gokulgandhi, M. R., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+retinal+diseases.">Mitochondrial dysfunction in retinal diseases.</a> Current Eye Research. 36 (12), 1069-1077 (2011).</li><li>Joyal, J. S., Gantner, M. L., Smith, L. E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+energy+demands+control+vascular+supply+of+the+retina+in+development+and+disease:+The+role+of+neuronal+lipid+and+glucose+metabolism.">Retinal energy demands control vascular supply of the retina in development and disease: The role of neuronal lipid and glucose metabolism.</a> Progress in Retina and Eye Research. 64, 131-156 (2018).</li><li>Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose,+lactate,+and+shuttling+of+metabolites+in+vertebrate+retinas.">Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas.</a> Journal of Neuroscience Research. 93 (7), 1079-1092 (2015).</li><li>Haydinger, C. D., Kittipassorn, T., Peet, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+to+see-Drivers+of+aerobic+glycolysis+in+the+mammalian+retina:+A+review.">Power to see-Drivers of aerobic glycolysis in the mammalian retina: A review.</a> Clinical and Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1057-1071 (2020).</li><li>Wright, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan+and+mitochondrial+control+of+neurodegeneration.">Lifespan and mitochondrial control of neurodegeneration.</a> Nature Genetics. 36, 1153-1158 (2004).</li><li>Bossy-Wetzel, E., Schwarzenbacher, R., Lipton, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathways+to+neurodegeneration.">Molecular pathways to neurodegeneration.</a> Nature Medicine. 10, 2-9 (2004).</li><li>Leveillard, T., Philp, N. J., Sennlaub, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+retinal+metabolic+dysfunction+at+the+center+of+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration.">Is retinal metabolic dysfunction at the center of the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), (2019).</li><li>Vlachantoni, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+severe+mitochondrial+oxidative+stress+and+a+protective+effect+of+low+oxygen+in+mouse+models+of+inherited+photoreceptor+degeneration.">Evidence of severe mitochondrial oxidative stress and a protective effect of low oxygen in mouse models of inherited photoreceptor degeneration.</a> Human Molecular Genetics. 20 (2), 322-335 (2011).</li><li>Grenell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+MPC1+reprograms+retinal+metabolism+to+impair+visual+function.">Loss of MPC1 reprograms retinal metabolism to impair visual function.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (9), 3530-3535 (2019).</li><li>Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+degeneration:+genetic+and+mechanistic+dissection+of+a+complex+trait.">Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait.</a> Nature Reviews in Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).</li><li>Jarrett, S. G., Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+oxidative+stress+in+age-related+macular+degeneration.">Consequences of oxidative stress in age-related macular degeneration.</a> Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 399-417 (2012).</li><li>Rozing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration:+A+two-level+model+hypothesis.">Age-related macular degeneration: A two-level model hypothesis.</a> Progress in Retina Eye Research. 76, 100825 (2020).</li><li>Yokosako, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolysis+in+patients+with+age-related+macular+degeneration.">Glycolysis in patients with age-related macular degeneration.</a> Open Ophthalmology Journal. 8, 39-47 (2014).</li><li>Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+diabetic+retinopathy.">Mitochondrial dysfunction and diabetic retinopathy.</a> Mitochondrion. 36, 4-6 (2017).</li><li>Yumnamcha, T., Guerra, M., Singh, L. P., Ibrahim, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+dysregulation+and+neurovascular+dysfunction+in+diabetic+retinopathy.">Metabolic dysregulation and neurovascular dysfunction in diabetic retinopathy.</a> Antioxidants. 9 (12), (2020).</li><li>Futterman, S., Kinoshita, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+retina.+I.+Respiration+of+cattle+retina.">Metabolism of the retina. I. Respiration of cattle retina.</a> Journal of Biological Chemistry. 234 (4), 723-726 (1959).</li><li>Linsenmeier, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+light+and+darkness+on+oxygen+distribution+and+consumption+in+the+cat+retina.">Effects of light and darkness on oxygen distribution and consumption in the cat retina.</a> Journal of General Physiology. 88 (4), 521-542 (1986).</li><li>Medrano, C. J., Fox, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+consumption+in+the+rat+outer+and+inner+retina:+light-+and+pharmacologically-induced+inhibition.">Oxygen consumption in the rat outer and inner retina: light- and pharmacologically-induced inhibition.</a> Experiments in Eye Research. 61 (3), 273-284 (1995).</li><li>Kooragayala, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+oxygen+consumption+in+retina+ex+vivo+demonstrates+limited+reserve+capacity+of+photoreceptor+mitochondria.">Quantification of oxygen consumption in retina ex vivo demonstrates limited reserve capacity of photoreceptor mitochondria.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).</li><li>Adlakha, Y. K., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+mitochondrial+oxygen+consumption+in+the+retina+ex+vivo:+applications+for+retinal+disease.">Determination of mitochondrial oxygen consumption in the retina ex vivo: applications for retinal disease.</a> Methods in Molecular Biology. 1753, 167-177 (2018).</li><li>. Agilent Mitocondrial stress test user guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Cell_Mito_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Cell_Mito_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent Glycolytic rate assay user guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent wave 2.6 user guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf</a> (2021)</li><li>. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals Available from: <a target="_blank" href="https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf">https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf</a> (2021)</li><li>. Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf</a> (2021)</li><li>. Report Generator User Guide Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent Seahorse XF Buffer Factor Protocol Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent sensor cartridges and cell culture microplates Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf</a> (2021)</li><li>. Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit User Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf</a> (2021)</li><li>Fan, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioassay+to+measure+energy+metabolism+in+mouse+colonic+crypts,+organoids,+and+sorted+stem+cells.">A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309, 1-9 (2015).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-+and+patient-derived+tumor+organoids.">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).</li><li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina.">The major cell populations of the mouse retina.</a> Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).</li><li>Akimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+GFP+to+newborn+rods+by+Nrl+promoter+and+temporal+expression+profiling+of+flow-sorted+photoreceptors.">Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (10), 3890-3895 (2006).</li><li>Kenwood, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+mitochondrial+uncoupler+that+does+not+depolarize+the+plasma+membrane.">Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane.</a> Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).</li><li>Corso-Diaz, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+identifies+DNA+methylation+signatures+of+aging+in+rod+photoreceptors+associated+with+alterations+in+energy+metabolism.">Genome-wide profiling identifies DNA methylation signatures of aging in rod photoreceptors associated with alterations in energy metabolism.</a> Cell Reports. 31 (3), 107525 (2020).</li><li>Berkowitz, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiration+in+outer+retina+contributes+to+light-evoked+increase+in+hydration+in+vivo.">Mitochondrial respiration in outer retina contributes to light-evoked increase in hydration in vivo.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (15), 5957-5964 (2018).</li><li>Joyal, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+lipid+and+glucose+metabolism+dictates+angiogenesis+through+the+lipid+sensor+Ffar1.">Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1.</a> Nature Medicine. 22 (4), 439-445 (2016).</li></ol>

Här finns detaljerade instruktioner för att utföra mikroplate-baserade analyser av mitokondriell andning och glykolysaktivitet med hjälp av ex vivo, ny dissekerade näthinnestansskivor. Protokollet har optimerats för att: 1) säkerställa användningen av ett lämpligt analysmedium för ex vivo retinal vävnad; 2) använda rätt storlek på näthinnestansskivor för att erhålla OCR- och ECAR-avläsningar som faller inom maskinens optimala detekteringsområde; 3) beläggning av nätinsatser för at...

Mitokondrier är viktiga organeller som reglerar cellulär metabolism, signalering, homeostas och apoptos genom att samordna flera avgörande fysiologiska processer1. Mitokondrier fungerar som kraftverk i cellen för att generera adenosintrifosfat (ATP) genom oxidativ fosforylering (OXPHOS) och ge energi som stöder nästan alla cellulära händelser. Majoriteten av cellulärt syre metaboliseras i mitokondrier, där det fungerar som den slutliga elektron acceptor i elektrontransportkedjan (ETC) under aerob andning. Låga mängder ATP kan också produceras från glykolys i cytosolen, där glukos omvandlas till pyruvat, som kan omvandlas ytterligare till laktat eller transporteras till mitokondrier och oxideras till acetyl-CoA, ett substrat i trikarboxylsyracykeln (TCA-cykeln).
Näthinnan är en av de mest metaboliskt aktiva vävnaderna hos däggdjur2, som uppvisar höga nivåer av mitokondriell andning och extremt hög syreförbrukning3. Stången och kon fotoreceptorerna innehåller en hög densitet av mitokondrier4, och OXPHOS genererar de flesta ATP i näthinnan5. Dessutom förlitar sig näthinnan också starkt på aerob glykolys6,7 genom att omvandla glukos till laktat5. Mitokondriella defekter är associerade med olika neurodegenerativa sjukdomar8,9; och med sina unika höga energikrav är näthinnan särskilt sårbar för metaboliska defekter, inklusive de som påverkar mitokondriella OXPHOS4 och glykolys10. Mitokondriell dysfunktion och defekter i glykolys är inblandade i retinal11,12 och macular13 degenerativa sjukdomar, åldersrelaterade makuladegeneration10,14,15,16 och diabetiker retinopati17,18. Därför kan noggranna mätningar av mitokondriell andning och glykolys ge viktiga parametrar för att bedöma näthinnans integritet och hälsa.
Mitokondriell andning kan mätas genom bestämning av syreförbrukningshastighet (OCR). Med tanke på att omvandlingen av glukos till pyruvat och därefter till laktat resulterar i extrudering av protoner till och försurning av den extracellulära miljön, ger mätningar av den extracellulära försurningshastigheten (ECAR) en indikation på glykolysflöde. Eftersom näthinnan består av flera celltyper med intima relationer och aktiv synergi, inklusive utbyte av substrat6, är det absolut nödvändigt att analysera mitokondriell funktion och metabolism i samband med hela retinal vävnad med intakt laminering och kretsar. Under de senaste decennierna har Clark typ O2 elektroder och andra syremikroelektroder använts för att mäta syreförbrukning i näthinnan19,20,21. Dessa syreelektroder har stora begränsningar i känslighet, krav på en stor provvolym och behovet av kontinuerlig omrörning av suspenderingsprov, vilket vanligtvis leder till störningar i cellulära och vävnadssammanhang. Protokollet som beskrivs här utvecklades med hjälp av en microplate-baserade, fluorescence teknik för att mäta mitokondriell energi metabolism i nyligen dissekerade ex vivo mus näthinnan vävnad. Det möjliggör mätningar i realtid av både OCR och ECAR samtidigt med hjälp av ett litet prov (1 mm stans) av ex vivo retinal vävnad samtidigt som behovet av suspension och kontinuerlig omrörning undviks.
Visat här är det experimentella förfarandet för mitokondriell stress analys och glykolytisk hastighet analys på nyligen dissekerade retinal stans diskar. Detta protokoll tillåter mätning av mitokondrier-relaterade metaboliska aktiviteter i en ex vivo vävnad sammanhang. Till skillnad från de analyser som utförs med hjälp av odlade celler återspeglar avläsningarna här kombinerad energimetabolism på vävnadsnivå och påverkas av interaktioner mellan de olika celltyperna i vävnaden. Protokollet är modifierat från en tidigare publicerad version22,23 för att anpassa sig till den nya generationen av Agilent Seahorse extracellulära flöde 24-brunnar (XFe24) analysator med Islet Capture plate. Analysmediet, koncentrationerna av injektionsföreningar och antalet/varaktigheten av analyscyklerna har också optimerats för näthinnevävnad. Ett detaljerat steg-för-steg-protokoll ges för beredning av näthinnestansskivor. Mer information om programinställningar och dataanalys kan erhållas från tillverkarens användarhandbok24,25,26.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6134</td>
			<td>Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-gauge needle</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A, 10 mM stock solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bam15, 10 mM stock solution</td>
			<td>TimTec</td>
			<td>ST056388</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy puncher, 1 mm</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>33-31AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>CB40240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 asphyxiation chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection forceps-Dumont #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>Stright tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection forceps-Dumont #7</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11274-20</td>
			<td>Curved tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>Curved, Serrated tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15004-08</td>
			<td>Curved tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH solution, 1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8263</td>
			<td>Aqueous solution, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone, 10 mM stock solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Dissolve in DMSO, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse calibration medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>100840-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 1.0 M glucose</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103577-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 100 mM pyruvate</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103578-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF 200 mM glutamine</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103579-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF DMEM medium</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103575-100</td>
			<td>pH 7.4, with 5 mM HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103518-100</td>
			<td>Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate solution, 0.1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Aqueous solution, prepare ahead of time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfine eyelash brush</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>113</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of mitochondrial respiration and glycolysis in ex vivo retinal tissue samples

Mitokondriell andning är en kritisk energigenererande väg i alla celler, särskilt retinala fotoreceptorer som har en mycket aktiv ämnesomsättning. Dessutom uppvisar fotoreceptorer också hög aerob glykolys som cancerceller. Exakta mätningar av dessa metaboliska aktiviteter kan ge värdefulla insikter om cellulär homeostas under fysiologiska förhållanden och i sjukdomstillstånd. Mikroplatebaserade analyser med hög genomströmning har utvecklats för att mäta mitokondriell andning och olika metaboliska aktiviteter i levande celler. En stor majoritet av dessa är dock utvecklade för odlade celler och har inte optimerats för intakta vävnadsprover och för applikation ex vivo. Beskrivs här är ett detaljerat steg-för-steg-protokoll, med hjälp av mikroplatebaserad fluorescensteknik, för att direkt mäta syreförbrukningshastigheten (OCR) som en indikator på mitokondriell andning, liksom extracellulär försurningsgrad (ECAR) som en indikator på glykolys, i intakt ex vivo retinal vävnad. Denna metod har använts för att framgångsrikt bedöma metaboliska aktiviteter i vuxna mus näthinnan och visa dess tillämpning i att undersöka cellulära mekanismer för åldrande och sjukdom.

De data som rapporteras här är representativ mitokondriell stressanalys som visar OCR-spår (figur 1) och glykolytisk hastighetsanalys som visar OCR-spår och ECAR-spår (figur 2), som utfördes med ny dissekerade 1 mm retinal punch-skivor från 4 månader gamla transgena Nrl-L-EGFP-möss36 (C57B/L6 bakgrund). Dessa möss uttrycker GFP specifikt i stångfotoreceptorer utan att ändra normal retinal utveckling, histologi och fys...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples at JoVE.com

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Beskrivs här är ett detaljerat protokoll för att utföra mitokondriell stress analys och glykolytisk hastighet analys i ex vivo retinal vävnad prover med hjälp av en kommersiell bioanalyzer.

Bestämning av mitokondriell andning och glykolys i ex vivo retinal vävnadsprover

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. ...

Detta protokoll ger realtidsanalys av två stora bioenergetiska vägar: mitokondriell andning och glykolys i ny dissekerade ex vivo mus retinal vävnader. Traditionell sjöhästanalys fokuserades på odlade monoskiktade celler, medan detta protokoll tillåter forskare att studera mitokondriell aktivitet i ny dissekerade vävnader, särskilt näthinnan. Denna teknik används för att studera mitokondriers aktiviteter och glykolys flaggor i näthinnor av ärvda retinal degeneration musmodeller.Det är ett användbart verktyg för näthinneforskning och har också potential att tillämpas på andra typer av vävnad för att utveckla potentiella terapier. Den svåraste delen av detta protokoll är att få kvalitetsstansskivor från ny dissekerad mus näthinna, så det rekommenderas att individen som kommer att utföra denna teknik har goda retinala dissekeringsfärdigheter. Dagen före experimentet öppnar du sensorkassetten och lägger till en milliliter kalibreringsmedium till varje brunn på verktygsplattan.Inkubera över natten i en koldioxidfri inkubator vid 37 grader Celsius för att aktivera fluoroforerna. På dagen för experimentet, förbered analysmedium i utspädda sammansatta läkemedel från beståndet. Värm upp analysmediet i 37 grader Celsius vattenbad.Ställ in analysprogrammet på maskinen enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Öppna locket på kassetten som innehåller nätinsatser. Pipettera åtta mikroliter av beläggningsblandningen till varje nätinsats och använd sedan en pipettspets för att försiktigt sprida droppen runt för att fördela beläggningsblandningen lika genom hela nätinsatsen.Stäng kassetten och låt nätinsatserna inkuberas vid rumstemperatur i minst 25 minuter för absorption. Tvätta maskinsatserna efter inkubation genom att leda fyra milliliter av analysmediet direkt på skären. Skaka försiktigt kassetten för att säkerställa att alla nätinsatser tvättas med analysmediet.För att förbereda näthinneslaget, enukleate ögonen från en vuxen avlivad mus och placera dem i iskall PBS i en Petri-maträtt och placera sedan Petri-skålen under ett dissekeringsmikroskop. Använd mikroscissorer, skär av synnerven och ta sedan försiktigt bort extrarectusmusklerna som är fästa utanför ögongloben. Använd en 30 gauge nål, slå ett hål vid hornhinnans kant.Använd sedan fina dissekeringsmikrcissorer för att göra ett cirkulärt snitt längs hornhinnans kant. Använd skarpa dissekeringstänger och ta bort hornhinnan, linsen och glasaktig humor från ögonkoppen. Gör flera små snitt på skleralskiktet vid ögonkoppens kant med hjälp av fina dissekeringsmikrutsorer.Använd två vassa dissekeringstångar för att hålla fast vid skleralvävnaden på varje sida och dra i skleralskiktet mycket noggrant för att ta bort det från neural näthinnan. Upprepa detta runt ögonkoppen tills all sclera har tagits bort och en intakt näthinnekopp erhålls. Gör radiella snitt på näthinnekoppen för att platta till den och generera flera distinkta sektioner med dissekeringsmikrutscissorer.Därefter, med hjälp av en millimeter diameter biopsi puncher, skär en retinal skiva från varje sektion av den tillplattade näthinnekoppen. Stansa på lika avstånd från det optiska nervhuvudet. Överför de förbelagda nätinsatserna i dissekeringen Petri-skålen med tång.Med hjälp av två superfina ögonfransborstar, placera näthinnans stansskiva i mitten av nätinsatsen med ganglioncellskiktet nedåt och vidröra nätet och fotoreceptorskiktet uppåt. För att ladda sensorpatronen, ta ut den hydratiserade sensorpatronplattan från 37 grader Celsius inkubatorn. När du har tagit bort hydroboosterskyddet, placera tillbaka sensorpatronen på verktygsplattan.Ladda den önskade volymen injektionsblandningslösningar i lämpliga portar genom att hålla pipettens spets i 45 graders vinkel och för in pipettspetsen halvvägs in i en injektionsport med spetsens avfasning mot insprutningsportens motsatta vägg. Ladda försiktigt föreningen i varje port. Ladda in sensorpatronen i maskinen för kalibrering genom att klicka på startkörningsknappen för att öppna maskinfacket.Placera sensorpatronen i maskinen och klicka på Jag är redo knapp för att starta kalibreringen. Ladda önskad volym av analysmediet i varje brunn på holmefångstplattan. Använd tång, ta tag i kanten på nätinsatsen som innehåller näthinnestansskivor och ta ut den från Petri-skålen.Knacka lätt på botten av nätinsatsen på en absorberande torka vävnad för att ta bort extra vätska och lägg den i brunnen på holmeavfångningsplattan. Upprepa detta steg tills alla nätinsatser med näthinneslag placeras i holmefångstplattan som fyller bakgrundskorrigeringsbrunnarna och tomma brunnar med tomma nätinsatser. Använd två Graefe-tångar och tryck försiktigt och försiktigt på kanten på varje nätinsats och se till att dessa sätts in ordentligt längst ner på holmefångstplattan.Placera den laddade holmefångstplattan i en 37 grader Celsius inkubator i fem minuter för att värma upp och mata sedan ut verktygsplattan när kalibreringen är klar. Ersätt den med holmefångstplattan som innehåller näthinneslag och återuppta analysen som körs genom att klicka på knappen för lastcellsplattan. När körningen är klar matar du ut sensorpatronen och isfångstplattan som innehåller näthinneslag genom att klicka på utmatningsknappen och klickar sedan på den färdiga knappen så att data automatiskt sparas som en ASYR-fil och skärmen ändras automatiskt för att resultera.Mitokondriell stress analys som visar en OCR trace och glykolytisk hastighet analys som visar både OCR och ECAR spår utfördes med ny dissekerade en millimeter retinal stans skivor. I den mitokondriella stressanalysen injicerades Bam15 för att frikoppla proton gradient från mitokondriell ATP produktion, vilket resulterar i ökningen av OCR till maximal nivå. Rotenone och antimycin A injicerades för att hämma mitokondrierna andning vid komplexa en respektive komplexa tre, vilket resulterar i en minskning av OCR till den minimala nivån.Skillnaden mellan den maximala nivån av OCR och den sista mätningen av den basala OCR-nivån återspeglar mitokondriell reservkapacitet. I den glykolytiska hastighetsanalysen stänger injektionen av rotenon och antimycin A av mitokondriell andning och driver glykolys högre. Glykolysen tas i beslag genom att injicera 2-deoxy-d-glukos, som konkurrerar med glukos för hexokinasbindning, vilket gör att ECAR sjunker till den minimala nivån.Skillnaden mellan den maximala nivån av glyko ECAR i det sista måttet på glyko ECAR basal nivå återspeglar glykolys reservkapaciteten. För att producera tillförlitliga data är det viktigt att få god kvalitet på näthinnestansskivor och att begränsa den totala dissekeringstiden inom 1,5 timme. Efter experimentet kan man kvantifiera DNA från proteininnehållet i en näthinneskiva i en brunn och använda det för att normalisera sjöhästdata.Så detta protokoll användes för att studera utveckling, åldrande och sjukdom i näthinnan. Vävnad preferens eller tillit för olika bränslesubstrat som glukos eller fettsyror analyserades också.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfektion av Mouse retinal ganglion celler genom att In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Fastställande av mitokondriell membranpotential och reaktiva syreradikaler i Live Rat kortikala Neuroner

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionell hjärnavbildning med ultraljud Blod-hjärnbarriären störningar och mangan-förstärkt MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Dissektion, kultur, och analys av<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonala näthinnevävnad

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex vivo Beredningar av den Intakt vomeronasala orgel och tillbehör luktbulben

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Samtidig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionstest av två näthinnor efter<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex vivo optogenetic Dissekering av skräck kretsar i hjärnan skivor

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Fastställande av fotoreceptor Cell spektral känslighet i en insekt modell från<em&gt; In Vivo</em&gt; Intracellulära Record

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Förbereda färska Retinal skivor från vuxna zebrafiskar för Ex Vivo Imaging experiment

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

Kvantitativ autoradiografisk metod för bestämning av regionala frekvenser av cerebral protein syntes in vivo

Protein synthesis is required for development and maintenance of neuronal function and is involved in adaptive changes in the nervous system. Moreover, it ...