Name: time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer assays for measurement of endogenous phosphorylated stat proteins in human cells
Uploaded: 2021-09-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-resolved FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells at JoVE.com

1. Cellekultur
<ol><li>Vedligeholde celler i en befugtet 37 °C/5 % CO2-inkubator og dyrkning med enten DMEM suppleret med 10 % føtalt kvægserum (FBS) (HeLa- og A431-celler) eller RPMI suppleret med 15 % FBS (U266B1-celler). Kultur cellerne, indtil de når 70-80% sammenløb, prøv derefter dem og passage eller brug dem til assays. BEMÆRK: Kulturmedier indeholdt phenolrød. Der blev ikke udført serumsult for nogen cellelinje før udførelsen af assays.</li>
</ol>2. Stimulator elle...

<ol>
	<li>Villarino, A., Kanno, Y., O'Shea, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+consequences+of+Jak-STAT+signaling+in+the+immune+system.">Mechanisms and consequences of Jak-STAT signaling in the immune system.</a> Nature Immunology. 18 (4), 374-384 (2017).</li><li>Hammar&#233;n, H. M., Virtanen, A. T., Raivola, J., Silvennoinen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+JAKs+in+cytokine+signaling+and+its+breakdown+in+disease.">The regulation of JAKs in cytokine signaling and its breakdown in disease.</a> Cytokine. 118, 48-63 (2019).</li><li>O'Shea, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK-STAT+pathway:+impact+on+human+disease+and+therapeutic+intervention.">The JAK-STAT pathway: impact on human disease and therapeutic intervention.</a> Annual Review of Medicine. 66, 311-328 (2015).</li><li>Verhoeven, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+potential+and+controversy+of+targeting+STAT+family+members+in+cancer.">et al. potential and controversy of targeting STAT family members in cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 60 (2), 41-56 (2020).</li><li>Gilda, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+blotting+inaccuracies+with+unverified+antibodies:+need+for+a+Western+blotting+minimal+reporting+standard+(WBMRS).">et al. blotting inaccuracies with unverified antibodies: need for a Western blotting minimal reporting standard (WBMRS).</a> PLoS One. 10 (8), 0135392 (2015).</li><li>Binder, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+and+utilization+of+the+SureFire+phospho-STAT5+assay+for+a+cell-based+screening+campaign.">et al. and utilization of the SureFire phospho-STAT5 assay for a cell-based screening campaign.</a> Assay and Drug Development Technologies. 6 (1), 27-37 (2008).</li><li>Ayoub, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+time-resolved+fluorescence-based+assay+to+monitor+extracellular+signal-regulated+kinase+signaling+in+a+high-throughput+format.">Homogeneous time-resolved fluorescence-based assay to monitor extracellular signal-regulated kinase signaling in a high-throughput format.</a> Frontiers in Endocrinology. 5, 94 (2014).</li><li>Robers, M. B., Machleidt, T., Carlson, C. B., Bi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+LanthaScreen+and+beta-lactamase+reporter+assays+for+high-throughput+screening+of+JAK2+inhibitors.">Cellular LanthaScreen and beta-lactamase reporter assays for high-throughput screening of JAK2 inhibitors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 6 (4), 519-529 (2008).</li><li>Hwang, B., Engel, L., Goueli, S. A., Zegzouti, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+bioluminescent+immunoassay+to+probe+cellular+signaling+pathway+regulation.">Homogeneous bioluminescent immunoassay to probe cellular signaling pathway regulation.</a> Communications Biology. 3 (8), 1-12 (2020).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high-throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high-throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Osmond, R. I. W., Das, S., Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cell-based+assays+for+cytokine+receptor+signaling,+using+an+AlphaScreen+SureFire+assay+format.">Development of cell-based assays for cytokine receptor signaling, using an AlphaScreen SureFire assay format.</a> Analytical Biochemistry. 403 (1-2), 94-101 (2010).</li><li>Haan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jak1+has+a+dominant+role+over+Jak3+in+signal+transduction+through+&#947;c-containing+cytokine+receptors.">Jak1 has a dominant role over Jak3 in signal transduction through &#947;c-containing cytokine receptors.</a> Chemistry &amp; Biology. 18 (3), 314-323 (2011).</li><li>Kim, Y., Apetri, M., Luo, B., Settleman, J. E., Anderson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+tyrosine+kinase+inhibitors+on+normal+and+oncogenic+EGFR+signaling+and+downstream+effectors.">Differential effects of tyrosine kinase inhibitors on normal and oncogenic EGFR signaling and downstream effectors.</a> Molecular Cancer Research. 13 (4), 765-774 (2015).</li><li>Qian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+homogeneous+cell-based+kinase+assays+for+JAK2+V617F:+SureFire+pSTAT5+and+GeneBLAzer+fluorescence+resonance+energy+transfer+assays.">Comparison of two homogeneous cell-based kinase assays for JAK2 V617F: SureFire pSTAT5 and GeneBLAzer fluorescence resonance energy transfer assays.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 10 (2), 212-217 (2012).</li><li>Iversen, P. W., et al., Markossian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTS+assay+validation.">HTS assay validation.</a> Assay Guidance Manual. , (2012).</li><li>Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+cell+culture+optimization+enhances+experimental+reproducibility+in+cancer+cells.">Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells.</a> Scientific Reports. 8, 3029 (2018).</li></ol>

Sammenlignet med konventionelle metoder til phosphoproteinanalyse såsom western blotting og ELISA-baserede metoder er arbejdsgangen for et THUNDER TR-FRET-cellulært assay enkel og hurtig, bruger en prøve med lavt volumen (15 μL), er designet til HTS i et 384-brøndsformat og er meget modtagelig for automatisering. Analyseprotokollen er fleksibel og kan let tilpasses til både mellem- og højkapacitetsapplikationer. Assays kan køres ved hjælp af enten en to-plade overførselsprotokol eller en en-384-brønds pladepro...

JAK / STAT-signalvejen spiller en nøglerolle i formidlelsen af cellulære reaktioner på forskellige cytokiner, interferoner, vækstfaktorer og relaterede molekyler1,2. Bindingen af disse ligander til specifikke celleoverfladereceptorer resulterer i aktivering af DYK'er, som igen aktiverer STAT-proteiner ved fosforylering af specifikke tyrosinrester. STAT fosforylering resulterer i deres dimerisering og translokation i kernen, hvor de udøver deres virkning på transkriptionen af regulerede målgener. STAT-familien består af syv medlemmer: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b og STAT6. Medlemmerne spiller en kompleks og væsentlig rolle i reguleringen af fysiologiske celleprocesser, herunder spredning, differentiering, apoptose, angiogenese og immunsystemregulering. Den unormale aktivering af STAT-signalveje er impliceret i mange humane sygdomme, især kræft og immunrelaterede tilstande3,4. Derfor er evnen til at vurdere STAT-proteinfosforylering inden for det oprindelige cellesignalmiljø vigtig for både akademisk og lægemiddelopdagelsesforskning.
Til dato er de konventionelle metoder, der anvendes til måling af intracellulære fosforylerede proteinniveauer, herunder STET'er, antistofbaserede og omfatter western blotting, ELISA og phosphoflowcytometri. Disse heterogene metoder er arbejdskrævende, tidskrævende, fejlbehæftede, lave gennemstrømninger og ofte upålidelige (f.eks. Specificitetsproblemer) i tilfælde af vestlig blotting5. I modsætning hertil kræver homogene assays færre eksperimentelle trin, bruger mindre prøvevolumener og er modtagelige for HTS. Der er fem homogene cellebaserede immunassay platforme kommercielt tilgængelige, der kan bruges til kvantitativt at overvåge JAK-afhængig fosforylering af STAT'er i cellelysater: SureFire, HTRF, LANCE, LanthaScreen og Lumit. Hver af disse platforme har sine fordele og ulemper.
SureFire er baseret på selvlysende iltkanaliseringsteknologi, der bruger donor- og acceptorperler belagt til specifikt at fange et par antistoffer, hvoraf den ene er biotinyleret. I nærvær af fosforyleret protein bringer de to antistoffer donor- og acceptorperlerne i umiddelbar nærhed, hvilket muliggør dannelsen af et kemiluminescerende signal6. Selvom den er alsidig og følsom, er denne teknologi dyr, påvirkes af biotin i kulturmediet, er meget følsom over for omgivelsestemperatur og lys og kræver en særlig læser til detektion. HTRF og LANCE er begge baseret på TR-FRET-teknologi, der anvender selvlysende lanthanidionkomplekser med lang levetid (Europium- eller Terbiumchelater eller Europiumkryptat) som donormolekyler og langtrøde fluoroforer som acceptormolekyler7. Når to proteinspecifikke antistoffer mærket med enten donor- eller acceptormolekyler bringes i nærheden, finder FRET sted, hvilket forårsager en stigning i acceptorfluorfluorescens og et fald i donorfluorescens. Disse langlivede fluorescerende signaler kan måles på en tidsopløst og ratiometrisk måde for at reducere assayinterferens og øge datakvaliteten. Andre fordele ved TR-FRET er, at det ikke er lysfølsomt, tillader gentagne aflæsninger og udviser lang signalstabilitet. Mens TR-FRET er bredt implementeret i HTS på grund af dets alsidighed, følsomhed og høje robusthed, er alle kommercielle TR-FRET-baserede analyseplatforme dyre, hvilket forhindrer dets brede vedtagelse i akademiske og små industrielle laboratorier. LanthaScreen-analysen bruger også en TR-FRET-baseret udlæsning, men er afhængig af en konstrueret U2OS-cellelinje, der stabilt udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP)-STAT1-fusionsprotein kombineret med et terbiummærket phospho-specifikt STAT1-antistof8. Ud over at være begrænset med hensyn til valg af signalproteiner kræver denne metode køb af dyre transfekterede cellelinjer, hvilket reducerer dets anvendelighed og øger muligheden for eksperimentelle artefakter. Lumit er en generisk bioluminescerende immunassay platform, der udnytter sekundære antistoffer (anti-mus og anti-kanin) kemisk mærket med de små og store NanoBit underenheder af NanoLuc Luciferase9. Bindingen af to primære antistoffer til målproteinet bringer de sekundære antistoffer i nærheden for at danne et aktivt enzym, der genererer et luminescenssignal. Mens luminescens generelt er en følsom og robust aflæsning, begrænser kravet om primære antistoffer, der er rejst i to forskellige arter, valgene til analysedesign. Derudover kan brugen af sekundære antistoffer i komplekse prøvematrixer være tilbøjelig til assayinterferens.
Der er således stadig behov for en pålidelig, hurtig, men alligevel overkommelig cellebaseret analyseplatform til måling af individuelle fosforylerede og samlede STAT-proteiner på en måde, der er kompatibel med HTS. For at imødekomme dette behov blev der udviklet en ny cellebaseret immunassayplatform med høj kapacitet baseret på en forbedret TR-FRET-teknologi (THUNDER) og designet til at muliggøre enkel, følsom, robust og omkostningseffektiv måling af endogent udtrykte intracellulære proteiner (fosforyleret eller total) i cellelysater. Fordelene ved denne teknologi stammer fra kombinationen af et donor / acceptor FRET-par, der udviser enestående spektral kompatibilitet og TR-FRET-signal, strengt validerede antistoffer og optimerede lysisbuffere. Disse assays er formateret som sandwichimmunassays og bruger en ligetil tretrins arbejdsgang (figur 1). Celler behandles først for at modulere proteinphosphorylering og lyseres derefter med den specifikke lysisbuffer, der er tilvejebragt i sættet. Det målphosphorylerede eller totale STAT-protein i cellelysatet detekteres i et enkelt reagenstilsætnings- og inkubationstrin med et par fluoroformærkede antistoffer, der genkender forskellige epitoper på målproteinet (figur 2). Et antistof er mærket med en Europiumchelatdonor (Eu-Ab1), mens det andet antistof er mærket med en langt rød acceptorfluorofor (FR-Ab2). De to mærkede antistoffer binder sig til proteinet i opløsning, hvilket bringer de to etiketter i nærheden. Excitation af donoren Europiumchelat ved 320 eller 340 nm udløser en FRET til acceptoren, som udsender et langlivet TR-FRET-signal ved 665 nm proportionalt med koncentrationen af målprotein (fosforyleret eller total) i cellelysat.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62915/62915fig01.jpg"> Figur 1: TR-FRET assay arbejdsgang. Arbejdsgangen består af tre trin: cellebehandling, cellelyse og proteindetektion ved hjælp af TR-FRET. I to-plade-assayprotokollen overføres lysater til en hvid 384-brønds detektionsplade, mens i en-pladeprotokollen udføres alle trin i den samme hvide 384-brønds detektionsplade (alt-i-en-brønd-protokol). Uanset hvilken analyseprotokol der anvendes, udføres proteindetektion i samme samlede volumen (20 μL pr. Brønd). Forkortelse: TR-FRET = tidsopløst Förster resonans energioverførsel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62915/62915fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62915/62915fig02.jpg"> Figur 2: TR-FRET sandwich immunoassay princip. Det ene antistof er mærket med Europiumchelatdonoren (Eu-Ab1) og det andet med den langtrøde lille fluoroforacceptor (FR-Ab2). De to mærkede antistoffer binder specifikt til forskellige epitoper på målproteinet (fosforyleret eller totalt) i cellelysatet, hvilket bringer de to fluoroforer i nærheden. Excitation af donoren Europiumchelat ved 320 eller 340 nm udløser en FRET fra donoren til acceptormolekylerne, som igen udsender et signal ved 665 nm. Dette signal er proportionalt med koncentrationen af protein i cellelysatet. I mangel af det specifikke målprotein er donor- og acceptorfluoroforerne for fjernt fra hinanden til, at FRET kan forekomme. Forkortelser: FRET = Förster resonans energioverførsel; TR-FRET = tidsopløst FRET; Ab = antistof; FR = langt rødt; Eu - Europium chelat; P = fosforylering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62915/62915fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Her tilvejebringes detaljerede protokoller til måling i et 384-brøndsformat af de intracellulære niveauer af fosforyleret STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694 / Y699) og STAT6 (Y641) sammen med total STAT1, STAT3, STAT5 og STAT6 i cellelysater fra klæbende eller suspensionsceller ved hjælp af THUNDER TR-FRET-platformen. Disse protokoller definerer trin til cellebehandling, lysis og TR-FRET-baseret målproteindetektion ved hjælp af enten en to-pladeoverførselsprotokol eller en en-plade alt-i-en-brønd-protokol. Disse cellebaserede assays anvendes til bestemmelse af den farmakologiske profil af kendte aktivatorer og hæmmere af JAK/STAT-vejen. Robustheden og egnetheden af udvalgte assays for HTS er påvist. Endelig diskuteres nøgleeksperimenter til analyseoptimering sammen med anbefalinger til fejlfinding af assay.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well microplate, clear, flat bottom, polystyrene, tissue culture-treated, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td>This is the plate for culturing cells when using the two-plate assay protocol. Other cell culture 96-well plates can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well microplate, white, low-volume</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6007290</td>
			<td>This is the plate for TR-FRET detection when using the two- or one-plate assay protocols. Other low-volume, white 384-well plates can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A431 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive microplate seal</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6050185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D159-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL&#160;</td>
			<td>THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision Xcite Multilabel plate reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2104-0020A</td>
			<td>The assays can be performed on a variety of plate readers equipped with the TR-FRET option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlotinib hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CDS022564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tissue culture treated flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-680-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>098-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JAK Inhibitor 1</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>15146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital plate shaker</td>
			<td>Many options available</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IFN&#945;2b</td>
			<td>ProSpec</td>
			<td>CYT-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>204-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>350-007-CL</td>
			<td>THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT1PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT3PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) + Total STAT4 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT4PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Total STAT5 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT5PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Total STAT6 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT6PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA 0.05%</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>325-542-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U266B1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use Milli-Q grade water (18 M&#937;.cm) to dilute Lysis Buffer and Detection Buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer assays for measurement of endogenous phosphorylated stat proteins in human cells

Janus kinase (JAK) / signaltransducer og aktivator af transkription (STAT) signalvejen spiller en afgørende rolle i formidlelsen af cellulære reaktioner på cytokiner og vækstfaktorer. STAT-proteiner aktiveres af tyrosinphosphorylering medieret hovedsageligt af JAB'er. Den unormale aktivering af STAT-signalveje er impliceret i mange menneskelige sygdomme, især kræft og immunrelaterede tilstande. Derfor er evnen til at overvåge STAT-proteinfosforylering inden for det oprindelige cellesignalmiljø vigtig for både akademisk og lægemiddelopdagelsesforskning. De traditionelle assayformater, der er tilgængelige for at kvantificere fosforylerede STAT-proteiner, omfatter western blotting og det enzymbundne immunosorbentassay (ELISA). Disse heterogene metoder er arbejdskrævende, lav gennemstrømning og ofte ikke pålidelige (specifikke) i tilfælde af vestlig blotting. Homogene (no-wash) metoder er tilgængelige, men forbliver dyre. 
Her leveres detaljerede protokoller til følsom, robust og omkostningseffektiv måling i et 384-brøndsformat af endogene niveauer af fosforyleret STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694 / Y699) og STAT6 (Y641) i cellelysater fra klæbende eller suspensionsceller ved hjælp af den nye THUNDER tidsopløste Förster resonansenergioverførsel (TR-FRET) platform. Arbejdsgangen for det cellulære assay er enkel, hurtig og designet til screening med høj kapacitet (HTS). Assayprotokollen er fleksibel, bruger en prøve med lavt volumen (15 μL), kræver kun et reagenstilsætningstrin og kan tilpasses applikationer med lav gennemstrømning og høj gennemstrømning. Hvert phospho-STAT sandwich immunassay valideres under optimerede betingelser med kendte agonister og hæmmere og genererer de forventede farmakologi- og Z'-faktorværdier. Da TR-FRET-assays er ratiometriske og ikke kræver vasketrin, giver de meget bedre reproducerbarhed end traditionelle tilgange. Sammen giver denne række assays nye omkostningseffektive værktøjer til en mere omfattende analyse af specifikke fosforylerede STAT-proteiner efter cellebehandling og screening og karakterisering af specifikke og selektive modulatorer af JAK / STAT-signalvejen.

Hvert THUNDER TR-FRET-assay blev farmakologisk valideret ved at behandle klæbende (HeLa eller A431) eller suspensionsceller (U266B1) med JAK/STAT-vejspecifikke aktivatorer eller hæmmere og derefter måle niveauerne af specifikke phosphorylerede og totale STAT'er, hvor det var relevant. Assays blev udført i 384-brøndsformat ved hjælp af to-pladeoverførselsprotokollen og forudoptimerede analysebetingelser. Figur 3, figur 4, figur 5</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Time-resolved FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells at JoVE.com

Time-resolved FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

Tidsopløste Förster-resonansenergioverførselscellebaserede assayprotokoller er beskrevet for den enkle, specifikke, følsomme og robuste kvantificering af endogene phosphorylerede signaltransducer og aktivator af transkription (STAT) 1/3/4/5/6 proteiner i cellelysater i et 384-brøndsformat.

Tidsopløste Förster Resonans Energy Transfer Assays til måling af endogene fosforylerede STAT-proteiner i humane celler

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to ...

De TR-FRET-baserede assays giver nye omkostningseffektive værktøjer til screening og farmakologisk karakterisering af specifikke og selektive modulatorer af JAK / STAT-signalvejene. Denne teknik er meget lettere, hurtig, reproducerbar og robust end konventionelle metoder som Western blot og ELISA. Der kræves ingen vasketrin, og reagenser tilsættes i et enkelt trin.Denne immunoassay platform kan let anvendes på andre celle signalproteiner, forudsat at specifikke antistoffer er tilgængelige. For at designe reproducerbare assays skal du bruge god cellekulturpraksis og etablere standardprocedurer. Derudover skal du omhyggeligt optimere cellekulturen og behandlingsbetingelserne.Genevieve Chatel, en videnskabsmand fra vores laboratorium, demonstrerer proceduren. Til at begynde med, kultur HeLa og A431 celler i en befugtet 37 grader Celsius og 5% kuldioxid inkubator ved hjælp af DMEM suppleret med 10% FBS. Når cellerne når 70 til 80% sammenløb, trypsinisere dem og enten passere eller bruge dem til assays.For at udføre analysen skal du dispensere 50 mikroliter celler ved den forudoptimerede densitet i en 96-brønds vævskulturbehandlet plade i det relevante kulturmedium og derefter inkubere dem natten over i en 37 grader Celsius og 5% kuldioxidinkubator. Den følgende dag fremstilles mellemliggende dobbelte og firedobbelte fortyndingsserier af testforbindelserne ved seriel fortynding af forbindelsen i et serumfrit medium på tværs af 12 brønde af en polypropylenplade med 96 brønde. Til cellestimulering tilsættes 50 mikroliter serumfrit medium indeholdende simulatoren i en 2X koncentration og inkuberes cellerne til den foroptimerede tid ved enten stuetemperatur eller 37 grader.Til cellehæmning tilsættes 25 mikroliter serumfrit medium indeholdende inhibitoren i en 4X koncentration og inkuberes cellerne i den foroptimerede tid ved enten stuetemperatur eller 37 grader, tilsæt derefter 25 mikroliter serumfrit medium indeholdende stimulatoren i en 4X koncentration og inkuber i den forudoptimerede tid. For at lyse cellerne skal du derefter forberede den 1X supplerede lysisbuffer og tilsætte fosfatasehæmmercocktail til den. Efter omhyggelig fjernelse og kassation af cellekulturmediet tilsættes straks 50 mikroliter af den tilberedte 1X supplerede lysisbuffer og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur under omrystning med moderat omrøring.Til TR-FRET-detektion skal du forberede 4X-antistofdetektionsblandingen i 1X detektionsbuffer og derefter forberede EUAB1- og FRAB2-antistofopløsningerne samt EUAB3- og FRAB4-antistofopløsningerne i 1X-detektionsbuffer. Til sidst blandes forfortyndet EUAB1 med forfortyndet FRAB2 til påvisning af phosphoprotein og forfortyndet EUAB3 og forfortyndet FRAB4 til påvisning af totalt protein. Derefter pipetter forsigtigt 15 mikroliter af cellelysatet fra 96-brønds kulturpladen til en brønd af en hvid lavvolumen 384-brønds mikroplade.Derefter tilsættes 15 mikroliter af det positive kontrollysat og 15 mikroliter 1X lysisbuffer som en negativ kontrol for at adskille assaybrønde. Til brønde, der indeholder 15 mikroliter lysatet, tilsættes fem mikroliter af den tilsvarende 4X-antistofdetektionsblanding for at detektere phosphoproteinet eller totalproteinet. Efter at have dækket pladen med en pladeforsegler, skal du inkubere den ved stuetemperatur i en time til natten over afhængigt af analysesættet.Når inkubationen er afsluttet, skal du fjerne klæbepladeforsegleren og læse pladen på en TR-FRET-kompatibel mikropladelæser. Resultater af TR-FRET-assays til påvisning og kvantificering af phospho-STAT1 med total STAT1 og phospho-STAT4 i U266B1-celler sammen med phospho-STAT5 med total STAT5 i A431-celler er repræsenteret ved hjælp af koncentrationsresponskurver. Tilsvarende er TR-FRET-assays til påvisning og kvantificering af phospho-STAT3 og total STAT3 og phospho-STAT6 og total STAT6 i HeLa-celler repræsenteret ved hjælp af koncentrationsresponskurver.Samlet set viste alle assays robuste TR-FRET-signaler, brede dynamiske områder, lav inter-well-koefficientvariation og acceptable signal-til-baggrund-forhold. Behandling af celler med JAK-aktivatorer, interferon alfa-2B og IL-4 og EGF viste den forventede koncentrationsafhængige stigning i STAT-phosphorylering ved specifikke tyrosinrester, mens de tilsvarende samlede STAT-proteiner forblev stabile. Både JAK-hæmmer og erlotinib hæmmede de tilsvarende phospho-STAT-niveauer på en koncentrationsafhængig måde.Resultater af phospho-STAT4-stimulering ved interferon alfa-2B i en suspensionscellelinje eller phospho-STAT6-stimulering med IL-4 i en adhærenscellelinje ved anvendelse af en-pladeprotokollen var i overensstemmelse med dem, der blev opnået ved anvendelse af to-pladeprotokollen, hvilket viste en vellykket tilpasningsevne af en to-plade overførselsprotokol til en en-plade alt-i-en brøndprotokol. Resultaterne af variabilitetsundersøgelsen inden for pladen for phospho-STAT1-assayet ved anvendelse af en suspensionscellelinje og phospho-STAT3-assayet ved hjælp af en adhærenscellelinje viser robustheden af disse phospho-STAT-assays til HTS-applikationer. Det er vigtigt at supplere lysisbufferen med fosfatasehæmmercocktailen for at forhindre dephosphorylering af de fosforylerede proteiner fra aktiv phosphatase, der er til stede i hele celleekstraktet.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for Identifikation af flere fosforyleringer af Intrinsically Disordered Proteiner

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation og respiratoriske målinger af mitokondrier fra Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Udnytte en omfattende Immunoprecipitation berigelse System for at identificere en endogen posttranslationel modifikation profil for Target proteiner

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolering af fysiologisk aktive tylakoiderne og deres anvendelse i energiafhængige Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruger i Vitro fluorescens resonans energioverførsel at studere dynamikken i proteinkomplekser på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Ekspression, rensning, krystallisering og enzym assays af Fumarylacetoacetat hydrolase-domæne-holdige proteiner

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tværgående 2000 af ældre ris(Oryza sativa L.) Kerner til scanning elektronmikroskopi imaging ved hjælp af pipette tips som immobilisering Support

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Fjernelse og udskiftning af endogene ligands fra Lipid-Bound Proteiner og allergener

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Hurtig gitterforberedelse til tidstilslutt kryo-elektronmikroskopi

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...