Name: time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer assays for measurement of endogenous phosphorylated stat proteins in human cells
Uploaded: 2021-09-09T14:00:00
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1. Culture cellulaire
<ol><li>Maintenir les cellules dans un incubateur et une culture de CO2 humidifié à 37 °C/5 % avec du DMEM complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) (cellules HeLa et A431) ou rpmI complété par 15 % de FBS (cellules U266B1). Cultivez les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent 70 à 80% de confluence, puis essayez-les et passez-les ou utilisez-les pour les essais. REMARQUE: Les milieux de culture contenaient du rouge phénolique. Aucune famine sérique n’a été ef...

<ol>
	<li>Villarino, A., Kanno, Y., O'Shea, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+consequences+of+Jak-STAT+signaling+in+the+immune+system.">Mechanisms and consequences of Jak-STAT signaling in the immune system.</a> Nature Immunology. 18 (4), 374-384 (2017).</li><li>Hammar&#233;n, H. M., Virtanen, A. T., Raivola, J., Silvennoinen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+JAKs+in+cytokine+signaling+and+its+breakdown+in+disease.">The regulation of JAKs in cytokine signaling and its breakdown in disease.</a> Cytokine. 118, 48-63 (2019).</li><li>O'Shea, J. 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W., et al., Markossian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTS+assay+validation.">HTS assay validation.</a> Assay Guidance Manual. , (2012).</li><li>Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+cell+culture+optimization+enhances+experimental+reproducibility+in+cancer+cells.">Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells.</a> Scientific Reports. 8, 3029 (2018).</li></ol>

Comparé aux méthodes conventionnelles d’analyse des phosphoprotéines telles que le western blotting et les méthodes BASÉES SUR ELISA, le flux de travail pour un test cellulaire THUNDER TR-FRET est simple et rapide, utilise un échantillon à faible volume (15 μL), est conçu pour HTS dans un format 384 puits et se prête parfaitement à l’automatisation. Le protocole d’essai est flexible et peut facilement être adapté aux applications à débit moyen et élevé. Les tests peuvent être exécutés à l’aid...

La voie de signalisation JAK/STAT joue un rôle clé dans la médiation des réponses cellulaires à diverses cytokines, interférons, facteurs de croissance et molécules apparentées1,2. La liaison de ces ligands à des récepteurs spécifiques de la surface cellulaire entraîne l’activation des JAG, qui à leur tour activent les protéines STAT par phosphorylation de résidus de tyrosine spécifiques. La phosphorylation STAT entraîne leur dimérisation et leur translocation dans le noyau, où ils exercent leur effet sur la transcription des gènes cibles régulés. La famille STAT se compose de sept membres : STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b et STAT6. Les membres jouent un rôle complexe et essentiel dans la régulation des processus cellulaires physiologiques, y compris la prolifération, la différenciation, l’apoptose, l’angiogenèse et la régulation du système immunitaire. L’activation anormale des voies de signalisation STAT est impliquée dans de nombreuses maladies humaines, en particulier le cancer et les affections liées au système immunitaire3,4. Par conséquent, la capacité d’évaluer la phosphorylation des protéines STAT dans l’environnement de signalisation des cellules natives est importante pour la recherche universitaire et la découverte de médicaments.
À ce jour, les méthodes conventionnelles utilisées pour mesurer les niveaux de protéines phosphorylées intracellulaires, y compris les STAT, sont à base d’anticorps et comprennent le western blotting, l’ELISA et la cytométrie phosphoflow. Ces méthodes hétérogènes sont exigeantes en main-d’œuvre, chronophages, sujettes aux erreurs, à faible débit et souvent peu fiables (par exemple, des problèmes de spécificité) dans le cas du transfert Western5. En revanche, les essais homogènes nécessitent moins d’étapes expérimentales, utilisent des volumes d’échantillons plus petits et se prêtent à HTS. Il existe cinq plates-formes d’immunodosage cellulaires homogènes disponibles dans le commerce qui peuvent être utilisées pour surveiller quantitativement la phosphorylation dépendante de JAK des STAT dans les lysats cellulaires : SureFire, HTRF, LANCE, LanthaScreen et Lumit. Chacune de ces plateformes a ses avantages et ses inconvénients.
SureFire est basé sur la technologie de canalisation de l’oxygène luminescent, qui utilise des billes de donneur et d’accepteur enduites pour capturer spécifiquement une paire d’anticorps, dont l’un est biotinylé. En présence de protéines phosphorylées, les deux anticorps rapprochent les perles donneuses et acceptatrices, permettant la génération d’un signal chimiluminescent6. Bien que polyvalente et sensible, cette technologie est coûteuse, est affectée par la biotine dans le milieu de culture, est très sensible à la température ambiante et à la lumière, et nécessite un lecteur spécial pour la détection. HTRF et LANCE sont tous deux basés sur la technologie TR-FRET qui utilise des complexes d’ions lanthanides luminescents à longue durée de vie (chélates d’europium ou de terbium, ou cryptate d’europium) comme molécules donneuses et des fluorophores rouge lointain comme molécules acceptrices7. Lorsque deux anticorps spécifiques à une protéine marqués avec des molécules donneuses ou acceptrices sont rapprochés, fret a lieu, provoquant une augmentation de la fluorescence de l’accepteur et une diminution de la fluorescence du donneur. Ces signaux fluorescents à longue durée de vie peuvent être mesurés de manière à résolution temporelle et ratiométrique afin de réduire les interférences de dosage et d’augmenter la qualité des données. D’autres avantages du TR-FRET sont qu’il n’est pas sensible à la lumière, permet des lectures répétées et présente une longue stabilité du signal. Alors que TR-FRET est largement mis en œuvre dans HTS en raison de sa polyvalence, de sa sensibilité et de sa grande robustesse, toutes les plates-formes de dosage commerciales basées sur TR-FRET sont coûteuses, empêchant ainsi son large adoption dans les laboratoires universitaires et les petits laboratoires industriels. Le test LanthaScreen utilise également une lecture basée sur TR-FRET, mais repose sur une lignée cellulaire U2OS conçue qui exprime de manière stable la protéine fluorescente verte (GFP)-STAT1 combinée à un anticorps STAT1 spécifique au phospho marqué au terbium8. En plus d’être limitée en termes de choix de protéines de signalisation, cette méthode nécessite l’achat de lignées cellulaires transfectées coûteuses, réduisant son applicabilité et augmentant la possibilité d’artefacts expérimentaux. Lumit est une plateforme générique d’immunodosage bioluminescent qui utilise des anticorps secondaires (anti-souris et anti-lapin) marqués chimiquement avec les petites et grandes sous-unités NanoBit de NanoLuc Luciferase9. La liaison de deux anticorps primaires à la protéine cible rapproche les anticorps secondaires pour former une enzyme active qui génère un signal de luminescence. Bien que la luminescence soit généralement une lecture sensible et robuste, l’exigence d’anticorps primaires soulevés chez deux espèces différentes limite les choix pour la conception du test. En outre, l’utilisation d’anticorps secondaires dans des matrices d’échantillons complexes peut être sujette à des interférences de dosage.
Ainsi, il existe toujours un besoin d’une plate-forme de dosage cellulaire fiable, rapide mais abordable pour mesurer les protéines STAT phosphorylées et totales individuelles d’une manière compatible avec HTS. Pour répondre à ce besoin, une nouvelle plateforme d’immunoessais cellulaires à haut débit a été développée sur la base d’une technologie TR-FRET améliorée (THUNDER) et conçue pour permettre une mesure simple, sensible, robuste et rentable des protéines intracellulaires exprimées de manière endogène (phosphorylées ou totales) dans les lysats cellulaires. Les avantages de cette technologie découlent de la combinaison d’une paire FRET donneur/accepteur présentant une compatibilité spectrale exceptionnelle et un signal TR-FRET, d’anticorps rigoureusement validés et de tampons de lyse optimisés. Ces tests sont formatés en tests immunologiques sandwich et utilisent un flux de travail simple en trois étapes (Figure 1). Les cellules sont d’abord traitées pour moduler la phosphorylation des protéines, puis lysées avec le tampon de lyse spécifique fourni dans le kit. La protéine STAT phosphorylée ou totale cible dans le lysat cellulaire est détectée en une seule étape d’ajout et d’incubation de réactif avec une paire d’anticorps marqués au fluorophore qui reconnaissent des épitopes distincts sur la protéine cible (Figure 2). Un anticorps est marqué avec un donneur de chélate d’europium (Eu-Ab1), tandis que le second anticorps est marqué avec un fluorophore accepteur rouge lointain (FR-Ab2). Les deux anticorps marqués se lient à la protéine en solution, ce qui rapproche les deux étiquettes. L’excitation du chélate d’europium donneur à 320 ou 340 nm déclenche un FRET vers l’accepteur, qui émet un signal TR-FRET à longue durée de vie à 665 nm proportionnel à la concentration de protéine cible (phosphorylée ou totale) dans le lysat cellulaire.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62915/62915fig01.jpg"> Figure 1 : Flux de travail du test TR-FRET. Le flux de travail se compose de trois étapes : le traitement cellulaire, la lyse cellulaire et la détection des protéines à l’aide de TR-FRET. Dans le protocole d’essai à deux plaques, les lysats sont transférés sur une plaque de détection blanche de 384 puits, tandis que dans le protocole à une plaque, toutes les étapes sont effectuées dans la même plaque de détection blanche de 384 puits (protocole tout-en-un). Quel que soit le protocole de dosage utilisé, la détection des protéines est effectuée dans le même volume total (20 μL par puits). Abréviation : TR-FRET = transfert d’énergie de résonance de Förster résolu dans le temps. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62915/62915fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62915/62915fig02.jpg"> Figure 2 : Principe du test immunologique en sandwich TR-FRET. Un anticorps est marqué avec le donneur de chélate d’Europium (Eu-Ab1) et le second avec le petit accepteur de fluorophore rouge lointain (FR-Ab2). Les deux anticorps marqués se lient spécifiquement à des épitopes distincts sur la protéine cible (phosphorylée ou totale) dans le lysat cellulaire, amenant les deux fluorophores à proximité. L’excitation du chélate d’europium donneur à 320 ou 340 nm déclenche une FRET du donneur vers les molécules acceptrices, qui à leur tour émettent un signal à 665 nm. Ce signal est proportionnel à la concentration de protéines dans le lysat cellulaire. En l’absence de la protéine cible spécifique, les fluorophores donneurs et accepteurs sont trop éloignés l’un de l’autre pour que fret se produise. Abréviations : FRET = transfert d’énergie de résonance de Förster ; TR-FRET = FRET à résolution temporelle; Ab = anticorps; FR = rouge lointain; Eu - chélate d’europium; P = phosphorylation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62915/62915fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Ici, des protocoles détaillés sont fournis pour mesurer, dans un format de puits 384, les niveaux intracellulaires de STAT1 phosphorylé (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) et STAT6 (Y641), ainsi que les totals STAT1, STAT3, STAT5 et STAT6, dans les lysats cellulaires des cellules adhérentes ou en suspension à l’aide de la plate-forme THUNDER TR-FRET. Ces protocoles définissent les étapes du traitement cellulaire, de la lyse et de la détection des protéines cibles basée sur TR-FRET à l’aide d’un protocole de transfert à deux plaques ou d’un protocole tout-en-un à une plaque. Ces tests cellulaires sont appliqués pour déterminer le profil pharmacologique des activateurs et inhibiteurs connus de la voie JAK/STAT. La robustesse et la pertinence de certains tests pour HTS sont démontrées. Enfin, des expériences clés pour l’optimisation des tests sont discutées, ainsi que des recommandations pour le dépannage des tests.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well microplate, clear, flat bottom, polystyrene, tissue culture-treated, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td>This is the plate for culturing cells when using the two-plate assay protocol. Other cell culture 96-well plates can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well microplate, white, low-volume</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6007290</td>
			<td>This is the plate for TR-FRET detection when using the two- or one-plate assay protocols. Other low-volume, white 384-well plates can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A431 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive microplate seal</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6050185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D159-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL&#160;</td>
			<td>THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision Xcite Multilabel plate reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2104-0020A</td>
			<td>The assays can be performed on a variety of plate readers equipped with the TR-FRET option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlotinib hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CDS022564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tissue culture treated flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-680-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>098-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JAK Inhibitor 1</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>15146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital plate shaker</td>
			<td>Many options available</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IFN&#945;2b</td>
			<td>ProSpec</td>
			<td>CYT-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>204-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>350-007-CL</td>
			<td>THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT1PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT3PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) + Total STAT4 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT4PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Total STAT5 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT5PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Total STAT6 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit</td>
			<td>BioAuxilium Research</td>
			<td>KIT-STAT6PT-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA 0.05%</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>325-542-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U266B1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Use Milli-Q grade water (18 M&#937;.cm) to dilute Lysis Buffer and Detection Buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer assays for measurement of endogenous phosphorylated stat proteins in human cells

La voie de signalisation Janus kinase (JAK)/transducteur de signal et activateur de transcription (STAT) joue un rôle crucial dans la médiation des réponses cellulaires aux cytokines et aux facteurs de croissance. Les protéines STAT sont activées par la phosphorylation de la tyrosine médiée principalement par les JAG. L’activation anormale des voies de signalisation STAT est impliquée dans de nombreuses maladies humaines, en particulier le cancer et les affections liées au système immunitaire. Par conséquent, la capacité de surveiller la phosphorylation des protéines STAT dans l’environnement de signalisation des cellules natives est importante pour la recherche universitaire et la découverte de médicaments. Les formats de dosage traditionnels disponibles pour quantifier les protéines STAT phosphorylées comprennent le transfert western et le test immuno-enzymatique (ELISA). Ces méthodes hétérogènes sont exigeantes en main-d’œuvre, à faible débit et souvent peu fiables (spécifiques) dans le cas du Western Blotting. Des méthodes homogènes (sans lavage) sont disponibles mais restent coûteuses. 
Ici, des protocoles détaillés sont fournis pour la mesure sensible, robuste et rentable dans un format de 384 puits des niveaux endogènes de STAT1 phosphorylés (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694 / Y699) et STAT6 (Y641) phosphorylés dans les lysats cellulaires de cellules adhérentes ou en suspension à l’aide de la nouvelle plate-forme de transfert d’énergie de résonance Förster à résolution temporelle THUNDER (TR-FRET). Le flux de travail pour le test cellulaire est simple, rapide et conçu pour le criblage à haut débit (HTS). Le protocole d’essai est flexible, utilise un échantillon à faible volume (15 μL), ne nécessite qu’une seule étape d’ajout de réactif et peut être adapté aux applications à faible débit et à haut débit. Chaque immunodosage sandwich phospho-STAT est validé dans des conditions optimisées avec des agonistes et des inhibiteurs connus et génère les valeurs attendues de pharmacologie et de facteur Z. Comme les tests TR-FRET sont ratiométriques et ne nécessitent aucune étape de lavage, ils offrent une bien meilleure reproductibilité que les approches traditionnelles. Ensemble, cette série de tests fournit de nouveaux outils rentables pour une analyse plus complète de protéines STAT phosphorylées spécifiques après un traitement cellulaire et le criblage et la caractérisation de modulateurs spécifiques et sélectifs de la voie de signalisation JAK/STAT.

Chaque test THUNDER TR-FRET a été validé pharmacologiquement en traitant des cellules adhérentes (HeLa ou A431) ou en suspension (U266B1) avec des activateurs ou des inhibiteurs spécifiques à la voie JAK/STAT, puis en mesurant les niveaux de TAG phosphorylés et totaux spécifiques, le cas échéant. Les essais ont été effectués en format 384 puits en utilisant le protocole de transfert à deux plaques et des conditions de dosage pré-optimisées. La figure 3, l...

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Time-resolved FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

Les protocoles de dosage basés sur les cellules de transfert d’énergie de résonance de Förster résolues dans le temps sont décrits pour la quantification simple, spécifique, sensible et robuste du transducteur de signal phosphorylé endogène et de l’activateur de la transcription (STAT) 1/3/4/5/6 dans les lysats cellulaires dans un format de 384 puits.

Tests de transfert d’énergie par résonance de Förster à résolution temporelle pour la mesure des protéines STAT phosphorylées endogènes dans les cellules humaines

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to ...

Les tests basés sur TR-FRET fournissent de nouveaux outils rentables pour le dépistage et la caractérisation pharmacologique des modulateurs spécifiques et sélectifs des voies de signalisation JAK/STAT. Cette technique est beaucoup plus facile, rapide, reproductible et robuste que les méthodes conventionnelles comme le Western blot et ELISA. Aucune étape de lavage n’est requise et les réactifs sont ajoutés en une seule étape.Cette plateforme d’immunodosage peut être facilement appliquée à d’autres protéines de signalisation cellulaire à condition que des anticorps spécifiques soient disponibles. Pour concevoir des essais reproductibles, vous devez utiliser de bonnes pratiques de culture cellulaire et établir des procédures opérationnelles normalisées. De plus, vous devez optimiser soigneusement les conditions de culture cellulaire et de traitement.Geneviève Chatel, une scientifique de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, cultivez des cellules HeLa et A431 dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone en utilisant du DMEM complété par 10% FBS. Lorsque les cellules atteignent 70 à 80% de confluence, essayez-les et passez-les ou utilisez-les pour des essais.Pour effectuer le test, distribuer 50 microlitres de cellules à la densité pré-optimisée dans une plaque de culture tissulaire de 96 puits traitée dans le milieu de culture approprié, puis les incuber pendant la nuit dans un incubateur à 37 degrés Celsius et à 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, préparer les séries intermédiaires de dilution double et quadruple des composés d’essai en diluant en série le composé dans un milieu sans sérum sur 12 puits d’une plaque de polypropylène à 96 puits. Pour la stimulation cellulaire, ajoutez 50 microlitres de milieu sans sérum contenant le simulateur à une concentration de 2X et incubez les cellules pendant le temps pré-optimisé à température ambiante ou à 37 degrés.Pour l’inhibition cellulaire, ajoutez 25 microlitres de milieu sans sérum contenant l’inhibiteur à une concentration de 4X et incubez les cellules pendant le temps pré-optimisé à température ambiante ou à 37 degrés, puis ajoutez 25 microlitres de milieu sans sérum contenant le stimulateur à une concentration de 4X et incubez pendant le temps pré-optimisé. Ensuite, pour lyser les cellules, préparez le tampon de lyse supplémenté 1X et ajoutez-y un cocktail d’inhibiteurs de phosphatase. Après avoir soigneusement retiré et éliminé le milieu de culture cellulaire, ajouter immédiatement 50 microlitres du tampon de lyse 1X supplémenté préparé et incuber pendant 30 minutes à température ambiante sous agitation modérée.Pour la détection TR-FRET, préparez le mélange de détection d’anticorps 4X dans un tampon de détection 1X, puis préparez les solutions d’anticorps EUAB1 et FRAB2, ainsi que les solutions d’anticorps EUAB3 et FRAB4 dans un tampon de détection 1X. Enfin, mélanger EUAB1 pré-dilué avec FRAB2 pré-dilué pour la détection des phosphoprotéines et EUAB3 pré-dilué et FRAB4 pré-dilué pour la détection de protéines totales. Ensuite, pipetez soigneusement 15 microlitres de la cellule lysat de la plaque de culture de 96 puits vers un puits d’une microplaque blanche de 384 puits à faible volume.Ensuite, ajoutez 15 microlitres du lysat témoin positif et 15 microlitres de tampon de lyse 1X comme témoin négatif pour séparer les puits d’essai. Aux puits contenant 15 microlitres de lysat, ajoutez cinq microlitres du mélange de détection d’anticorps 4X correspondant pour détecter la phosphoprotéine ou la protéine totale. Après avoir recouvert la plaque d’un scellant à plaques, incubez-la à température ambiante pendant une heure à toute la nuit en fonction du kit d’essai.Une fois l’incubation terminée, retirez le scellant de plaque adhésive et lisez la plaque sur un lecteur de microplaques compatible TR-FRET. Les résultats des tests TR-FRET pour la détection et la quantification du phospho-STAT1 avec stat1 et phospho-STAT4 totaux dans les cellules U266B1 ainsi que du phospho-STAT5 avec stat5 total dans les cellules A431 sont représentés à l’aide de courbes de réponse de concentration. De même, les tests TR-FRET pour la détection et la quantification du phospho-STAT3 et du total STAT3 et du phospho-STAT6 et du total STAT6 dans les cellules HeLa sont représentés à l’aide de courbes de réponse de concentration.Dans l’ensemble, tous les essais ont montré des signaux TR-FRET robustes, de larges plages dynamiques, une faible variation du coefficient entre les puits et des rapports signal/arrière-plan acceptables. Le traitement des cellules avec des activateurs JAK, de l’interféron alfa-2B et de l’IL-4 et de l’EGF a montré l’augmentation prévue de la phosphorylation STAT dépendante de la concentration à des résidus de tyrosine spécifiques, tandis que les protéines STAT totales correspondantes sont restées stables. L’inhibiteur de JAK et l’erlotinib ont tous deux inhibé les niveaux correspondants de phospho-STAT d’une manière dépendante de la concentration.Les résultats de la stimulation phospho-STAT4 par l’interféron alfa-2B dans une lignée cellulaire en suspension ou de la stimulation phospho-STAT6 par l’IL-4 dans une lignée cellulaire d’adhérence à l’aide du protocole à une plaque étaient cohérents avec ceux obtenus à l’aide du protocole à deux plaques, montrant ainsi l’adaptabilité réussie d’un protocole de transfert à deux plaques à un protocole de puits tout-en-un à une plaque. Les résultats de l’étude de variabilité intra-plaque pour le test phospho-STAT1 utilisant une lignée cellulaire en suspension et le test phospho-STAT3 utilisant une lignée cellulaire d’adhérence démontrent la robustesse de ces tests phospho-STAT pour les applications HTS. Il est essentiel de compléter le tampon de lyse avec le cocktail d’inhibiteurs de phosphatase pour empêcher la déphosphorylation des protéines phosphorylées de la phosphatase active présente dans l’extrait de cellule entière.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Spectroscopie par résonance magnétique nucléaire pour l&#39;identification des phosphorylations multiples de protéines intrinsèquement désordonnées

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Recherche

Biochimie

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Résolue en temps d&#39;échange hydrogène Ionisation ElectroSpray-deuterium spectrométrie de masse pour l&#39;étude de la structure des protéines et dynamique

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Utilisant un système d’enrichissement immunoprécipitation complète afin d’identifier un profil endogène Modification post-traductionnelle des protéines cibles

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolement des thylakoïdes physiologiquement actives et leur utilisation dans des essais de Transport protéine dépendant de l’énergie

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

À l’aide au transfert d’énergie Fluorescence in Vitro pour étudier la dynamique des protéines Complexes à une échelle de temps de milliseconde

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expression, Purification, Cristallisation et Essais enzymatiques des protéines contenant du domaine de l'hydrolase fumarylacetoacetate

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

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Sectionnement transversal du riz mature (Oryza sativa L.) Noyaux pour l’imagerie par microscopie électronique à balayage à l’aide d’embouts de pipette comme support d’immobilisation

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Élimination et remplacement des ligands endogènes des protéines et allergènes liés aux lipides

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Préparation rapide de la grille pour la cryo-microscopie électronique à résolution temporelle

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

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Utilisation de l’amélioration de la fluorescence induite par les protéines résolues dans le temps pour identifier les conformations locales stables un α-synucléine à la fois

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...